Histoteknik Dasar dan Observasi dengan Mikroskopis

Kuliah 13
dr. Erna Sulistyowati

Histoteknik adalah metode membuat sajian histologi dari spesimen tertentu

melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian siap analisis.
Sumber jaringan :
1. Manusia
2. Hewan
Spesimen PK = darah, sumsum tulang, urin
Spesimen PA = jaringan
Rangkaian Proses
1. Pengawetan (fixation)
2. Dehidrasi (dehydration) → dikeluarkan air
3. Pembeningan (clearing) → dibuat jernih
4. Pembenaman (infiltration/impregnatuin/embedding)
5. Pengecoran (blocking/casting)
6. Pengirisan jaringan (sectioning)
7. Pewarnaan (staining)
8. Perekatan (mounting)
9. Pelabelan (labelling)
Pengawetan
1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis
2. Pengawetan jaringan
3. Pengerasan jaringan
4. Pemadatan koloid
5. Diferensiasi optik = visualisasi
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Cara melakukan fiksasi :
1. Supravital/intravital = bisa pada jaringan hidup (kultur sel = untuk melihat
pergerakan ion, pergerakan sel dkk) atau jaringan mati
2. Merendam dalam larutan fiksatif
Hal yang harus diperhatikan :
1. Tebal irisan
2. Volume larutan pengawet
3. Jenis larutan pengawet
Kelompok zat pengawet :
1. Formaldehyde = formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde
2. Picrates = picric acid → untuk pewarnaan mesostrikum (gapaham = 06.30,
kalau mau denger sendiri), digunakan untuk pewarnaan jaringan ikat
kolagen menggunakan Bouin’s solution
3. Mercurials = hell’s fluid (zenker formol)
4. Oxidizing agents = osmium tetraxide
5. Alcohol = methanol, alcohol (etanol)
6. Potassium dichromate = muller
Sesuaikan dengan spesimen yang mau diteliti
Jenis cairan fiksatif :
1. Formalin
2. Muller
3. Bouin
4. Carnoy
5. Zenker formal (cairan helly)
6. Etanol
7. Asam asetat-alkohol-formalin (tellyesniczky), dll
FORMALIN

• Yang digunakan adalah bentuk monomer = dibuat dengan

menetralkan/alkalis larutan
• Mengakibatkan crosslink protein
• Dilarutkan menggunakan formal saline, formal calcium, 10% neutral
buffered formalin, buffer formalin sukrosa

Histologi : menggunakan jaringan manusia, diberi 10% formalin, diwarnai

hematoeosin (HE), pembesaran 612x.
1. Sel lemak/fat globules = tampak kosong, karena pewarnaan HE
menyebabkan lemak larut
2. Fat cell nucleus = berada di tepi (seperti ring-cell/cincin dengan mata
cincin).
BOUIN

• Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering

• Mudah dikenali saat pemotongan → warna kuning
• Mempunyai daya penetrasi (kemampuan masuk ke jaringan) yang cepat
dan merata
• Jaringan mengalami pengerutan
• Di labelnya ada tanda mudah terbakar (tengkorak silang)

Histologi : Tikus, Bouin’s solution, HE, testis 400x

1. Inti = berwarna ungu
2. Sitoplasma = kemerahan
3. Tubulus testikularis berisi spermatozoid beserta tahapannya (kiri),
interstisial, ada jaringan penyokong yang memberi nutrisi untuk
spermatozoa (kanan)
ZENKER FORMOL (CAIRAN HELLY)

• Mengandung merkuri klorida

• Daya fiksasinya cepat dan kuat, kecepatan penetrasi berkurang setelah
meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang
melebihi ketebalan 5mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras
(rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi
lunak karena underfixed
• Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa, mitokondria
• Dalam memotong jaringan harus benar. Ex kita akan meneliti medula dan
korteks ginjal, maka potongannya dalah koronal (atas ke bawah)
Histologi : Rat, Helly Fluid, HE 162x
1. Elastic membrane = pemisah
tunika intima dengan tunika
media
2. Sel otot polos
3. Colagen
Jangan lupa beri skala
ETANOL

