PEWARNAAN JARINGAN

Disusun oleh:

1. Dini Ismi Lestari

2. Nisa Khairiyah
Sitohistoteknik

Metoda membuat sajian dari spesimen tertentu

melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi
preparat histologi yang baik dan siap untuk
dianalisis. Spesimen dapat berasal dari manusia
dan hewan.
Pewarnaan

Untuk mempertajam atau

memperjelas berbagai sel-sel
TUJUAN
jaringan sehingga terlihat
dengan menggunakan
mikroskop.

Preparat histologi rutin

biasanya menggunakan
kombinasi pewarnaan
Hematoksilin&Eosin.
PERSIAPAN JARINGAN UNTUK HISTOLOGI

Tahapan 1. Fiksasi
2. Dehidrasi
3. Penjernihan (Clearing)
4. Embedding
5. Pemotongan (Sectioning)
6. Perekatan (Mounting)
7. Pemulasan (Staining)
Fiksasi tujuan
Pengawetan jaringan
Mempertahankan struktur agar tidak
berubah

Suatu larutan kimia yang

mengandung bahan fiksatif
pada pH 7,0 ditambahkan
ke jaringan. Bahan fiksatif
paling umum digunakan
yaitu Formaldehida 4%
(formalin adalah lar.
formaldehida dgn kadar
37% atau 40%) yang
isotonis.
Dehidrasi tujuan
Untuk menghilangkan/menarik air
dalam jaringan dengan cara mulai
konsentrasi terendah sampai
konsentrasi tinggi.
Membuat potongan-potongan,
dan jaringan harus dipendam
dlm lilin (parafin). Sifat lilin
yang tidak terlarut dlm air
dapat dilakukan menggantikan
air dgn alkohol, lalu
menempatkan jaringan dlm
larutan yang mengandung
alkohol dengan konsentrasi yg
meningkat sampai berakhir
pada konsentrasi 100%.
Proses ini dilakukan bertujuan
meminimalkan kerusakan
pada jaringan.
 Penjernihan (clearing) Menarik keluar kadar alcohol
yang berada dalam jaringan,
memberi warna yang bening
pada jaringan dan juga sebagai
perantara masuknya kedalam
paraffin.

Untuk mempermudah embedding dgn

parafin, celah-celah jaringan yg
tadinya berisi air hrs dibersihkan
dari sisa-sisa alkohol menggunakan
pelarut parafin. Potongan
ditempatkan dlm pelarut organik
(xylene/toluen) yang menggantikan
alkohol.
Pelarut organik disebut bahan
penjernih karna jaringan seringkali
terlihat tampak jelas saat
dipendam dlm bahan penjernih.
Pemendaman (Embedding)

Jaringan ditempatkan dalam

lilin parafin hangat pada
suatu cetakan. Embedding
dilakukan dlm oven dgn suhu
58-60C.
Pada pendinginan selanjutnya
lilin akan mengeras dan
lembaran jaringan dapat
dipotong.
Pemotongan (sectioning)

Potongan (lembaran) dengan

ketebalan sekitar 10-20
mikron dan dipotong dgn
menggunakan alat mikrotom.
Perekatan (mounting)
Potongan lilin
diletakkan pada kaca
objek.
 Staining Tujuan
Jaringan terlihat tampak nyata
Dapat membedakan bagian-bagian
jaringan

Pewarna yg digunakan semua

berbahan dasar air, sayatan
jaringan masih penuh dengan
parafin yang tidak dapat
menerima lar. Pewarna,
sehingga lilin harus dilarutkan
dan diganti dgn air agar zat
warna mampu menembus
potongan jaringan .
Potongan ditempatkan dlm alkohol dgn konsentrasi
yg semakin menurun dan terakhir hanya air.
Sehingga sediaan diatas kaca objek dpt diwarnai,
sedian yg sudah diwarnai dikeringkan dan ditutup
dgn kaca penutup.
Jenis-jenis Pewarnaan Histologi

