Teknik Pengolahan Spesimen

Histopatologi

Dinna Rakhmina, S.Si., M.Sc

Lab. Histopatologi
Memproses jaringan sehingga
terkemas dalam blok parafin
dan membuat sediaan
histologik dalam pulasan H&E

2
Penanganan Jaringan Pemeriksaan Histopatologik

⏷ Proses Pra Analitik

⏷ Proses Anatilik
⏷ Poses Post Analitik

3
Proses Pra Analitik

⏷ Dilakukan di kamar tindakan / klinik

⏷ Tanggung jawab pihak klinis
⏷ Merupakan syarat agar hasil pemrosesan bahan
pemeriksaan dan penanganan selanjutnya dapat
berlangsung baik

4
Penanganan Fase Pra Analitik

A. Kelengkapan identitas pasien dan keterangan klinik

yang relevan :
⏷ Administrasi
⏷ Cara mendapatkan bahan
⏷ Lokasi bahan – organ
⏷ Kondisi lesi

5
6
Penanganan Fase Pra Analitik
B. Penanganan jaringan :
⏷ Persiapan wadah yang besar sesuai dengan jaringan
yang akan disimpan, jaringan tidak boleh dipaksakan
⏷ Isi wadah dengan formalin 10 % buffer dengan volume
minimal 5 x volume jaringan
⏷ Masukkan sesegera mungkin jaringan segar ke dalam
wadah formalin (<30 menit)
7
8
9
10
Penanganan Fase Pra Analitik

⏷ Jika jaringan berukuran besar seperti mastektomi,

dilakukan irisan sejajar berjarak 1 cm agar seluruh
bagian jaringan terpapar formalin dan dilakukan
sedemikian sehingga masih bisa di rekonstruksi oleh
dokter PA.
⏷ Beri label identitas pasien dan jenis jaringan yang
diambil supaya tidak tertukar disertai formulir
pengantar yang telah diisi lengkap 11
0.5/1 cm

12
Penanganan Fase Pra Analitik

Tujuan fiksasi :
⏷ Mencegah autolisis dan pengaruh bakteri
⏷ Mempertahankan bentuk dan isi jaringan
⏷ Memungkinkan proses selanjutnya berjalan baik
⏷ Mempertahankan komponen-komponen jaringan / Sel
⏷ Fiksasi yang baik : unsur protein tetap ada / berkurang
minimal
13
Penanganan Fase Pra Analitik
Bahan fiksasi :
Formalin buffer 10 % dengan ph 7 •  Volume zat fiksasi
yang baik : 1 berbanding 5 sampai 10 volume jaringan
⏷ Formalin buffer 10 % dengan ph 7
⏷ Volume zat fiksasi yang baik : 1 berbanding 5 - 10
volume jaringan
Konsentrasi fiksasi :
⏷ Mempengaruhi kecepatan infiltrasi
⏷ Konsentrasi tinggi : infiltrasi cepat, jaringan menjadi
keras, menghambat penetrasi selanjutnya 14
15
Penanganan Fase Pra Analitik
Tanda jaringan terfiksasi sempurna :
⏷ Konsistensi jaringan keras
⏷ Berwarna putih / cokelat

16
17
Penanganan Fase Analitik
Dimulai sejak spesimen diterima di lab. Patologi Anatomi
 
⏷ Penanggung jawab dokter spesialis Patologi Anatomi
⏷ Terdiri atas 3 tahap :
1. Tahap penerimaan spesimen
2. Tahap pemotongan dan pencatatan makroskopik
3. Tahap pembuatan blok parafin

18
Tahapan Analitik Lab. Histopatologi
Pemotongan Prosesing
Pembuatan blok
jaringan → prx. jaringan min 18
parafin
makroskopik jam

Pemberian label Pemotongan

dan Proses blok parafin
mencocokkan pewarnaan (trimming – potong
tipis 2-4 µ) →
dengan formulir pendinginan, floating

Proses Proses
Pewarnaan
pembacaan pengetikan hasil
Histokimia? 19
mikroskopik & pengarsipan
Pemotongan Jaringan / Grossing