• Cytological fixatives
• Etanol 95%
• Digunakan untuk Pap test, swab
• Mempertahankan antigenisitas → cocok IHC (immunohisto Chemistry)
LARUTAN CARNOY

• Mengawetkan substansia Nissl (di korteks serebri) dan glikogen (untuk

mengetahui pewarnaan glikogen)
• Daya penetrasi cepat
• Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnosis perlu ditegakkan
dengan cepat, misal untuk diagnosis kanker saat pembedahan. Fiksasi
umumnya selesai setelah 1-2 jam, sedangkan potongan kecil selesai di
fiksasi dalam 15 menit.
• Efek pengerutan : kuat
Histologi : Mus musculus, Carnoy, Liver
1. Mus musculus = hewan pengerat
2. Liver = kita lihat pembesarannya, kalo besar, kita bisa
lihat lobulus ren, bila kecil hanya terlihat arteri sentralis, atau
trigonum krinan, sel kupfer, sel hepatosit
Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan khusus
:
1. Tulang = dekalsifikasi/dilunakkan → kalsium harus
dibuang menggunakan formic acid 8%
2. Kulit = teknik lendrum
• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%
• Fenol 4% dalam akuades (v/v = volume per volume. Misal fenol 4 cc,
maka akuadesnya 96 cc) selama 1-3 hari
Dehidrasi
Tahapan dehidrasi (menghilangkan air), caranya adalah mencelupkan dalam
alkohol
1. Cara 1 :
• Alkohol 70% 3 hari (3x ganti)
• Alkohol 95% 3 hari (3x ganti)
• Alkohol 100% 3 hari (3x ganti)
2. Cara 2 :
• Alkohol 70%, 80%, 90% masing-masing 1 hari
• Alkohol 95% 2 hari (2x ganti)
• Alkohol 100% 2 hari (2x ganti)
Sukrosa 20% (untuk cryostat / potong beku) ; sukrosa 20% selama 2 hari
Metanol : jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol
Aseton : 3x20 menit
Xylene/xylol
Pembeningan / Clearing
Bahan yang digunakan :
1. Cedar wood oil
2. Chloroform (bahaya = bisa menyebabkan infertil / mandul )
3. Benzene/benzol
4. Benzyl benzoat
5. Methyl benzoat
6. Xylene/xylol
7. Toluene
CEDAR WOOD OIL

• Sifat clearing paling baik

• Tak mengeraskan jaringan :
1. Jaringan yang halus sangat baik
2. Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringan ikat padat)
• Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan)
CHLOROFORM

• Keuntungan :
1. Paling sering dipakai
2. Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa mengeras)
• Kerugian :
1. Titik akhir tak dapat terlihat
Saat menjadi bening dan transparan tak jelas
Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang
2. Lebih mahal dari xylene dan benzene tapi lebih mudah dari cedar wood
oil
BENZYL BENZOATE

Metode :
1. Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringan tenggelam. Jaringan
menjadi bening dan transparan
2. Benzyl benzoat II selama 2-3 jam
3. Benzol-paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran benzol dan paraffin cair
dengan perbandingan sama
4. Masukkan ke dalam paraffin cair
METHYL BENZOATE

Metode :
1. Methyl-benzoat I sampai jaringan tenggelam
Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat
Jaringan mudah rapuh
2. Methyl benzoat II selama 1-2 jam
3. Benzol-parrafin. Campuran benzol dan paraffin dengan perbandingan sama
4. Masukkan ke dalam paraffin cair
BENZELE DAN XYLENE

1. Keuntungan
- Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam
- Benzene lebih lambat dari zylene tetapi kerapuhan jaringan lebih
berkurang dibanding xylene
2. Kerugian
- Karsinogenik
- Baunya sangat menyengat → harus menggunakan APD

