PENUNTUN PRAKTIKUM

SITOHISTOTEKNOLOGI

Oleh : Dra. Hayati, M.Farm

PROGRAM DIPLOMA 4 ANALIS KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA
JAKARTA
2017
 KATA PENGANTAR

Histologi adalah salah satu ilmu ilmu yang membahas tentang sel dan jaringan. Ilmu
ini berkembang seiring dengan berkembangnya ilmu fisika optik khususnya penemuan
mikroskop dan ilmu teknik pewarnaan (histokimia) dan teknik pembuatan preparat dari organ
dan jaringan hewan, sehingga kita dapat melihat jaringan yang menyusun dari satu organ baik
dalam keadaan normal maupun patologis. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa
untuk suatu penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara mengambil
jaringan (biopsi jaringan) dan kemudian membuat preparasi jaringannya.
Program D4 Analis Kesehatan adalah satu program studi dalam rumpun ilmu
kesehatan, yang mempersiapkan teknisi kesehatan yang terampil dan handal di laboratorium
medik, khususnya untuk membantu tegaknya diagnosa suatu penyakit. Salah satu ilmu yang
dibutuhkan adalah Histologi ini.
Bahan bacaan baik barupa buku pegangan ataupun modul praktikum yang dibutuhkan
oleh para mahasiswa khusunya di program D4 Analis Kesehatan ini masih belum terpenuhi.
Untuk memenuhi kebutuhan itulah maka disusun penuntun praktikum untuk Histologi ini.
Penulis menyadari banyak sekali kekurangan yang harus diperbaiki untuk modul
praktikum ini. Penulis mengharapkan saran serta kritik yang bersifat membangun untuk
mendapatkan formulasi yang bagus dan tepat dari Sitohistologi ini khususnya untuk program
D4 Analis Kesehatan ini

Penulis
 DAFTAR ISI

Hal.

KATA PENGANTAR ............................................................................................ i

DAFTAR ISI........................................................................................................... ii
BAB I. PENDAHULUAN .................................................................................... 1
BAB II. TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT .................................................... 5
A. Pembuatan Preparat Dengan Teknik Sayatan .................................... 5
1. Menyiapkan Hewan Percobaan ................................................... 5
2. Pengambilan Organ / Jaringan ..................................................... 5
3. Pencucian ..................................................................................... 5
4. Fiksasi .......................................................................................... 5
5. Dehidrasi ...................................................................................... 8
6. Penjernihan .................................................................................. 8
7. Embedding ................................................................................... 9
8. Penyayatan ................................................................................... 9
9. Pewarnaan .................................................................................... 11
10. Afiksasi ........................................................................................ 11
11. Mounting ...................................................................................... 12
B. Bagan Preparasi Jaringan histologi Dengan Teknik Sayatan ............. 13
C. Pembuatan Preparat TanpaTeknik Sayatan ...................................... 14
1. Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts) ....................................... 14
2. Metoda Sediaan Urai ................................................................... 15
3. Metoda Sediaan Ulas ................................................................... 15
4. Metoda Sediaan Rentang ............................................................. 16
5. Metoda Sediaan Gosok ................................................................ 16
6. Metoda Sediaan Supravital .......................................................... 16

BAB III. PEWARNAAN ........................................................................................ 17

BAB IV. MIKROTOM ........................................................................................... 19
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 23
 BAB I. PENDAHULUAN