Hematoksilin & Eosin

Hematoksilin berasal dari pohon
logwood (Hematoxylum
campechianum). Hematoksilin
adalah pewarna yang
bersifat basa yang berikatan
pada struktur asam dlm sel
yg memulas menjadi warna
biru keunguan.
Eosin pewarna yg bersifat asam
yg bermuatan negatif. Eosin
berikatan pada struktur basa
dlm sel yg memulas menjadi
merah/merah muda.
Persiapan reagen
Komposisi hematoksilin Komposisi Eosin
Kristal haematoxylin. 1 gr
Akuades... 1000 ml
Eosin-alkohol Stock 1%
Sodium iodate... 0,2 gr Eosin y ws... 1 gr
Ammonium/potassium alum...... 50 gr aquades 20 ml
Citric acid...... 1 gr
Chloralhydrate... 50 gr
Larutkan dan tambahkan alkohol
95% .. 80 ml
Cara pembuatan Hematoksilin
Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam Cara pembuatan Eosin
aquades.
Tambahkan Haematoxylin dan campurkan Eosin-alkohol stock 1 bagian
secara baik.
Alkohol 80% 3 bagian
Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid,
dan Chloralhydrate. Dibuat sesaat sebelum digunakan dan
Campur dan aduk hingga seluruhnya tambahkan Asam Asetat glasial 0,5
tercampur dengan baik.
ml untuk setiap 100 ml larutan dan
Biarkan semalam dan saring dengan kertas
saring besoknya. aduk dengan baik.
Pewarnaan Hematoksilin & Eosin
Xylol 1 dan 2 masing masing 2 menit, Alkohol 100% 2 menit (2x), Alkohol 95% 2 menit (2x)
1. masukkan ke dalam larutan hematoksilin selama 10-15menit
2. cuci dengan air mengalir sampai tidak luntur
3. celupkan dalam HCL 0,4 % 2x celup untuk decolorisasi
4. cuci dengan air mengalir
5. Masukkan ke Lithium karbonat 5% selama 3X celup
6. Cuci dengan air mengalir
7. masukkan ke dalam larutan eosin 1% 2menit
8. Masukkan ke dalam larutan Etanol 1 3x celup
9. Masukkan ke dalam larutan Etanol 2 3x celup
10. Masukkan ke dalam larutan Etanol 3 3x celup
11. Masukkan ke dalam larutan Xylol 1 5menit
12. Masukkan ke dalam larutan Xylol 2 5menit
13. Masukkan ke dalam larutan Xylol 3 5menit
14. Di mounting dan diberi label
Masson trikrom

Metoda masson trikrom

menggunakan tiga
pewarna berbeda
(hematoksilin, acid fuchsin,
dan methyl blue)
Nukleus terpulas menjadi
biru
Sitoplasma, sel darah
merah, keratin terpulas
menjadi merah cerah
Kolagen dlm membran
basal, jaringan ikat, dan
kartilago terpulas menjadi
hijau
Pewarnaan Masson Trikrom
1. Dilakukan deparafinisasi menggunakan larutan cleaning dimasukkan ke dalam xylol
dalam 3 wadah masing-masing 3 menit.
2. Kemudian dehidrasi ke dalam alkohol bertingkat (100%,100%,96%,96%) masing-
masing 3 menit dicuci dengan air
3. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory I yang berisi acid fuchsine 0,5 gr
dan aquades 100cc selama 5 menit kemudian dicuci dengan aquades
4. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory II yang berisi phosphomolibdic acid
1gr dan aquades 100cc selama 5 menit kemudian di drainasi
5. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory III yang berisi aniline blue 0,5 gr,
orange G 2,0 gr, oxalic acid 1gr dan aquades 100 cc selama 2 menit kemudian
dicuci dengan aquades
6. Obyek glass kemudian direndam ke dalam larutan asam asetat 1% selama 2 menit
7. Dilakukan dehidrasi alkohol bertingkat (96%,96%,100%,100%)
8. Dilakukan cleaning direndam dalam xylene 3 kali dalam wadah berbeda masing-
masing selama 3 menit
9. Dilakukan mounting
Pulasan Giemsa

Pulasan ini digunakan untuk

sumsum tulang belakang
dan apus darah.
Sel darah merah terpulas
menjadi merah muda
(tanpa nukleus)
Sel darah putih:
sitoplasma terpulas
menjadi biru pucat dan
nukleus menjadi biru
tua/ungu.
 Pewarnaan Giemsa

1. Sediaan apus telah benar-benar kering di udara

2. Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit
3. Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara
4. Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan
perbandingan (GZ : Bufer phosfat = 1:4)
5. Cuci dengan aquadest, kering diudara
6. Tutup lalu lakukan mounting
Pulasan Perak

