Pewarnaan (Staining)

Zulham
Departemen Histologi
FK USU
2008
 Pertimbangan Pewarnaan
 Unsur yang akan didemonstrasikan
• Pigmen pengganggu
 Mis: melanin → bleaching
 Fixing fluid/fixatives
• Muller fluid → jaringan dicuci dgn air
mengalir selama 24 jam
• Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo
 Jenis Pewarnaan
 Hematoxyllin & Eosin
 Khusus
• Impregnasi perak
• Sudan → lipid
 Sitologik
• Pap test
• Blood smear
• Swab mucosa
 Imunohistokimia
 Haematoxyllin dan Eosin
 Paling banyak digunakan → rutin
 HE dapat menunjukkan sebagian
besar struktur histologi
 Demonstrasi nuklei adalah penting
 Variasi dalam hasil
 Haematoxyllin
 Penggunaan
• Pewarnaan Nuclei
• Struktur selain nuclei
 Jenis formula haematoxyllin untuk pewarnaan
nuclei
1. Dellafield (1885)
2. Ehrlich (1886)
3. Heidenhains (1896)
4. Harris (1900)
5. Mayer (1903)
6. Weigert (1904)
7. Carazzi (1911)
8. Cole (1943)
 Natural ripening vs artificial ripening
 Penggunaan mordant (aluminium, iron, atau
tungsten)
 Warna pertama adalah merah gelap, menjadi
biru (blueing) bila diperlakukan dgn alkali
lemah (air kran atau lithium carbonate)
 Methods are
• regressive
• Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm
• Counterstain (IHC)
 Special purpose
 Interchangeability
 Tidak bisa untuk counterstain atau
frozen section
• Harris, Ehrlich, Cole, Delafield
• Gunakan → Carazzi, Mayer, Harris ½ strength
Nuclear Staining
Haematoxyllin
 Haematein (oxidized haematoxyllin) adalah zat warna
 Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam)
 Haematoxyllin mewarnai nuclei
 Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa
mordant.
• Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA
• Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead
• Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan
hasil akhir pewarnaan
 Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan
• Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant
 Ehrlich haematoxyllin
 Formula
• Haematoxyllin 80 g
• Alcohol 2400 ml
• Potassium alum 240 g
• Akuades 1200 ml
• Glycerol 1200 ml
• Glacial acetic acid 120 ml
• Larutkan haematoxyllin dalam alkohol. Larutkan alum dalam
air (panas); saat hangat tambahkan gliserol dan biarkan
hingga dingin. Tambahkan larutan haematoxyllin dalam volume
kecil ke larutan alum, kocok setiap kali menambah.
Tambahkan asam asetat dan kocok.
• Larutan ditaruh dalam botol kaca jernih hingga “matang”
setelah 6 - 8 minggu. Botol ditutup tapi tidak rapat.
 Banyak “care” tapi hasil lebih tepat.
 Tahan lama, beberapa tahun
 For demonstrating
• Fine nuclear chromatin
• Tissue that had been fixed too long
• Subjected to fierce acid decalcification
 Kekurangan
• Masa ripening lama (6 – 8 minggu)
• Waktu pewarnaan lama: + 45 menit
• Tidak untuk frozen sections karena alkohol (+)
• Cukup mahal, banyak menggunakan haematoxyllin dan
gliserol
 Heidenhain haematoxyllin
 For sections that was fixed
• too long (time)
• by osmium tetroxide
• And spent too long in decalcying fluid
• alcohol
 Demonstration of
• mitoses and fine nuclear detail,
• mitochondria,
• muscle striations,
• keratin
 Popular for photography
 Formulae
• Iron alum solution
 Iron alum 5g
 Akuades 100 ml
• Haematoxyllin solution
 Haematoxyllin 0.5 g
 Alkohol 10 ml
 Akuades 90 ml
• Ripening time: 4 weeks
 Staining time: 30’ – 24 hrs
 Harris haematoxyllin
 Formula
• Haematoxyllin 1g
• Alcohol 10 ml
• Potassium alum 20 g
• Akuades 200 ml
• Mercuric oxide 0.5 g
• Glacial acetic acid 8 ml
• Larutkan haematoxyllin dalam alkohol. Larutkan alum dalam
air (panas). Campur kedua larutan bersama-sama; panaskan
hingga mendidih; tambahkan mercuric oxide. Dinginkan flask
dalam air dingin. Setelah dingin, tambahkan asam asetat.
