Laporan Praktikum Hari, tanggal : Rabu, 23 Oktober 2019

Teknik Analisis Biokimia Waktu : 08.00 – 11.00 WIB

PJP : Rini Kurniasih, S.Si, M.Si
Asisten : Ika Yuni Astutik

PENENTUAN KADAR KLOROFIL

Kelompok 6

Alifiya Nurzannah G84170022

Asmaul Chusna G84170019
Lucia Alvionita G84170035
Callista Riselva Sasikirana G84170037
Nur Azizah G84170045
Pelangi Berliania G84170058
M Hadid Husada G84170064
M Rizki Athari G84170065
Hafizh Zahra G84170084

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 PENDAHULUAN

Klorofil adalah suatu pigmen yang memberi warna hijau pada tumbuhan hijau
yang terdapat pada kloroplas. Klorofil terdapat di semua tumbuhan hijau yang
berfotosintesis (Hendriyani dan Setiari 2009). Klorofil dapat menampung energi
cahaya yang diserap oleh pigmen cahaya melalui fotosintesis. Sifat fisika klorofil
yaitu menerima dan memantulkan sinar dengan menyerap sinar pada panjang
gelombang antara 400-700 nm, terutama sinar merah dan biru saat proses fotosintesis,
sedangkan sifat kimia klorofil dintaranya tidak larut dalam air, melainkan larut dalam
pelarut organik yang lebih polar, memiliki inti Mg yang dapat tergeser oleh 2 atom H
apabila dalam suasana asam sehingga membentuk suatu persenyawaan yang disebut
feofitin yang berwarna coklat (Arfandi et al. 2013).
Pigmen klorofil sangat berperan dalam proses fotosintesis karena mengubah
energi cahaya menjadi energi kimia. Selain berperan dalam fotosintesis, klorofil juga
memberikan manfaat secara langsung bagi kesehatan manusia. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa klorofil mempunyai bioaktivitas tinggi sebagai senyawa
antikanker, antioksidan, katalisator pelepas radikal bebas, menghambat oksidasi lipid,
fototoksin khususnya terhadap larva nyamuk, membersihkan darah kotor,
meningkatkan imunitas, serta dapat berperan sebagai fotosensitizer dalam terapi
fotodinamika untuk penghancuran sel tumor dan kanker (Kusmita dan Limantara
2009).
Pigmen klorofil dapat diambil dari sumbernya seperti daun dari tumbuhan
tingkat tinggi ataupun alga melalui proses ekstraksi. Target ekstraksi dapat berupa
senyawa bioaktif yang tidak diketahui, senyawa yang diketahui ada pada suatu
organisme, serta sekelompok senyawa dalam suatu organisme yang berhubungan
secara struktural (Mukhriani 2014). Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan
dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Setelah proses ekstraksi,
pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Ekstrak awal sulit dipisahkan
melalui teknik pemisahan tunggal untuk mengisolasi senyawa tunggal. Oleh karena
itu, ekstrak awal perlu dipisahkan ke dalam fraksi yang memiliki polaritas dan ukuran
molekul yang sama. Identifikasi golongan senyawa dilakukan dengan uji warna,
penentuan kelarutan, bilangan Rf dan ciri spektrum UV. Identifikasi yang paling
umum digunakan secara luas ialah pengukuran spektrum serapan dengan
menggunakan spektrofotometer (Maleta et al. 2018)
Metode ekstraksi terdiri dari metode konvensional dan modern. Metode-
metode tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan masing-masing. Semakin
berkembangnya zaman terdapat metode-metode ekstraksi yang efektif dan efisien
untuk mengekstrak pigmen dari bahan. Terdapat beberapa metode umum ekstraksi
yang sering dilakukan yaitu ekstraksi dengan pelarut (maserasi), destilasi,
supercritical fluid extraction (SFE), pengepresan mekanik dan sublimasi, serta
secara enzimatik (Sayuti 2017). Salah satu metode yang dapat digunakan untuk
memisahkan campuran pada hasil ekstraksi yaitu sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan proses pemisahan partikel berdasarkan berat partikel terhadap densitas
layangnya (Gopala 2016). Setelah dilakukan sentrifugasi, menurut Warono dan
Syamsudin (2013), metode spektrofotometri dapat dilakukan untuk menetapkan
senyawa-senyawa organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa
dalam jumlah yang sangat kecil. Analit yang dapat diukur dengan spektrofotometer
sinar tampak adalah analit berwarna seperti ekstrak klorofil sehingga dapat menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu. Praktikum ini dilakukan untuk menentukan
kadar klorofil a dan b menggunkan metode spekrofotometri.

METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada Rabu, 23 Oktober 2019 di Laboratorium

Biokimia Departemen Biokimia, Fakutltas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah spektrofotometer UV-Vis,

sentrifus dan tabung sentrifus, neraca analitik, alat gelas, mortar, dan pestle. Bahan
yang digunakan adalah daun air mata pengantin, aseton 80%, pasir kuarsa, parafilm.

Prosedur Percobaan

Sebanyak 1 gram irisan halus daun air mata pengantin dihaluskan

menggunakan mortar dengan bantuan pasir kuarsa dan dilarutkan dengan 5 mL
aseton. Suspensi yang diperoleh kemudian disentrifugasi. Supernatan (ekstrak
klorofil) dipisahkan dan ampas diekstraksi ulang dengan 5 mL aseton. Suspensi dari
ampas di sentrifugasi dan supernatan yang diperoleh digabungkan dengan supernatan
pertama. Proses ekstraksi dan sentrifugasi diulang kembali pada ampasnya.
Supernatan dari 3 ulangan ekstraksi dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL,
kemudian diencerkan sampai tanda tera dengan aseton. Bila tidak langsung diukur,
ekstrak harus ditempatkan di ruang gelap atau dibungkus dengan kertas karbon.
Eksstrak diukur serapannya pada panjang gelombang 645 dan 663 dengan blanko
aseton 80%. Setelah itu, kadar klorofil dapat dihitung melalui nilai serapan yang
diperoleh.

HASIL PENGAMATAN

Absorbansi dari ekstrak klorofil daun air mata pengantin dengan pelarut
aseton diukur menggunakan metode spektrofotometri. Panjang gelombang yang
digunakan yaitu 663 nm dan 645 nm. Percobaan dilakukan dalam tiga ulangan
dengan satu blanko.
 Tabel 1 Nilai absorbansi klorofil daun air mata pengantin
A terukur A terkoreksi
Sampel Ulangan
λ 663 λ 645 λ 663 λ 645
Blanko (aseton) 0.062 0.058 0 0
1 0.432 0.328 0.370 0.270
Daun air mata
2 0.481 0.303 0.419 0.245
pengantin
3 0.446 0.270 0.384 0.212
Rata-rata 0.391 0.242

Tabel 1 menunjukkan bahwa nilai absorbansi pada panjang gelombang 663

nm dan 645 nm berbeda. Absorbansi blanko sebagai kontrol negatif klorofil lebih
besar di panjang gelombang 663 nm. Hal tersebut juga berlaku pada sampel ekstrak
daun air mata pengantin. Selama tiga kali pengulangan, nilai absorbansi pada 663 nm
lebih besar dari 645 nm. Rata-rata yang diperoleh dari absorbansi 663 nm yaitu 0.391
sedangkan dari absorbansi 645 nm yaitu 0.245.
Setelah pengukuran nilai absorbansi, kadar klorofil dari daun air mata
pengantin dapat diukur. Kadar klorofil a lebih tinggi dari klorofil b yaitu sebesar
4.315 mg/L, sedangkan kadar klorofil b yaitu sebesar 3.947 mg/L. Kadar kedua
klorofil dijumlahkan menjadi kadar klorofil total yaitu sebesar 8.023 mg/L.

Tabel 2 Kadar klorofil daun air mata pengantin

Konsentrasi (mg/L)
Sampel
[klorofil a] [klorofil b] [klorofil total]
Daun air mata
pengantin 4.315 3.947 8.023

Contoh perhitungan
- A663 terkoreksi 1 = Absorbansi terukur – Absorbansi blanko
= 0.432 – 0.062
= 0.370
- Rata-rata A terkoreksi = (A terkoreksi 1 + A terkoreksi 2 + A terkoreksi 3) : 3
= (0.370 + 0.419 + 0.384) : 3
= 0.391
- [Kadar klorofil]
a. [Klorofil a] = 12.7 A663 – 2.69 A645
= (12.7 x 0.391) – (2.69 x 0.242)
= 4.966 – 0.651
= 4.315 mg/L
 b. [Klorofil b] = 22.9 A645 – 4.08 A663
= (22.9 x 0.242) – (4.08 x 0.391)
= 5.542 – 1.595
= 3.947 mg/L
c. [Klorofil total] = 20.2A645 + 8.02 A663
= (20.2x 0.242) + (8.02 x 0.391)
= 4.888 + 3.136
= 8.023 mg/L