Pulasan perak memulas

saraf dan terminal akson
(terminal bouton)
menjadi warna hitam.
Metode alternatifnya
adalah Golgi-Cox
(merkuri klorida,kalium
kromat dan dikromat)
Pewarnaan perak
1. Lakukan deparafinasi preparat (blok parafin) dengan xylene sebanyak 3 kali masing-masing 3 menit.
2. Rehidrasi preparat dengan menggunakan etanol 100%, etanol 95 % dan etanol 70% masingmasing selama
dua menit, dua menit, satu menit dan terakhir dengan air selama satu menit.
3. Imersikan preparat dalam bufer natrium sitrat (pH 6,0).
4. Inkubasi preparat di dalam autoklaf pada suhu 120C (tekanan 1,1-1,2 bar) selama 20 menit.
5. Dinginkan preparat sampai suhu 37C.
6. Imersikan preparat ke dalam larutan pengecatan perak yang terdiri dari : 1 bagian volume gelatin 2%
dalam asam formiat 1% 2 bagian larutan perak nitrat 25% dalam suhu 37C, selama 11 menit.
7. Hentikan reaksi pengecatan dengan mencuci slide preparat menggunakan aqua bidestilata untuk
menghilangkan presipitat perak nonspesifik.
8. Dehidrasi preparat menggunakan etanol dengan konsentrasi yang dinaikkan secara bertingkat (50%, 70%,
95%)
9. Bersihkan preparat dengan xylene
10. Tutup preparat dengan coverslip
11. Amati jumlah blackdots tiap sel menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x. Parameter
kuantitatif AgNOR : mAgNOR : hitung rata-rata blackdots pada minimal 100 sel yang diamati. pAgNOR :
hitung jumlah sel yang memiliki blackdots kurang dari 5 dan yang memiliki blackdots lebih dari 5 pada minimal
100 sel yang diamati.
12. Dokumentasi setiap pengamatan
Cresyl Violet

Pulasan ini digunakan

untuk mewarnai Nissl
(retikulum endoplasma
kasar) dlm badan sel
neuron.
Pewarnaan Cresyl Violet
1. Slide jaringan dalam parafin yang akan diwarnai dengan cresyl echt violet diatur dalam rak
pewarnaan, kemudian diinkubasi pada suhu 60 C selama 2 jam. Tujuan inkubasi ini adalah
menguatkan lagi perlekatan atau adhesi jaringan dengan slide
2. Slide dikeluarkan dari inkubator dan disimpan pada suhu ruang untuk diwarnai pada hari
berikutnya atau minimal 90 menit pada suhu ruang. Tujuannya agar suhu slde jaringan
kembali pada suhu ruang sebelum dilakukan proses selanjutnya.
3. Selanjutnya dilakukan deparafinisasi dengan xilol sebanyak tiga kali masing-masing selama
lima menit
4. Kemudian slide rehidrasi dengan memasukkan slide jaringan ke dalam alkohol bertingkat
dari alkohol absolut dua kali, alkohol 95% dua kali, alkohol 80 %, alkohol 70% masing-
masing lima menit, dan dicelup dalam aquades hingga alkohol hilang.
5. Setelah proses rehidrasi, slide jaringan dimasukkan dalam cresyl violet (Chroma, 1A
396) selama 30 menit pada suhu 37 C,
6. Kemudian didehidrasi dengan alkohol 70% sampai dengan alkohol absolut masing-masing
lima celup,
7. Selanjutnya dilakukan clearing dalam xilol sebanyak tiga kali masing-masing dua menit.
Slide yang telah diwarnai ditutup dengan kaca penutup (mounting) yang sebelumnya telah
ditetesi dengan xilol dan mounting medium Canada balsam
Periodic acid Schiff (PAS)

PAS telah dikombinasikan

dengan pewarna Albican
blue yg memulas sejumlah
musin menjadi warna biru
gelap.
Sel goblet (kaya akan
karbohidrat&musin) terpulas
menjadi ungu kemerahan.
Kelenjar yg kaya musin
terpulas menjadi biru gelap.
Persiapan reagen

Asam Periodat 0,5% dan Schiff (100 ml)

Reagen Schiff :
1 gr Basic Fuchsin dilarutkan dalam 200 cc aquades
panas, dinginkan 50OC. Tambah bubuk padat sodium
metabisulfid 2 gr, kocok sampai rata. Tambahkan HCl
10 cc, diamkan pada suhu kamar yang gelap 24 jam.
Setelah itu tambah norit 0,5 gr kocok sampai rata
(merah jadi hitam), pada pemakaian disaring hingga
jernih.
Pewarnaan Periodic Acid Schiff
1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan Xylol dan alkohol
bertingkat masing masing selama 3-5menit
2. Cuci dengan air mengalir selama 10menit
3. Dioksidasi dalam asam periodat 1% selama 5-10menit
4. Pencucian dengan aquades 3x, masing masing selama 5 menit
5. Pewarnaan digunakan larutan Reagent Schiff selama 15-30menit
6. Pencucian dengan air sulfit yang selalu fresh (dibuat baru) 3 x 3menit
7. Pencucian dengan aquades selama 5menit sebanyak 3x
8. Counterstain dengan hematoksilin, cek dengan mikroskop
9. Pencucian dengan air mengalir 10-60 menit
10. Pencucian dengan aquades selama 5menit sebanyak 2x
11. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan Xylol dan penutupan
sediaan dengan gelas penutup