A. Definisi Histologi

Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu kata, histos dan logos. Histos berarti
jaringan dan logos adalah ilmu. Jadi Histologi adalah salah satu cabang dari ilmu Biologi
yang membahas tentang jaringan (Bevelander dan Ramaley 1988). Jaringan itu sendiri adalah
sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Untuk memahami histologi, sebelumnya
seorang mahasiswa harus memahami terlebih dahulu ilmu anatomi tubuh manusia khususnya,
kemudian sistem organ yang mendukung suatu organisme itu serta organ apa saja yang
terlibat di dalam suatu sistem organ tersebut. Ilmu ini berkembang seiring dengan
berkembangnya ilmu fisika optik khususnya penemuan mikroskop dan ilmu teknik
pewarnaan (histokimia) dan teknik pembuatan preparat dari organ dan jaringan hewan,
sehingga kita dapat melihat jaringan yang menyusun dari satu organ baik dalam keadaan
normal maupun patologis. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa untuk suatu
penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara biopsi jaringan dan kemudian
membuat preparasi jaringannya.
Spektrum biologi dimulai dari tingkat Biomolekul yang menyatakan bahwa makhluk
hidup disusun atas 4 biomolekul yaitu karbohidrat, lipid, protein dan 2 jenis asam nukleat
yaitu Deoksiribosa Nucleic Acid (DNA) dan Ribosa Nucleic Acid (RNA). Makna dari
pernyataan bahwa makhluk hidup itu disusun oleh 4 biomolekul artinya makhluk hiodup itu
mutlak mempunyai 4 biomolekul ini dan asam nukleatnya harus ada kedua duanya (DNA dan
RNA). Virus tidak dikatakan makhluk hidup karena hanya memiliki hanya 2 biomolekul saja
yaitu protein dan asam nukleat yang hanya salah satunya saja, yaitu DNA saja atau RNA saja.
Dengan kata lain lain virus dikatakan sebagai jasad non sellular (Yuwono 2008) atau ada
juga yang menyatakan virus sebagai partikel non sel (Champhel dkk. 1999).
Tingkat berikutnya adalah Sel didefinisikan sebagai unit strukturil dan fungsionil
yang hidup. Satu sel sudah dikatakan hidup, karena secara struktural terdisi atas inti sel yang
mengendalikan semua aktifitas sel yang dilakukan oleh organela yang terdapat di dalam
sitoplasma. Setiap organela melakukan aktivitas atau fungsinya sesuai perintah dari inti sel
yang dikendalikan oleh DNA atau gen dan kekerja secara bersama-sama (sinergis), sehingga
satu sel dapat melakukan aktivitas hidup. Sel melakukan pertukaran zat, ada zat yang masuk
sebagai input kemudian dimetabolism menjadi suatu produk (output) dan juga produk sisa
yang harus dibuang dengan tujuan mempertahankan kondisi keseimbangan internal sel atau
homeostasis. Sel melakukan reproduksi, dengan cara mewariskan sifat yang dibawa oleh
seperangkat gen dengan tujuan mempertahankan generasinya, dan lain lain.
Tingkat berikutnya adalah Jaringan, yang didefinisikan sebagai sekumpulan sel yang
sama bentuk dan fungsinya. Artinya satu jaringan berarti hanya disusun oleh satu tipe sel saja
dan fungsinya juga pasti sama pula. Tingkat berikutnya adalah Organ, yang merupakan
kumpulan dari beberapa macam jaringan. Misalnya satu organ pankreas yang merupakan satu
organ yang termasuk dalam sistem endokrin, terdiri dari 3 macam jaringan, yaitu :
1. Jaringan yang disusun oleh sel α pankreas mensekresikan hormon glukagon,
berfungsi dalam konversi glikogen menjadi glukosa (meningkatkan kadar
glukosa)
2. Jaringan yang disusun oleh β pankreas mensekresikan hormon insulin, berfungsi
dalam konvesri glukosa menjadi glikogen (menurunkan kadar glukosa)
3. Jaringan yang disusun oleh γ pankreas mensekresikan hormon somastatin,
berfungsi sebagai penyeimbang dari aktivitas hormon glukagon dan insulin.
Atau spektrum biologi dapat digambarkan sebagai satu piramida sebagaimana gambar di
bawah ini :

Organisme

Sistem Organ

Organ

Jaringan

Sel

Biomolekul

Gambar 1. Spektrum Biologi

Jadi, jelaslah untuk memahami histologi, terlebih dahulu harus memahami sietem organ dan
organ.
Berdasarkan kurikulum yang disusun, untuk mata kuliah Sitohistologi pada program
D4 Analis Kesehatan, ada 4 sistem organ yang dibahas, yaitu : sistem respirasi, sistem
pencernaan, sistem ekskresi dan kardio vaskular. Di dalam modul praktikum histologi
dibahas, organ yang terlibat di dalam setiap sistem organ serta sitohistologi dari organ yang
terdapat pada masing-masing sistem organ tersebut. Selain itu juga mahasiswa yang
mengambil mata kuliah Sitohistologi ini, juga diajarkan cara membuat preparat permanen
dari organ atau jaringan dari ke 4 sistem organ yang dibahas tadi dengan teknik sayatan
menggunakan rotary microtom.