3. Metode
- Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan transparan
- Volume 50-1000 kali volume jaringan
- Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair
TOLUENE

• Sama dengan xylene tetapi lebih lambat

• Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi jaringan
• Mudah menguap
Pembenaman
• Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening (clearing agent)
dari jaringan dan menggantikannya dengan paraffin
• Dilakukan menggunakan paraffin oven → dicetak menggunakan dispenser
→ dicetak → pindahkan ke ice cube supaya cepat beku
• Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam jaringan sehingga saat
dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek
• Teknik :
1. Paraffin/paraplast I selama 2 jam
2. Paraffin/paraplast II selama 1 jam
3. Paraffin/paraplast III selama 2 jam
• Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan pengecoran (blocking)
Pengecoran (Blocking/Casting)
Alat cetak :
1. Besi potongan terbentuk L (leuckhart)
2. Susun 2 buah potongan besi di atas lembaran logam sehingga membentuk
ruang kubus
3. Tuang sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor
4. Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris
5. Tuang paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya
6. Hindarkan terbentuknya air bubble
7. Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold)
8. Spatula untuk melekatkan blok paraffin
9. Beri label identitas jaringan saat blocking
Gunakan media pencetakan sesuai ukuran. Kalau udah dingin, masukkan ke
casette
Pengirisan Jaringan (Sectioning)
Persiapan :

• Microtome knive vs microtome blade (disposable)

• Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan blok
parafin yang akan dipotong pada holder dengan menggunakan spatula
atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder berikut blok preparat pada
tempatnya di mikrotom.
• Siapkan coated slides :
- Albumin (putih telur)
- Gelatin
- SuperFrost
- Poly-L-Lysine
• Waterbath berisi air hangat 550C
• Sengkelit

Casette di iris menggunakan mikrotom kurang lebih 4-6 mikrometer. Bila terlalu
tebal → tidak bagus. Dipotong, nanti akan lengket, kita pilih sampai mendapat
potongan bagus.
Parafin blok di taruh di mikrotom, pilih ketebalan, lalu set mikrotom
Rendam di air hangat, tangkap dengan objek glass, keringkan di plat hangat
Pewarnaan (Staining)
Pertimbangkan pewarnaan :
Jaringan apa yang diwarna dan apa tujuannya
• Unsur yang akan di demonstrasikan :
1. Pigmen pengganggu = ex, melanin → bleaching
 • Fixing fluid/fixatives
1. Muller fluid → jaringan dicuci dengan air mengalir selama 24 jam
2. Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo
Jenis Pewarnaan
1. Hematoxylin dan eosin (rutin)
2. Khusus
- Periodic acid-Schiff (PAS), phosphotungsic acid haematoxylin (PTAH),
impregnasi perak
- Oil red O → lipid
- Masson’s trichrome → kolagen
3. Sitologik / sel
- Pap test
- Blood smear
- Swab mucosa
4. Imunohistokimia

1. Gambar kiri atas = gambar liver dengan glycogen storage disease,

pewarnaan PAS
2. Gambar kanan atas = miokard infark, diskus interkalatus terlihat garis-garis,
nekrosis, pewarnaan PTAH
3. Gambar kanan bawah = lipid deposition di jaringan liver. Lipid berwarna
jernih
4. Gambar kiri bawah = grocott’s methenamine silver stain, terlihat seperti
lingkaran bola hitam pada granuloma
HEMATOXYLIN DAN EOSIN

• Paling banyak digunakan

• Dapat menunjukkan sebagian besar struktur histologi
• Demonstrasi nuklei
• Variasi dalam hasil
 • Nukleus warna ungu, eosin warna merah
• Natural ripening vs artificial ripening
• Artificial ripening : penggunaan mordant (Al, Fe, atau Pb)
• Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru (blueing) bila diperlukan
dengan alkali lemah (air kran atau lithium carbonate)
• Metode :
- Regressive
- Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm
- Counterstain (IHC)
HEMATOXYLIN

