Dekalsifikasi Tulang

Mikroteknik
BIP2220|BIP223

Semester Genap TA. 2023/2024

Fakultas Biologi Unsoed
 Sub CPMK:

Diharapkan pada akhir kuliah Mahasiswa dapat:

1.mampu menjelaskan pengertian dekalsifikasi tulang, gigi
2.mampu menjelaskan sifat-sifat dan jenis-jenis tulang
3.mampu mengenal ciri-ciri, kebaikan dan kekurangan kemikalia
pada proses preparasi tulang
4. mampu mengenal dan memahami prosedur proses
dekalsiifikasi dan pengujian jaringan tulang sebelum tissue
processing
 Jaringan Tulang
• Tulang merupakan jaringan ikat yang
berfungsi sebagai pendukung kerangka tubuh,
pelindung, penggerak tubuh, menyimpan
mineral terutama kalsium dan fosfat,
pembentukan sel darah (hematopoiesis) dan
memproduksi osteocalcin.
• Jaringan tulang bersifat kaku namun memiliki
kekuatan yang sangat besar dan juga memiliki
elastisitas sangat terbatas.
 Jaringan Tulang
• Tulang, gigi & jaringan-2 yg mgd kapur, keras
 mgd calcium dihydroxyapetit u/tulang,
dentin u/gigi
• dapat dibuat sediaan dg 2 cara maserasi &
dekalsifikasi
• MASERASI ditujukan u/ membuat preparat
gosok
• DEKALSIFIKASI u/ membuat preparat irisan
dg metode parafin
 Preparat Tulang Gosok
• Hasil preparat gosok, kurang memuaskan tdk dpt
diperoleh jaringan yg benar-2 tipis
• Sukar u/memperoleh potongan melintang
• U/sediaan gosok, mula-2 tulang dimaserasi (direndam)
dlm air selama 2 hari  dikeringkan dlm oven 
tulang dibelah membujur  (bila melintang susah
dikerjakan) digosokkan pd batu pengasah, diambil
irisan setipis mungkin  jaringan tipis diambil 
letakkan pd gelas obyek  tutup dg canada
balsam/entelen new
 Proses Dekalsifikasi
• U/ sediaan dg tebal 6-8 mikronhrs
melalui tahapan DEKALSIFIKASI, u/
mghilangkan kapur dlm jaringanjar. mjd
lunakdpt diproses dg metode parafin
• Dg decalcificant, sejenis asam (Nitric acid,
formic acid, hidrochloric acid, trichloracetic
acid) dsb.
 Proses Dekalsifikasi

Figure : An example of a FAXITRON X-ray (a) before decalcification (b)

after decalcification is completed. The bright white in the sample is
calcium. As the calcium is removed, the bone becomes opaque. (Suvarna,
S.K et all., 2013)
 Proses Dekalsifikasi
• Proses ini dpt dikerjakan bersama-sama dg proses
fiksasi dlm satu waktu  fiksatif & decalcificant
dicampur mjd satu larutan  dpt pula scr terpisah;
fiksasi dulu, baru dekalsifikasi
• U/ pelajari sel-sel penyusun sumsum
tulanggunakan fiksatif-2 yg mgd chromat
potassium bichromat formalin buatan Moller atau
Orth atau buatan Kose
• Bisa jg dg campuran formalin-Zenker  lart.
Spuler-Maximow
 Proses Dekalsifikasi
• Decalcificant  nici-nitric acid konsentrasi 5-7,5%; HCl,
konsentrasi 8%; untuk formic acid konsentrasi 10%
(Lillie, 1954)
• Cairan 1 N HCl mgd 2,4 N HCOOH, yg mrpk decalcificant
yg aktif & efektif
• 1 N HCl dpt mengusir calcium dr tulang yg beratnya 1 –
2 gram, dlm waktu 12 – 24 jam pd suhu kamar; atau 6 –
8 jam pd suhu 37 0 C
• Dekalsifikasi pd suhu 37 0 C akan melemahkan
pewarnaan thd inti o/ alum haematoxylin & iron
haematoxylin-Weigert. Ttp pewarnaan sitoplasma o/
Eosin berhasil baik
 Proses Dekalsifikasi
• Pewarnaan Feulgen thd inti tdk berhasil baik
• Pewarnaan Azure-Eosin thd sitoplasma & inti
beraspek merah jambu
• Campuran formol-HCl, kemudian formic acid 5% jg
melemahkan pewarnaan Van Gieson & pewarnaan
Masson thd jaringan kolagen & matriks tulang
• Asam-asam mineral akan bekerja 2 – 3 kali > cepat
pd suhu 37 0 C drpd suhu 20 0 C, sdgk formic acid
bekerja > lambat
 Proses Dekalsifikasi
• Dekalsifikasi pd suhu 15 – 25 0 C o/
decalcificant formic acid, campuran formol-
HCl & jg asam mineral a/ dihasilkan suatu
pewarnaan yg memuaskan bila dgnk
pewarnaan-2 Van Gieson, Masson & azure-
eosin
• Pewarnaan Feulgen thd inti akan baik stlh
mgnk decalcificant formic acid pd suhu
kamar, ttp dg asam mineral pd suhu 20 0 C
atau bahkan pd suhu 30 C inti akan baur
 Menurut Clayden (1956), u/ mendptk jar.
Tulang yg baikperlu diperhatikan :
• Fiksasi
• Kesempurnaan dlm proses dekalsifikasi, tdk
terlalu lama dlm lart. dekalsifikan
• Kesempurnaan dlm proses pencucian
dekalsifikan
• Penanaman/embedding yg baik
• Ketajaman pisau
 FIKSASI jaringan TULANG
• Pilih tulang yg baik teksturnya  dipotong
mgnk pisau yg tajam, atau gergaji yg halus
 tebal potongan 5 mm
• Menurut Clayden, u/ fiksasi dgnk lart. Helly
atau lart. Zenker  ttp yg paling banyak adl
lart formalin 10%, krn lart. fiksatif
sebelumnya mgd sublimat a/ menyebabkan
pembengkakan jaringan tulang
 DEKALSIFIKASI Tulang
Ada 2 macam
• Nitric acid; menurut Clayden, konsentrasi 1 – 5 %
aquosa tulang yg didekalsifikasi dg asam ini
akan menjadi berwarna kuning