PEMBAHASAN

Tumbuhan tingkat tinggi memiliki beberapa jenis klorofil yang sering

dijumpai sebagai hasil dari fotosintetis yaitu klorofil a dan klorofil b. Kedua jenis
klorofil tersebut merupakan pigmen utama fotosintetis yang berperan menyerap
cahaya violet, biru, merah dan memantulkan cahaya hijau. Klorofil a lebih banyak
menyerap cahaya ungu, biru dan merah, sedangkan klorofil b banyak menyerap
cahaya biru dan cahaya orange (Gibson et al. 2017). Prinsip untuk pengukuran
konsentrasi klorofil yaitu secara spektrofotometri yang didasarkan pada penyerapan
maksimum oleh ekstrak klorofil dalam aseton pada panjang gelombang 630 – 665
nm. Sampel dengan kadar pekat menyebabkan cahaya yang diserap semakin banyak
dan warna sampel semakin gelap. Adanya hubungan antara penyerapan cahaya
dengan kadar larutan merupakan prinsip dasar dari penggunaan spektrofotometer
yang menggunakan cahaya monokromatik (Prastyo dan Laily 2015).
Tabel 1 menunjukkan daya serap dari klorofil dari daun air mata pengantin
pada panjang gelombang 663 nm lebih tinggi dari panjang gelombang 645 nm.
Panjang gelombang 663 nm merupakan daerah penyerapan maksimum untuk klorofil
a, sedangkan 645 nm untuk klorofil b (Aryanti et al. 2016). Menurut Kimball (1992)
dalam Oktavia (2009) menyatakan bahwa perbedaan struktur kimia membuat kedua
pigmen tersebut memiliki spektrum absorbsi berbeda. Perbedaan struktur kimia pada
klorofil a dan klorofil b terletak pada gugus yang terikat pada cincin porfirin. Klorofil
a mengandung gugus -CH3 sedangkan klorofil b mengandung gugus HC=O.
Perbedaan struktur tersebut juga menyebabkan warna yang dihasilkan juga berbeda.
Hasil perhitungan kadar klorofil a dan klorofil b daun air mata pengantin
menggunakan spektrofotometer pada tabel 2 menunjukkan bahwa nilai tertinggi kadar
klorofil terdapat pada klorofil a yaitu 4.315 mg/L sedangkan klorofil b yaitu 3.947
mg/L dengan total kadar klorofil yaitu 8.023 mg/L. Menurut Sumenda et al. (2011),
sintesis klorofil b terus berlanjut bersamaan dengan perkembangan daun yang
ditandai dengan berubahnya warna daun hijau muda menjadi hijau tua. Hal tesebut
menjadi acuan jika daun yang digunakan dalam analisis klorofil termasuk daun muda
karena kadar klorofil a lebih tinggi. Daun yang hampir mati akan menjadi kuning
serta tidak mampu berfotosintesis karena rusaknya klorofil dan hilangnya fungsi
kloroplas (Ajiningrum 2018).
 Analisis klorofil diawali dengan tahap ekstraksi daun menggunakan pasir
kuarsa yang mengandung silika atau dikenal dengan silikon dioksida (SiO2).
Penggunaan pasir kuarsa bertujuan untuk menyerap senyawa pengotor yang terbawa
selama proses ekstraksi. Selain itu, silika dapat meningkatkan konsentrasi Fe dan Mn
pada tanaman. Unsur Fe dan Mn berfungsi sebagai pembentuk dan penyusun klorofil
sehingga silika sangat berpengaruh dalam meningkatkan jumlah klorofil (Hastuti et
al. 2016). Klorofil termasuk pigmen non polar dan harus diekstrak dengan pelarut
organik dengan kepolaran tertentu. Salah satu contoh pelarut organik adalah aseton
yang dapat mengikat klorofil dan menghasilkan warna hijau yang relatif stabil.
Klorofil tidak dapat diekstrak menggunakan air karena dapat melepaskan klorofil
sehingga akan berubah warna ketika terkena suhu tinggi (Fitria 2015). Selanjutnya,
metode sentrifugasi digunakan untuk memisahkan klorofil dari campuran pada hasil
ekstraksi yang diperoleh. Pemisahan senyawa dengan sentrifugasi ini didasarkan pada
berat senyawa terhadap densitas layangnya (Gopala 2016).
Pengukuran kadar klorofil dengan spektrofotometri dinyatakan dalam Hukum
Lambert-Beer yang mengatakan bahwa jumlah radiasi cahaya tampak yang diserap
atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari
konsentrasi zat dan tebal larutan. Penentuan konsentrasi sampel dapat dilakukan
dengan mengukur banyaknya cahaya yang diabsorbsi sampel dengan menggunakan
Hukum Beer tersebut. Hukum ini melibatkan koefisien ε yaitu koefisien molar
”extinction” yang nilainya dipengaruhi oleh sifat-sifat khas dari materi yang diradiasi
seperti konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang
gelombang radiasi. Jika koefisien molar tidak diketahui, konsentrasi dapat diukur
menggunakan kurva standar yang membandingkan absorban dengan konsentrasi dari
larutan standar yang dibuat (Neldawati et al. 2013).