B. Mikroteknik
Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian
jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan
mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat
dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat
diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita
mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian
atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat,
spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat
tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut
(Gunarso, 1989 cit. Imron 2008). Sedangkan menurut Dasumiati (2008) Mikroteknik adalah
ilmu yang akan mempelajari metode/prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis,
tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh
mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada
wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka
memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai
dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan
digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis.
Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :
1. Sediaan utuh (Whole mounts)
2. Sediaan irisan (sectioning)
3. Sediaan uraian (teasing)
4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital
 BAB II. TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT

Teknik pembuatan preaparat kususnya untuk jaringan hewan dan manusia ada 2
macam, yaitu teknik pembuatan preaparat dengan sayatan dan teknik pembuatan preparat
tanpa teknik sayatan. Pembuatan preparat tanpa tehnik sayatan antara lain, yaitu preparat ulas
dan preparat rentang, preaparat supravital, preparat utuh dan preparat urai.

A. Pembuatan Preparat Histologi dengan tehnik sayatan.

Pembuatan preparat histologi dengan tehnik sayatan adalah suatu cara membuat
preparat histologi menggunakan embedding dalam parafin dan mikrotom putar untuk
menyayat. Adapaun tahapan atau persiapan yang herus dilakukan untuk membuat
preparat histologi dengan tehnik sayatan adalah sebagai berikut :

1. Menyiapkan hewan percobaan untuk dibius

Sebelum melakukan pembiusan terhadap hewan percobaan, terlebih dahulu yang
harus dipersiapkan adalah : Menyediakan kapas yang sudah dibasahi dengan eter
sebagai bahan pembius hewan percobaan.
a. Memasukkan kapas yang sudah dibasahi dengan eter ka dalam wadah pembiusan.
b. Memasukan hewan percobaan ke dalam wadah pembiusan.
c. Menutup wadah, lalu hewan percobaan yang ada didalam wadah diamati hingga
terlihat lemas.

2. Pengambilan Organ / Jaringan

Organ ataupun jaringan yang diambil disesuaikan dengan kebutuhan dalam
pengamatan.

3. Pencucian
Pencucian organ dilakukan dengan cara memasukkan organ yang diinginkan ke
dalam larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%).

4. Fiksasi
Fiksasi adalah suatu usaha untuk mempertahankan elemen – elemen sel atau
jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun
ukuran. Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa
sehingga perubahan bentuk / struktur sel jaringan yang terjadi hanya sekecil
mungkin, menembus jaringan dengan cepat, bersifat mordent (mengikat) dan
membantu indeks refraksi. Untuk dapat melakukan hal tersebut suatu larutan fiksasi
harus dapat :
a. Menghentikan proses enzimatik sel tubuh secepatnya untuk mencegah
autolisis. Autolisis adalah pengerusakan sel sendiri sesudah terjadi kematian sel
dan disebabkan oleh kerja enzim yang terdapat di dalam sel itu sendiri. Autolisis
ini dapat dihambatdengan mendinginkan jaringan dalam ternperatur di bawah 0°C
atau dalam udara panas lebih dari 57°C, namun dalam suhu kamar akan
dipercepat. Selain autolisis, kerusakan jaringan dapat terjadi akibat bakteri, baik
disebabkan oleh bakteri yang ada (septikemi) ataupun bakteri komensial.
b. Mengkoagulasi protein jaringan sehingga menjadikan sel insoluble yang
mencegah masuk atau keluarnya zat-zat dalam sel.
c. Membuat jaringan mudah diwarnai. Jaringan harus dimasukkan ke dalam
larutan fiksasi secepat mungkin setelah diambil dari organ. Jika organ tersebut
mudah membusuk misalnya otak, hati, paru, usus dan organ dalam lainnya,
jangan ditunggu sampai operasi selesai. Daya penetrasi larutan fiksasi juga
terbatas. Banyaknya larutan fiksasi minimal jaringan dapat berenang di dalamnya
dan yang ideal jumlah larutan 10 x besar jaringan.