• Formic acid; konsentrasi 5 –10 % aquosa S>G>

1,2. Konsentrasi asam pd S>G> 1,2 adalah 90%.
Jadi u/ membuat formic acid 5 % diperlukan 5 ml
formic acid (S>G> 1,2, kons 90 %) ditambah dg 95
ml aquadest
 DEKALSIFIKASI Tulang
Ada 2 macam
• Dekalsifikasi dalam asam format (asam format 16
ml + formalin teknis 10 ml + akuades 174 ml)
dilakukan selama 24 jam atau sampai tekstur
tulang menjadi lunak.

• Dekalsifikasi dalam larutan asam format 10%

dilakukan selama 3 - 4 hari (tergantung ukuran
tulang).
Catatan
• Nitric acid memp. daya kemampuan menarik
kalsium > cepat drpd formic acid
• Pemulasan tdk begitu baik setelah mgnk
formic acid (Clayden 1056)
• Perlu diperhatikan, cairan dekalsifikan hrs
selalu diganti-ganti u/ mempercepat proses
 bbrp kali hrs diganti setiap hrinya tgt dari
jenis tulang & tua mudanya jaringan yg
didekalsifikasi
Yang terjadi apabila melakukan dekalsifikasi
dengan menggunakan Asam Nitrit melebihi
batas waktu yang ditentukan …
A. Akan mengurangi kualitas dari pewarnaan inti
B. Mempercepat proses dekalsifikasi
C. Preparat akan terwarnai dengan sempurna
D. Preparat menjadi rusak
E. Hasil Dekalsifikasi akan menjadi lebih sempurna