1. Cek status fiksasi jaringan

2. Potong jaringan tipis-tipis
3. Hindari trauma pada spesimen
4. Hindari kontaminasi antar spesimen
5. Hati-hati dengan alas/kertas pembungkus spesimen
6. Pemilihan kaset yang benar
7. Hindari kaset yang terlalu penuh
8. Pelabelan kaset yang jelas
20
 Jaringan paru

Jaringan hati

Cek status Potong tipis 2-3 Hindari trauma Hindari

fiksasi mm kontaminasi

Hati-hati dengan Pilih kaset yang Hindari kaset Label kaset jelas
alas/kertas terlalu penuh
21
22
23
24
25
26
27
Prinsip Dekalsifikasi

• Dekalsifikasi : suatu proses penarikan kalsium secara

perlahan-lahan pada spesimen yang mengandung tulang
• Larutan dekalsifikasi :
1. Asam lemah : Asam formiat 10%, EDTA dll. 
sumsum tulang
2. Asam kuat : Asam Nitrat 3-5%, HCl 3-5% dll 
tulang
28
Syarat Reagen Dekalsifikasi

• Dapat menghilangkan Ca
• Tidak merusak jaringan
• Tidak bereaksi dengan pulasan selanjutnya
• Bekerja cepat

29
Prosedur Dekalsifikasi (Asam Kuat)
• Potong jaringan hingga cukup kecil  hemat reagen &
mempercepat proses
• Masukkan lar. dekalsifikasi kedalam spesimen
volumenya 30- 60 kali besarnya spesimen
• Amati adanya gelembung udara saat proses
dekalsifikasi
• Gantikan setiap hari larutan dekalsifikasi agar
afinitasnya tetap baik.
• Ambil jarum/ iris dengan cutter  tentukan sudah
lunak atau belum
30
• Cuci dengan air mengalir sebelum lanjut ke processing
Prosedur Dekalsifikasi (Asam Lemah / EDTA)

• Sumsum tulang difiksasi dalam formalin buffer10%

selama 8-24 jam
• Pindahkan ke air selama 1 menit
• Direndam dalam EDTA sampai mengapung atau 2x24
jam
• Masukan dalam kaset
• Rendam dalam air selama 1 menit
• Masukan ke dalam formalin untuk diproses
31
 Indikator Proses Dekalsifikasi

Note. Note.
Dekalsifikasi Needle Dekalsifikasi
Pada jaringan Dapat
yang belum menghambat
difiksasi Pulasan
dapat Immuno-
mengakibatkan Histokimia
kerusakan  beri
hebat pada catatan
jaringan

Cukup lunak
Gelembung udara (CO2) 32
 Processing

Fixation Dehydration Clearing Impregnation

33
Specimen Processing (Overnight)
• Fiksasi :
 Untuk mempertahankan morfologi dan jaringan sel
• Dehidrasi :
 Untuk menarik air dan zat fiksatif dari sel dan jaringan
 Menggunakan etanol dengan konsentrasi berbeda (70%, 80%, 96%
dan absolut)
• Kliring :
 Fase transisi antara dehidrasi dan infiltrasi menggunakan agen yang
dapat bercampur dengan baik antara etanol dan parafin → dengan
penarikan etanol dan impregnasi parafin
 Menggunakan xylene.
34
Specimen Processing (Overnight)
• Impregnasi (infiltrasi) :
 Mengganti cairan seluler dengan parafin pada titik
leburnya (60oC)
 Spesimen terendam dalam parafin cair
• Embedding :
 Menempatkan spesimen yang diproses dalam media
yang cukup kuat untuk potong tipis
 Menggunakan cetakan untuk membuat blok sesuai
dengan ukuran jaringan
35
Specimen Processing
Formalin Xilol I Xilol II
(1 jam) (1 jam) (1 jam)

Alkohol
Alkohol Xilol III
70% (1 jam) 100% (1 jam)
(1 jam)

Alkohol Parafin I
Alkohol
100%
80% (1 jam) (1 jam)
(1 jam)

Alkohol Parafin III

Alkohol Parafin II
100%
95% (1 jam) (1 jam) (1 jam) 36
(1 jam)
Embedding / Penanaman Jaringan