Berikut adalah jenis-jenis larutan fiksasi yang biasa digunakan dalam pemeriksaan
suatu jaringan adalah :
a) Formaldehid :
Formaldehid adalah suatu gas yang larut dalam air. Larutan ini bersifat asam
dan tersedia dalam bentuk formaldehid 40% atau formalin, namun dengan
konsentrasi ini tidak dapat dipakai untuk fiksasi karena terlalu cepat
mengeraskan jaringan. Sebagai larutan fiksasi harus dicampurkan dalam air
biasa atau larutan garam fisiologis, dengan perbandingan 1 bagian formalin
dengan 9 bagian pelarut menjadi formal saline 10% atau lebih dikenal dengan
formalin 10%. Untuk penyimpanan dalam jumlah besar dan waktu yang lama
maka formaline 10% harus diberi garam buffer atau magnesium atau
kalsiumkarbonat supaya tidak terjadi pembentukan endapan asam formik.
Formalin mempunyai bau yang tidak enak dan dapat mengiritasim kulit, selaput
 lendir dan mata. Oleh karena itu dianjurkan memakai sarung tangan dengan
udara terbuka waktu kita sedang mengelola materi berformalin.

b) Alkohol :
Alkohol Merupakan larutan dengan daya dehidrasi yang kuat dan menyebabkan
pengerasan dan pengerutan jaringan. Alkohol dapat mengkoagulasi protein dan
presipitasi glukogen dan melarutkan lemak. Fungsi alkohol yang utama adalah
sebagai bahan fiksasi sediaan sitologi namun dalam keadaan terpaksa dapat
digunakan sebagai fiksasi sediaan histopatologi. Hal ini disebabkan daya tembus
alkohol yang kurang baik oleh karena jaringan cepat menjadi keras dan
mengkerut sehingga sediaan sukar dipulas. Dua jenis alkohol paling sederhana
adalah methanol dan etanol.

c) Larutan Bouin
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam
larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x
volume jaringan yang akan difiksasi.
Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml
- Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
- Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan).
Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam
pikrat dalam etanol 95% 100 ml

d) Neutral Buffered Formalin

Komposisi :
- Formalin 10 ml
- Acid Sodium Phosphate monohydrate 0,40 gr
- Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr
- Ad akuades 100 ml
 Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan
rumus:
d = k √t

Keterangan
d = ketebalan jaringan (mm)
t = waktu yang dibutuhkan/tersedia
k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi)
Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78

5. Dehidrasi
Dehidrasi bertujuan untuk penarikan molekul air dalam jaringan. Proses ini
sangat penting terutama untuk jaringan – jaringan yang akan dibuat preparat irisan.
Biasanya proses dehidrasi dilakukan setelah proses fiksasi selesai.
Cara melakukan dehidrasi :
Proses dehidrasi dijalankan secara perlahan-lahan menggunakan alkohol bertingkat ,
dimulai dengan alkohol persentase rendah sampai dengan alkohol absolute. Dimulai
dengan alkohol 70 %, 80 %, 95 %, alkohol absolute ( selama 30 menit).
Waktu yang dipergunakan untuk setiap tingkat alkohol tergantung dari besar
kecilnya jaringan . Alkohol absolute mempunyai kemampuan memperkeras jaringan.
Sebagai ancar-ancar jaringan jangan ditinggalkan didalam alkohol tersebut lebih dari
1 atau 2 jam untuk jaringan berukuran biasa ( tebal 2-4 mm).

6. Penjernihan (Clearing)
Penjernihan adalah suatu proses yang dilakukan setelah tahapan dehidrasi
yang berfungsi untuk membuat jaringan menjadi jernih dan transparan. Medium
penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar dapat terwarnai
dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya dan juga
sebagai perantara masuknya jaringan kedalam paraffin. Zat yang sering dipakai
Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol dan lain-lain.. Untuk jaringan
otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform. Waktu yang digunakan untuk
proses penjernihan tergantung pada ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan.
Penjernihan biasanya dilakukan secara bertahap. Setelah jaringan selesai
didehidrasi di dalam alkohol absolut, selanjutnya organ dimasukkan ke dalam
 larutan campuran alkohol absolut : xilol (1 ; 1) selama 30 menit, lalu dilanjutkan di
dalam xilol selama 30 menit.

7. Embedding
Embeding (Penanaman) adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman
(embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan
dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Tujuan tahap embeding ini adalah
untuk mengisi jaringan dengan parafin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki
bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
Cara melakukan embedding :
Dilakukan dengan merendam organ di dalam inkubator dengan suhu tetap
(60°C) dalam parafin cair yang diisikan pada botol film. Organ kemudian
diletakkan dalam botol film berisi parafin cair sebanyak 2 kali pengulangan, masing-
masing selama 2 jam.