• Penggunaan :
- Pewarnaan nuclei
- Struktur selain nuclei
• Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan nuclei :
1. Dellafield (1885)
2. Ehrlich (1886)
3. Heidenhains (1896)
4. Harris (1900)
5. Mayer (1903)
6. Weigert (1904)
7. Carazzi (1911)
8. Cole (1943)
Haematoxylin Mixtures

• Connective tissue
- Mallory phosphotungsic acid haematoxylin
• Elastic fibers
- Verhoeff’s method
• Myelin
- Kultschitzky
- Loyez
- Spielmeyer
- Weigert
• Copper and lead
- Mallory
- Parker
• Mucin
- Mayer’s mucihematein
Biasanya tergantung kita mau mewarnai apa. Misal mau neliti myelin, maka pakai
larutan kultschitzky, loyez, dll.
FORMULA HEMATOXYLIN MAYER

- Haematoxylin kristal 1 gr
- Akuades 1000 ml
- Sodium iodate 0,2 gr
- Ammonium / potassium alum 50 gr
- Citric acid 1 gr
- Chloral hydrate 50 gr
Cara pembuatan :
1. Larutkan amonim/potasium alum dalam akuades
2. Tambah haematoxilin dan campurkan / aduk
3. Tambah sodium iodate, citric acid, dan chloralhydrate
4. Campur dan aduk hingga tercampur baik
5. Biarkan semalam dan saring besoknya
EOSIN

• Zat warna xanthene

• Ikatan Var Der Waals
• Paling cocok dikombinasikan dengan alum haematoxilin
• Memiliki nilai kemampuan diferensiasi sendiri untuk membedakan antara
sitoplasma dari tipe sel dan serabut jaringan ikat yang berbeda
• Diferensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol
• Jenis :
- Eosin Y (yellowish), water soluble
- Eosin B (bluish)
- Ethyl eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
EOSIN Y

• Water soluble
• Paling banyak digunakan
• Zat warna asam, berikatan dengan protein (basa)
• Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat metakromatik
• Terdapat dalam 2 bentuk :
- Monomer = merah
- Dimer = oranye-merah
• Hasil pewarnaan
- Sitoplasma = merah
- Eritrosit = oranye-merah
- Nukleus piknotik = ungu
- Nukleolus = merah
Formula
• eosin alkohol stok 1%
• eosin y ws 1 gr
 • distilled water 20 ml
• larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
working eosin solution :
• eosin-alkohol stok 1 bagian
• alkohol 80% 3 bagian
dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0,5 ml untuk
setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik
mewarnai preparat

Lanjutan :
• mounting dengan entelan/balsam kanada
• labelling
keterangan :
saat mewarnai, parafin dihilangkan (deparafinisasi)
 Sel goblet
yang larut

ACID ALCOHOL RINSE

• Mengurangi warna biru haematoxylin (to differentiate nuclear staining)

• 0,25% acid rinse
- akuades 975 ml
- hcl 25 ml
• HCL 1% dalam alkohol 70% (v/v)
BLUEING

• Air kran (yang alkalis)

- Normal : pH air kran 6,5-8,5
- Lithium carbonate
1. Lithium carbonate 0,5 gr
2. Akuades 1000 ml
Campurkan dengan baik
Labelling
• penamaan preparat
• Persiapkan penamaan sesuai
- Kelompok
- Jenis jaringan
- Urutan sampel/hewan coba
Langkah Menggunakan Mikroskop

• Pegang lengan mikroskop dengan salah satu tangan, tangan lain

menyangga kaki mikroskop
• Putar revolver sehingga diperoleh perbesaran terkecil
• Letakkan preparat, jepit
Mencari fokus

Kalau ga dipake, matikan lampu dulss