 Menempatkan spesimen yang

diproses dalam media yang
cukup kuat untuk potong tipis
 Menggunakan cetakan untuk
membuat blok sesuai dengan
ukuran jaringan

37
38
Alat & Bahan Embedding

39
Proses Embedding

40
Proses Embedding

41
Langkah-Langkah Embedding

• Siapkan parafin dispenser dengan parafin solid suhu 60°C

• Siapkan base mold dan spesimen pada suhu 60°C.
• Tekan kran parafin dispenser pada base mold secukupnya
• Ambil jaringan dengan pinset ,tanamkan pada bagian dasar base
mold
• Letakkan kaset diatas base mold yang sudah terisi jaringan
• Letakkan base mold yang berisi jaringan pada cold plate
• Tunggu sampai base mould bisa dilepas

42
Perhatikan Saat Embedding !!!

• Pastikan nomor blok benar

• Ketahui jumlah kup yang ada
• Perhatikan seluruh bagian kaset  cegah jaringan tertinggal
• Waspada kontaminasi dengan sediaan lain  terbawa pinset

43
Peletakan Jaringan Saat Embedding

• Harus diletakan dengan benar untuk menghindari kesalahan

diagnosis karena bagian penting tidak terpotong  tidak terlihat
• Jaringan dipotong mengikuti permukaan yang dipotong
menghadap cetakan
• Gunakan lup untuk jaringan kecil yang butuh orientasi

44
Peletakan Jaringan Saat Embedding

• Kulit  diletakan sehingga seluruh

bagian dari epidermis hingga subkutis
terlihat
• Bagian dengan rambut/ bulu diletakan
pada sisi diagonal pisau

45
 Peletakan Jaringan Saat Embedding

• Jaringan yang memiliki lubang /

lumen diletakan melintang  donat
• Jaringan banyak dan compang –
camping (mis. kuratase, biopsy
prostat)  sejajar secara random pada
cetakan
• Jaringan dengan bentuk memanjang
diletakan menyilang

46
47
48
49
50
51
Trimming & Sectioning

⏷ Pada tahap pemotongan, pastikan bahwa mikrotom berfungsi

dengan baik
⏷ Blok parafin sebelum dipotong diletakan di atas cold plate, sudut
antara pisau dan blok (30-60°) biasanya yang sering dipakai 40°
⏷ Dilakukan potong trimming terlebih dahulu (potong tebal) untuk
jaringan berukuran kecil maka ukuran ketebalan trimming sekitar
15-25µm sedangkan jaringan berukuran besar sekitar 50µm
⏷ Setelah proses trimming selesai ukuran mikrotom dialihkan dengan
ketebelan 2µm dan mulai dilakukan proses pemotongan tipis blok
parafin.
52
 Water bath

Cold plate mikrotom

Hot plate
Langkah Kerja 53
 Water Bath
⏷ Water bath ditujukan untuk
mengembangkan jaringan
⏷ Parafin yang masih ada disekitar jaringan
tidak boleh meleleh dalam bak air
⏷ Suhu air dalam bak air 10 derajat dibawah
titik cair paraffin yang digunakan
(biasanya 40-50°C)
⏷ Dapat ditambah sedikit alcohol untuk
mengurangi tegangan permukaan
⏷ Tidak boleh terlalu lama meletakan
potongan jaringan dalam bak air (< 30
detik)
54
⏷ Bersihkan dengan tissue bila perlu
Perhatikan Saat Memotong (Mikrotom) !!!