Gambar 2. Blok jaringan di dalam parafin

8. Penyayatan (Sectioning)
Pencetakan dilakukan dengan cara merendamkan organ dalam cetakan blok
parafin, setelah mengering lalu dipotong ( pemotongan blok parafin menggunakan
pisau yang telah di panaskan di atas api, dengan tujuan agar parafin tidak rusak)
sesuai sedemikian rupa berbentuk persegi dan di lekatkan pada sebuah balok kayu
yang berukuran kecil, blok tersebut di beri label dan siap di sayat menggunakan
mikrotom. Merendam organ dalam cetakan blok parafin,lalu blok tersebut diberi
 label dan siap di sayat menggunakan rotary microtom. Tebal sayatan yang umum
berkisar 6 – 15 mikron ( 1 mikron = 0,001 mm ).

Gambar 3. Mikrotom dan blok jaringan (a = blok jaringan ; b = pisau mikrotom)

Cara melakukan pemotongan :

a. Sebelum dilakukan pemotongan, blok jaringan dimasukan kedalam plastik
yang diisi air dan letakkan di freezer ±15 menit atau diberi batu es.
b. Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikrotom.
Kemiringan : ±300 , Tebal blok paraffin ± 2-5mikron.
c. Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung)
dimasukkan kedalam waterbath yang diisi air yang sudah dihangatkan 500 C,
kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan potongan di waterbath
tidak boleh terbalik).

Macam – macam bentuk pemotongan jaringan :

a. Longitudinal Section / LS atau memotong vertikal dari atas ke bawah
b. Transversal Section / XS atau memotong horizontal dari kanan ke kiri
c. Miring

9. Penempelan dan Afiksasi (Affixing) (Dasumiati 2008) :

 Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca
objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk
menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalah Mayers albumin yang formulanya
adalah sebagai berikut :
 Putih telur sebanyak 5o bagian
 Gliserin sebanyak 50 bagian
 Kristal Tymol beberapa butir
 Akuades beberapa tetes

10. Pewarnaan (Staining)

Umumnya dalam pewarnaan histopatologi digunakan cat Hematoxylin-Eosin (HE)
disamping cat khusus (PAS, gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus
yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll).

Gambar 4. Peralatan pewarnaan (staining jar)

Pewarnaan yang digunakan adalah Haematoksilin eosin (HE). Pewarnaan

dilakukan di dalam staining jar dengan seri larutan sebagai berikut:

a. Deparafinisasi
b. Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit.Setelah itu
dikeringkan pinggir jaringan dengan kain kasa.
c. Rehidrasi
Preparat masuk ke alkohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit
d. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengalir ditampung dalam wadah ).
Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup
e. Pengecatan Inti 7 menit. Preparat masuk ke dalam Meyer Hematoksilin
f. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengali ditampung dalam wadah ).
Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup.
g. Counter Stain . Preparat dimasuk ke larutan Eosin 7 celup
h. Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup
i. Dehidrasi
Preparat masuk ke dalam alkohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup
Setelah itu dikeringkan dengan kain kasa sekitar jaringan dan tunggu sampai
kering.
j. Clearing
Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit

11. Mounting, yaitu penutupan kaca objek setelah ditetesi Entellan atau Canada
Balsam tujuan Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet
jaringan dari mikroba dan bakteri.
B. Bagan dari preparasi jaringan Histologi dengan tehnik sayatan

PENGAMBILAN SAMPEL
ORGAN

PENCUCIAN SAMPEL
ORGAN

FIKSASI

DEHIDRASI

PENJERNIHAN

EMBEDDING

PENYAYATAN

AFIKSASI

PEWARNAAN

MOUNTING
C. Pembuatan preparat histologi tanpa sayatan
1. Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)
Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan
organisme (baik hewan maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ,
maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa ,potongan syaraf,pembuluh
darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui metoda ini diusahakan agar
kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format-format taga
dimensinya. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat
transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran
pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan
transparan akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih
dari 30 kali. Sediaan dengan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat
perbesaran 100 kali. Sediaan permanen dengan ketebalan 0,2 mm atau lebih yang
telah di dehidrasidan diberi media pelekap memerluka adanya suatu penunjang gelas
penutup agar spesimen tidak menjadi rusak dan gelas penutupnya sendiri tidak pecah
karena proses pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini umum
pula digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga
dihasilkan cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan tinggi serta
ketebalan speimen. Tepi tempat pemotongan sebaiknya dihaluskan dengan
mengunakan kerrtas amplas (Gunarso, 1989 cit. Imron 2008).
Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan
diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan (Joyner 2008
dalam zaifbio 2010 cit. Imron 2008). Jadi pada metode ini, preparat yang diamati
adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu.
Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya
seperti ketika organisme tersebut masih hidup sehingga pengamatan yang dapat
dilakukan hanya terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode pembuatan
preparat yang digunakan untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari
struktur vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman
tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai preparatnya.
Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil sehingga dapat termuat
pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan
pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole mounth mempunyai
kelebihan dan kelemahan masing-masing.
 Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan
jelas tiap bagian-bagiannya, sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa
dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar
Menurut (Gunarso 1989 cit. Imron 2008).