 Kualitas baik: 3 – 4 bulan
 Half strength Harris hematoxyllin: tanpa asam asetat
glasial
 Harris HE
 Hasil
• Nuclei; calcium
deposits; bakteri:
biru
• Mucin; cartilage:
biru pucat – abu2
• Eritosit; eosinofil:
merah
 Mayer’s haematoxyllin
 Formula Haematoxyllin Mayer
• Haematoxylin kristal 1 gr
• Akuades 1000 ml
• Sodium Iodate 0,2 gr
• Ammonium/potassium alum 50 gr
• Citric acid 1 gr
• Chloral hydrate 50 gr
 Cara pembuatan Haematoxyllin Mayer
• Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades.
• Tambahkan hematoxyllin dan campurkan secara baik.
• Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate.
• Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
• Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.
 Weigert Haematoxyllin
 For sections of brain
 Formulae
• Weigert solution A
 Haematoxyllin 1g
 Alcohol 100 ml
 Ripening time: 4 weeks
• Weigert solution B
 30% aqueous solution of ferri chloride 4 ml
 Akuades 100 ml
 HCl jenuh 1 ml
• Weigert haematoxyllin (working solution)
 Mix equal volume of solution A and B, and use within 30
minutes
 Carazzi haematoxyllin
 Not intentended for use with eosin
 Formulae
• Haematoxyllin 0.5 g
• Glycerol 100 ml
• Potassium alum 25 g
• Akuades 400 ml
• Potassium iodate 0.1 g
• Larutkan haematoxyllin dgn gliserol. Larutkan potassium
alum dgn hampir semua akuades tanpa dipanaskan
(akan makan waktu). Campurkan dgn menambah
larutan alum dalam volume kecil pada larutan
haematoxyllin, kocok tiap kali menambah. Larutkan
potassium iodate dengan sisa akuades hangat dan
tambahkan ke campuran larutan. Kocok.
 Stabilitas: 4 – 6 minggu
Haematoxyllin Mixtures
Stain other structures than
nuclei
 Haematoxyllin mixtures
 Connective tissue
• Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin
 Elastic fibers
• Verhoeff’s method
 Myelin
• Kultschitzky
• Loyez
• Spielmeyer
• Weigert
 Copper and lead
• Mallory
• Parker
 Mucin
• Mayer’s mucihematein
 Eosin
 Zat warna xanthene
 Ikatan Van der Waals
 Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin
 Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk
membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan
serabut jaringan ikat yang berbeda
 Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol
 Jenis eosin
• Eosin Y (yellowish), water soluble
• Eosin B (Bluish)
• Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
 Eosin Y
 water soluble
 Paling banyak digunakan
 Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein
(basa)
 Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat
metakromatik
 Terdapat dalam 2 bentuk
• Monomer: merah
• Dimer : oranye-merah
 Hasil pewarnaan
• Sitoplasma: merah
• Eritrosit : oranye-merah
• Nukleus piknotik: ungu
• Nucleolus: merah
 Formula Eosin
 Eosin-alkohol Stok 1%
• Eosin y ws 1 gr
• Distilled water 20 ml
• Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
• Tambahkan 1 kristal thymol
 Working Eosin Solution
• Eosin-alkohol stok 1 bagian
• Alkohol 80% 3 bagian
• Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan
asam asetat glasial 0,5 ml untuk setiap 100 ml
larutan dan aduk dengan baik.
 Mewarnai Preparat
 Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit);
 Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) –
90%(2 menit) – 80% (2 menit) – 70% (2 menit) – air kran (3
menit);
 Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri
klorida mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam.
Deposit merkuri dapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan
diinkubasi dalam larutan iodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5
– 10 menit. Irisan dibilas dengan air lalu diinkubasi dalam sodium
thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci dengan air kran
mengalir.
 Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa
menit;
 Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit;
 Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin
working solution selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial
alkohol dengan gradasi meningkat
 Inkubasi dalam xylol 2x2 menit.
 mounting dengan entelan/balsam kanada.
 labelling
 Acid Alcohol Rinse
 Mengurangi warna biru hematoxyllin
(to differentiate nuclear staining)
 0.25 % acid rinse
• Akuades 975 ml
• HCl 25 ml
 HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)
 Blueing
 Air kran (yang alkalis)
• Jakarta: pH air kran adalah 7.8
 Lithium carbonate