1. Pakai pisau baru dan berkualitas

2. Optimasi pemakaian sudut pisau
3. Trimming blok perlahan
4. Hindari kerusakan akibat suhu terlalu rendah
5. Dinginkan blok sebelum dipotong
6. Potong blok secara perlahan

55
Pakai Pisau Baru Berkualitas

56
Optimasi Pemakaian Sudut Pisau

57
Trimming Blok Perlahan

58
Hindari Kerusakan Akibat Suhu Terlalu Rendah

59
Dinginkan Blok Sebelum Dipotong

60
Potong Blok Secara Perlahan

61
 Perhatikan Saat Flotation (Water bath) !!!

1. Pakai air bersih 7. Hindari kerutan pada potongan

2. Pastikan slaid bersih 8. Hindari kondisi over-expanding pada
3. Hindari kontaminasi antar spesimen potongan
4. Hindari kontaminasi dari teknisi 9. Jangan rusak potongan
5. Kerjakan blok satu per satu 10. Perlahan pilih potongan yang
6. Cek suhu air dikehendaki
11. Hindari terjadinya gelembung
12. Hati-hati ketika pengangkatan
potongan

62
Pakai Air Bersih

63
Pakai Slide Bersih

64
Hindari Kontaminasi Antar Spesimen !!!

jaringan otot jantung

jaringan tiroid

65
Hindari Kontaminasi Dari Teknisi !!!

66
Kerjakan Blok Satu Per Satu

67
Cek Suhu Air

68
Hindari Kerutan Pada Potongan

69
Hindari Kondisi Over Expanding Pada Potongan

70
Jangan Rusak Potongan !!!

71
Pilih Potongan Yang Dikehendaki

72
Hindari Terjadinya Gelembung

73
Hati-Hati Ketika Pengangkatan Potongan

74
Section Drying

⏷ Drainase sebelum keringkan

⏷ Monitor suhu pengeringan
⏷ Keringkan sesuai waktu pengeringan

75
Drainase Sebelum Dikeringkan

76
Monitor Suhu Pengeringan

77
Keringkan Sesuai Waktu Pengeringan

78
 Pulasan / Routine Staining (H & E)

• Pada prinsipnya : digunakan zat yang dapat membentuk ikatan baik

secara kimiawi, kadang fisik dengan zat yang akan dilihat
• Pulasan Hematoksilin – Eosin
 hematoksilin bersifat basa  terikat dengan asam nukleat dari inti sel
 eosin bersifat asam  berikatan dengan protein dari sitoplasma
• Eosin akan diserap terus oleh jaringan  makin merah
• Hematoksilin  memiliki titik jenuh, kekuatan tergantung umur zat
warna
• Hematoksilin dapat dikurangi warnanya dengan HCL
• Eosin ,mudah dilunturkan dengan air atau alkohol

79
 Alur Pulasan H & E
Xilol I Xilol II Alkohol 100% Alkohol 96% Alkohol 70%
Air mengalir
(5 mnt) (5 mnt) (5 mnt) (5 mnt) (5 mnt)

Lithium 1% alkohol- Meyer’s

Air mengalir Air mengalir
carbonate HCl (2-3 Air mengalir Hematoksili
(1 mnt) (1 mnt)
(1 mnt) celup) n (5-10 mnt)

Alkohol
Lihat di Eosin 1% Alkohol 80% Alkohol 90% Xilol I
1000%
mikroskop (30 dtk) (2 mnt) (2 mnt) (5 mnt)
(2 mnt)

Mounting Xilol III Xilol II

medium (5 mnt) (5 mnt)
80
Jar Pulasan Manual

81
Auto Stainer

82
Hasil Pulasan HE

83
Penggunaan Waktu Secara Akurat

84
Pemantauan Kualitas Pulasan Secara Reguler

85
Standarisasi Kondisi Pemulasan

86
Memastikan Kondisi Dewaxing Maksimal

87
Pembaruan Reagen Berkala

88
Menghidrasi Seluruh Spesimen

89
Monitoring Kualitas Hematoksilin

90
Memastikan ‘Pembiruan’ Inti Secara Komplit

91
Hindari Pulasan Eosin Yang Tdk Merata

92
Monitor pH Eosin

93
 Cover Slipping

• Dehidrasi sediaan secara menyeluruh sebelum clearing dan coverslipping

• Hindari pengeringan dan pembentukan kristal

94
Dehidrasi Sediaan Scr Menyeluruh Sblm Clearing
& Coverslipping

95
Hindari Pengeringan & Pembentukan Kristal

96
Penanganan Fase Post Analitik
• Pengetikan Hasil
• Penyerahan hasil ke dokter pengirim
• Arsip

97
Matching The Slides, Blocks & Forms

98