2. Metoda Sediaan Urai

Pengertian menguraikan adalah melakukan pemisahan-pemisahan komponen
suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan
jarum pengurai. Dengan demikian uraian disini diartikan sebagai pembedahan dalam
skala kecil, tingkatannya berbeda antara pembelahan biasa dan pembelahan pengurai.
Uraian ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi tetapi belum
memperoleh proses pewarnaan, maupun pada jenis sediaan yang telah difiksasi dan
mengalami pewarnaan. Sebelum uraian biasanya dilakukan berbagai tindakan
pendahuluan, misalnya dengan pelunakan tisu keseluruhan ataupun sebagian saja
dengan jalan perendaman dalam air atau jenis larutan tertentu. Perlakuan pendahuluan
yang umum dilakukan adalah adalah maserasi.
Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah
darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta
beberapa lainnya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri
dalam melakukan pengulasa atau penyebaran pada kaca preparat. Untuk jenis cairan
yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya umumnya dicairkan dengan air
atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10 (Gunarso, 1989 cit. Imron
2008).

3. Metoda Sediaan Ulas

Beberapa jenis tisu dapat disapukan rata pada kaca preparat untuk kemudian
diamati baik setelah terlebih dahulu diberi maupun tanpa perwarnaan. Contoh terbaik
pada metoda ulas ini adalah darah. Secara umum, jenis cairan yang berisikan sel-sel
ataupun komponen-komponen tertentu. Melalui metoda sediaan ulas ini akan dapat
ditelaah dengan bantuan mikroskop. Secara umum jenis tisu yang biasa ditelaah
melalui metoda ulas ini adalah ; darah, limfa, cairan sumsum tulang belakang, semen
jantan, sediaan air seni serta beberapa lainya. Masing-masing biasanya memerlukan
teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasan atau penyebarannya pada
kaca preparat. Untuk jenis larutan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya
 umumnya dicairkan dengan air ataupun serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1
: 10.

4. Metoda Sediaan Rentang

Pada metoda ini preparat sebelum difiksasi, diperlukan sedemikian rupa
sehingga disamping lebih jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui
perentangan. Jenis bahan siapan yang umum direntangkan pada saat difiksasi adalah
otot, syaraf dan jenis jaringan tipis seperti selaput pembungkus jantung, hati, saluran
pencernaan, dan lain-lain (Gunarso, 1989 cit. Imron 2008).

5. Metoda Sediaan Gosok

Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa
lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan. Untuk mengatasi
hal diatas tadi, maka umum dibuat jenis sediaan dengan metoda gosok. Tulang,
misalnya tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga berukuran beberapa
mili hingga 1 -2 cm. potongan atau serpihan tersebut kemudian digosok pada batu
gosok atau jenis lainnya hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop,
setelah terlebih dahulu diberi zat warna (Gunarso, 1989 cit. Imron 2008)

6. Metoda Sediaan Supravital

Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian
dan fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan
zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai
kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat
warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk
mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat pada
sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan.
Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah (Lasantha 2010 cit. Imron 2008) :
1. Satu tetes darah diteteskan pada kaca preparat
2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (misal Yanus Green) dengan konsentrasi 0,25%
dalam garam fisiologis.
3. Tutup dengan kaca penutup
4. Biarkan selama 5 menit
5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup.
 BAB III. PEWARNAAN

Pewarnaan bertujuan untuk menganalisis struktur jaringan yang telah diiris. Pewarnaan
rutin yang sering dikerjakan adalah haematoxylin-eosin (HE), karena pewarnaan ini dapat
menunjukkan sebagian besar struktur histologi.
 Afinitas hematein terhadap nukleus tidak baik, jika tidak menggunakan Mordant.
Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA
 Logam : Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead
 Tipe Mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir pewarnaan.