SIMPULAN

Kadar klorofil a dan b pada daun air mata pengantin yang berwarna hijau
ditentukan malalui metode spektrofotometri. Klorofil a memiliki daya serap
maksimum pada panjang gelombang 663 nm dan klorofil b pada panjang gelombang
645 nm. Warna setiap klorofil berbeda karena klorofil a mengandung gugus -CH3
sedangkan klorofil b mengandung gugus HC=O. Kandungan klorofil a yang tinggi
pada daun menunjukkan bahwa daun tersebut masih muda.

DAFTAR PUSTAKA

Ajiningrum PS. 2018. Kadar total pigmen klorofil tanaman Avicennia marina pada
tingkat perkembangan daun yang berbeda. Stigma. 11(2) : 52 – 59.
Arfandi A, Ratnawulan, Darvina Y. 2013. Proses pembentukan feofitin daun suji
sebagai bahan aktif photosensitizer akibat pemberian variasi suhu. PILLAR
OF PHYSICS. 1(1) : 68 – 76.
Aryanti N, Nafiunisa A, Willis FM. 2016. Ekstraksi dan karakterisasi klorofil dari
daun suji (Pleomele angustifolia) sebagai pewarna pangan alami. Jurnal
Aplikasi Teknologi Pangan. 5(4) : 129 – 135.
Fitria EA. 2015. Pemanfaatan klorofil sebagai cerdas indikator warna [skripsi].
Bogor(ID) : Institut Pertaniaan Bogor.
Gibson M, Kasman, Iqbal. 2017. Analisa kualitas klorofil daun jarak kepyar (Ricinus
comunis L) sebagai bahan pewarna pada dye sensitized solar cell (DSSC).
16(2) : 31 – 40.
Gopala J. 2016. Pengaruh kecepatan sentrifugasi terhadap hasil pemeriksaan sedimen
urin pagi metode konvensional [skripsi]. Semarang(ID) : Universitas
Muhammadiyah.
Hastuti W, Prihastanti E, Haryanti S, Subagio A. 2016. Pemberian kombinasi pupuk
daun gandasil d dengan pupuk nano-silika terhadap pertumbuhan bibit
mangrove (Bruguiera gymnorrhiza). Jurnal Biologi. 5(2) : 38 – 48.
Hendriyani IS, Setiari N. 2009. Kandungan klorofil dan pertumbuhan kacang panjang
(Vigna sinensis) pada tingkat penyediaan air yang berbeda. J. Sains & Mat.
17(3) : 145 – 150.
Kusmita L, Limantara L. 2009. Pengaruh asam kuat dan asam lemah terhadap
agregasi dan feofitinisasi klorofil a dan b. Indo. J. Chem. 9(1) : 70 – 76.
Maleta HS, Indrawati R, Limantara L, Brotosudarmo THP. 2018. Ragam metode
ekstraksi karotenoid dari sumber tumbuhan dalam dekade terakhir (telaah
literatur). Jurnal Rekayasa Kimia dan Ligkungan. 13(1) : 40 – 50.
Mukhriani. 2014. Ekstraksi, pemisahan senyawa, dan identifikasi senyawa aktif.
Jurnal Kesehatan. 7(2) : 361 – 367.
Neldawati, Ratnawulan, Gusnedi. 2013. Analisis nilai absorbansi dalam penentuan
kadar flavonoid untuk berbagai jenis daun tanaman obat. PILLAR PHYSICS.
2(1) : 76 – 83.
Oktavia S. 2009. Pengukuran Kandungan Klnorofil Dengan Teknik Spektrometri.
Purwokerto(ID) : Universitas Jendaral Soedirman.
Prastyo KA, Laily AN. 2015. Uji konsentrasi klorofil daun temu mangga (Curcuma
mangga Val.), temulawak (Curcuma xanthorrhiza), dan temu hitam
(Curcuma aeruginosa) dengan tipe kertas saring yang berbeda menggunakan
spektrofotometer. Biologi Education. 1(1): 188 – 191.
Sayuti M. 2017. Pengaruh perbedaan metode ekstraksi, bagian dan jenis pelarut
terhadap rendemen dan aktifitas antioksidan bambu laut (Isis hippuris).
Technology Science and Enginering Journal. 1(3) : 166 – 174.
Sumenda, Rampe LHL, Mantiri FR. 2011. Analisis kandungan klorofil daun mangga
(Mangifera indica L.) pada tingkat perkembangan daun yang berbeda.
Bioslogos. 1(1) : 20 – 24.
Warono D, Syamsudin. 2013. Unjuk kerja spektrofotometer untuk analisa zat aktif
ketoprofen. KONVERSI. 2(2) : 57 – 65.