Kunci jawaban : A
 Test Dekalsifikasi
Untuk menentukan bahwa proses dekalsifikasi telah
berjalan sempurna
• Sinar-X  cara ini tdk sll dgnk, hanya u/ tulang yg
padat
• Penusukan dg jarumbbrp bagian dr jaringan
ditusuk dg jarum bila tlh lunakdekalsifikasi
berjalan dg baikjelk !! Krn dpt merusak jaringan
• Dengan deteksi kalsiumdasar dr metode ini
ialah cairan dekalsifikan yg habis dipakai dideteksi
kandungan kalsiumnya. Dekalsifikasi dikatakan
bejalan dg sempurna bila dlm cairan dekalsifikan
yg dipakai td sdh tdk mgd kalsium lagi
 Cara Deteksi Calcium
• Ambil 5 ml cairan dekalsifikan dr jaringan &
masukkan ke dlm tabung gelas
• Cairan ini hrs diambil dr jaringan yg telah
didekalsifikasi minimal 24 jam
• Selanjutnya ambil kertas litmus biru & celupkan
pd cairan tadishg berwarna merah
• Dg hati-hati tambahkan amonia kuat (0,880) &
kocoklah berlang kalishg kertas litmus yg tadi
sdh menjadi merah, dlm lart baru ini kembali
menjadi biru
• Ini berarti ada reaksi alkalis
 Cara Deteksi Calcium
• Sekarang tambahkan 0.5 ml lart amonia
oksalat jenuh & biarkan selama 30 menit
1. Bila pd penambahan amonia kuat, cairan
dekalsifikan mjd keruh  berarti di situ
Hasil masih banyak kalsium. Oleh krn itu
dekalsifikasi perlu dilanjutkan
2. Jika tidak keruh, berarti tidak terbentuk
endapan calcium oxalat; ttp perpanjangan
dekalsifikasi sebentar masih diperlukan shg
cairan dekalsifikan betul-betul jernih yg
berarti proses dekalsifikasi telah sempurna
 Menghilangkan Dekalsifikan dari Jaringan
• Setelah dekalsifikasi sempurna  asam
harus dihilangkanbila msh ada dekalsifikan
dlm jaringan, mk tdk akan diperoleh
pemulasan inti yg bagus
1. Nitric acid, dpt dihilangkan dg mercuri 2 kali dlm
alkohol 70% setiap 6 jam.Volume alkohol kira-
kira setengah dari jumlah dekalsifikan yg dgnk
2. Formic acid, dpt dihilangkan dg sodium sulfat 5%
atau Lithium sulfat 5%, kemudian dicuci dlm air
mengalir
 Dehidrasi & Embeding/Penanaman
• Spt jaringan pd umumnya, yaitu bhw dehidrasi
dikerjakan dg mgnk alkohol bertingkat, misal alkohol
70%, alkohol 95% selanjutnya alkohol absolut 2 kali
• Clearing/penjernihan dilakukan dg chloroform, tdk
dg xylol (Clayden, 1951)
• Proses infiltrasi parafin dlm oven seyogyanya
secepat mungkin. Ttp menurut Clayden u/
memperoleh hasil yg baik dlm proses infiltrasi
jaringan hrs ditinggal dlm parafin cair selama lebih
kurang 8 – 10 jamakan terpotong dg mudah bila
pisau mikrotom baik
 Prinsip pewarnaan Tulang (Clayden,1951)
1. Deparafinisasi dg mgnk xylol dingin, selama 1 – 2
menit
2. Cuci dg alkohol absolut, selama 10 – 20 detik
3. Tutuplah irisan jaringan dg 0.5 – 1% seloidin
4. Hilangkan kelebihan seloidin, & kemudian kering di
udara atau dg alkohol : eter = 40 : 60kmd dg
alkohol absolut  clear dg xylol
5. Masukkan irisan dlm air dingin u/ mengeraskan
seloidin
6. Irisan siap diwarnai
 Pewarnaan Tulang

Figure : (a) Mayer’s hematoxylin and eosin. (b) Ehrlich’s hematoxylin and
eosin. Epiphyseal growth plate from proximal femur of an 11-week-old rat.
 Pewarnaan Tulang

Figure : Toluidine blue-stained Figure : Surface-stained canine

articular cartilage and bone. Formic
acid-decalcified rat femur. Paraffin
section (Suvarna, S.K et al., 2013)
bone. Rapid bone stain
counterstained with van Gieson’s.
Bone (red), osteocytes and giant
osteoclasts (blue). Under-calcified
methyl methacrylate-embedded
ground section. (Suvarna, S.K et al.,
2013)
 Pewarnaan Tulang

Gambar A,B,C, Preparat Gosok Tulang Pewarna kulit Buah Naga Merah (warna Ungu)

Gambar G,H,I, Preparat Gosok Tulang Pewarna Daun Jati Muda

(warna Coklat Kehijauan) 400x) (Wahyuni S., 2015)
 Pewarnaan Tulang
Pembuatan Preparat Histologi pada Larva Ikan Gurami :
Proses dekalsifikasi dengan Trichloroacetid acid 5 %
-Larva umur 10 – 20 hari  24 jam

Gambar Larva gurami tahap umur 20 hari dengan pewarnaan Haematoxylin

eosin; perbesaran 100 – 1000 (Setyawan P., 2008)
 Pewarnaan Tulang
Pembuatan Preparat Histologi pada Larva Ikan Gurami :
Proses dekalsifikasi dengan Trichloroacetid acid 5 %
-Larva umur 30 – 60 hari  36 jam

Gambar Larva gurami tahap umur 40 hari dengan pewarnaan Haematoxylin eosin;
perbesaran 100 – 1000 (Setyawan P., 2008).
 Pewarnaan Tulang
Pembuatan Preparat Histologi pada femur Katak Sawah
(Fejervarya cancrivora), proses dekalsifikasi dengan larutan Asam
Format 10% selama 3-4 hari.

Gambar histologi tulang femur katak sawah pewarnaan hematoksilin (Sa’adatul

Amalia 2019).
SEKIAN ...
Terima kasih ...
Ada pertanyaan .. ???