Ada delapan jenis larutan pewarnaan haematoxylin, yaitu Dellafied, Erlich,

Heidenhains, Harris, Mayer, Weigert, Carazzi, dan Cole. Masing-masing formula pewarnaan
memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Yang paling sering digunakan adalah
haematoxylin Mayer dan haematoxylin Harris.
Komposisi Haematoxylin Mayer :
 Kristal haematoxylin………………….... 1 gr
 Akuades……………………………… 1000 ml
 Sodium iodate…………………………… 0,2 gr
 Ammonium/potassium alum................. 50 gr
 Citric acid…………………………....…. 1 gr
 Chloralhydrate…………………………. 50 gr

Cara Pembuatan Hematoxylin Mayer :

1. Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam aquades.
2. Tambahkan Haematoxylin dan campurkan secara baik.
3. Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid, dan Chloralhydrate.
4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

Eosin adalah zat warna Xanthene. Eosin paling cocok dikombinasikan dengan pewarna
haematoxylin. Eosin memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk membedakan
antara sitoplasma dari tiap sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda.
Jenis Eosin :
 Eosin Y (yellowish), water soluble
 Eosin B (Bluish)
 Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
Eosin Y(yellowish) paling banyak digunakan, karena termasuk zat warna asam
sehingga dapat berikatan dengan protein (basa) dan dapat berpenetrasi pada struktur padat
dan bersifat metakromatik. Terdapat dalam 2 bentuk ,yaitu : monomer (merah) dan dimer
(orange merah). Hasil pewarnaannya yaitu : sitoplasma akan berwarna merah, eritrosit akan
berwarna orange merah, nukleus piknotik akan berwarna ungu, dan nukleolus akan berwarna
merah.
Komposisi Eosin :
Eosin-alkohol Stock 1% :
 Eosin y ws……………………………………… 1 gr
 aquades……………………………………………… 20 ml
 Larutkan dan tambahkan alkohol 95% ……….. 80 ml

Eosin working solution :

 Eosin-alkohol stock 1 bagian
 Alkohol 80% 3 bagian
 Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan Asam Asetat glasial 0,5 ml untuk
setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.

Hematoxylin memulas inti dan strukutur asam lainnya dari sel (seperti bagian
sitoplasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Hematoxylin akan
mewarnai nukleus sedangkan eosin akan mewarnai sitoplasma. Eosin bersifat asam, tidak
seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda.
Pewarnaan dengan Hematoxylin Eosin (HE) memberikan hasil : Nukleus berwarna biru
dan Sitoplasma berwarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen
tertentu
 BAB IV. MIKROTOM

Mikrotom merupakan perangkat penting dalam persiapan mikroskop, memungkinkan

untuk persiapan sampel untuk pengamatan di bawah cahaya yang ditransmisikan atau radiasi
elektron. Mikrotom menggunakan pisau baja atau kaca tergantung pada spesimen yang diiris
dan ketebalan yang diinginkan dari bagian yang dipotong. Pisau baja digunakan untuk
mempersiapkan bagian dari jaringan hewan atau tanaman untuk histologi mikroskop cahaya.
Pisau kaca digunakan untuk mengiris bagian untuk mikroskop cahaya dan untuk mengiris
bagian sangat tipis untuk mikroskopi elektron. Tingkat industri berlian pisau yang digunakan
untuk mengiris bahan-bahan keras seperti tulang, gigi dan materi tanaman untuk kedua
mikroskop cahaya dan mikroskop elektron. Gem kualitas berlian pisau yang digunakan untuk
mengiris bagian tipis untuk mikroskopi electron. Microtomy adalah metode untuk persiapan
bagian tipis untuk bahan seperti tulang, mineral dan gigi, dan alternatif untuk electropolishing
dan penggilingan ion. Bagian mikrotom dapat dibuat cukup tipis untuk bagian rambut
manusia di lebarnya, dengan ketebalan bagian antara 0,05 dan 100 mikron.
Secara umum, suatu mikrotom memilki bagian-bagian terpenting sebagai berikut:

a). Skala pengatur ketebalan sayatan biasanya terdapat di bagian kanan atas badan mikrotom,
skala ini dapat digeser ke kiri dan ke kanan sesuai dengan ketebalan sayatan yang
diinginkan.

b). Pisau mikrotom, merupakan komponen yang bisa menentukan kualitas sayatan.

c). Pegangan blok jaringan, merupakan komponen yang menghubungkan mikrotom dengan
blok jaringan yang hendak disayat.

d). Pengatur jarak berfungsi untuk mengatur blok jaringan dengan mata pisau.

Jenis – jenis mikrotom

Secara garis besar mikrotom dibagi menjadi dua golongan:

a). Mikrotom Schantz , yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat, blok jaringan yang
hendak disayat tetap diam di tempatnya sementara pisau melewati blok parafin tersebut.
Mikrotom ini tidak dapat menghasilkan pita sayatan, tetapi sayatan yang dihasilkan
selalu terpisah satu sama lain.
b). Mikrotom Spencer adalah mikrotom dimana pada saat menyayat dapat menghasilkan
pita sayatan yang panjang sehingga sangat cocok untuk pembuatan preperat sayatan
serial.

Jenis mikrotom yang paling umum digunakan adalah :

a. Mikrotom Putar baik untuk sayatan parafin dan teknik kriostat.

b. Mikrotom geser, baik untuk sayatan nitroselulase atau plastik.

c. Mikrotom klinis beku, digunakan di laboratorium klinis untuk keperluan diagnosis yang
bersifat segera.

d. Mikrotom sayatan ultra tipis, digunakan untuk menghasilkan sayatan dengan ketebalan
kurang dari 1 milimikron

e. Mikrotom base sledge, digunakan untuk menyayat jaringan yang sangat besar seperti otak

f. Mikrotom faust, menghasilakn ketipisan maksimal 254 milimikron

g. Mikrotom Smith dan Farguhur, digunakan untuk menyayat jaringan segar yang tidak
difiksasi.

Jenis-Jenis Mata Pisau Mikrotom :

 Wedge

 Planoconvex

 Biconcave

 Tool Edge

Jenis-Jenis Pisau Mikrotom :

 Stellite tipped

 Cobalt tipped

 Tungsten tipped

 Diamond

 Glass

 Disposible
 Cara Kerja mikrotom pemotongan adalah proses pemotongan blok preparat dengan
menggunakan mikrotom. Sebelum melakukan pemotongan serangkaian persiapan yang harus
dilakukan adalah :

1. Persiapan pisau mikrotom. Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan
dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik.
Pisau mikrotom kemudian diletakan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok parafin pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel. Letakkan
tempat duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada mikrotom.

2. Persiapan Kaca Objek. Kaca Objek yang akan direkatkan preparat harus telah diolesi
dengan zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa.

3. Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37oC – 40oC.

4. Persiapan sengkelit atau kuas.

Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut :

a. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom.
Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada
pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.

b. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya sudut
kemiringan berkisar 20-30 derajat.

c. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7
mikrometer.

d. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat
secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan hingga kita
mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan.

e. Pita parafin yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati menggunakan
sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur 37oC – 40oC dan
biarkan beberapa saat hingga pita parafin tersebut mengembang.

f. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada kaca
objek yang telah diolesi tadi dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam waterbath
dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan sengkelit atau kuas
 pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar
dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat.

g. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur 40oC –
45oC, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek
di atas hot plate sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek.

h. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek berisi
potongan parafin dan jaringan sampai saatnya untuk diwarnai.

Cara penggunaan mikrotom:

Beberapa penggunaan mikrotom :

1. Untuk mikroskop cahaya, material pertama-tama difiksasi dan dibekukan atau dibenamkan
ke dalam parafin. Bagian-bagian setebal 3u – 20u biasanya diiris dengan pisau baja.

2. Untuk mikroskop elektron, fiksasi diikuti dengan pembenaman dalam resin seperti
Araldine , bagian-bagian diiris dengan pisau gelas atau pisau intan ultramikrotom setebal 2
– 100 nm.
 DAFTAR PUSTAKA

Bevelander G : Ramaley JA.1988. Dasar-Dasar Histologi. Edisi Kedelapan. Terjemahan.

Erlangga. Jakarta.

Camphell N.A ; Reece J.B ; Mitchell L.G. 1999. Biologi. Edisi Kelima. Penerbit Erlangga.
Jakarta.

Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta

Elizabeth A ; Frederich LP. 2001. Cmparative Veterinary Histology Witg Clinical

Correlates. IowaState University. Press Ames.

Imron,TA.2008. Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Parafin. Laporan

Praktikum Mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Penerbit Erlangga. Jakarta