clearing solution (chloral hydrate/glycerol,

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Clearing

Herr clearing solution
Pewarnaan lugol

paraformaldehyde lar fiksatif

• Clearing merupakan proses perendaman bertujuan agar struktur preparat terlihat jernih dan
transparan saat diamati dibawah mikroskop
• Spesimen yg dibuat pertama-tama haris dimasukan ke dalam larutan fiksatif yang bertujuan
untuk penguatan sehingga mencegah terjadinya perubahan selama proses pembuatan preparat.
• Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akandiamati dengan
mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang
diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu.
• Tujuan: untuk mempelajari keadaan morfologi atau struktur hewan, kepentingan taksonomi
ataupun mendeteksi adanya kelainan yang terjadi pada masa perkembangan hewan.
• Spesimen yang sering dibuat preparat dengan metode ini antara lain algae, fungi berbentuk
benang, algae dengan talus tipis, bryophyta, protalium, paku, irisan epidermis dan atau
batang, dan polen.
• Tentu saja organ yang diamati haruslah berukuran kecil sehinggadapat termuat pada objek
glass.
• Faktor whole mount: ukuran, ketebalan, serta tingkat transparansi sediaan yang kita buat
tersebut berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan melalui mikroskop nantinya.
• Kelebihan metode iniadalah dapat mengamati seluruh bagian dengan jelas tiap bagian-
bagiannya.
• Kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada hewandengan ukuran yang
kecil saja. Larutan yg digunakan:
1. Larutan fisiologis (salin) untuk clearing
2. L. alkohol 70%-asam (HCl 0,1 % dalam alkohol 70%). (membersihkan lar fisatif alkohol
70%) (alkohol-asam untuk proses dehidrasi)
3. L. fiksatif formol-nitrate (larutan fiksatif)
4. fiksatif Bouin (pikro-sulfat). (lar fisatif)

• Tujuan fiksasi adalah untuk mematikan sel- sel dalam jaringan tanpa merusak bentuk dan
struktur-strukturnya, melindungi kehancuran dari larutan-larutan berikutnya dan menunjukkan
perubahan yang disebabkan oleh diferensiasi optik karena pengantian indeks bisa serta
membuat sel- sel dalam jaringan menjadi keras. Dengan adanya proses fiksatif ini akan
menudahkan kita untuk melakukan pewarnaan dan perlakuan lebih lanjut karena organ tidak
lunak lagi.
• Sebelum pewarnaan, direndam dalam lar alkohol 50%, 30% masing2 selama 0,5 jam lalu
perendaman dg akuades 0,5 jam. Tujuan: rehidrasi sel2
• Fiksasi--> pencucian (aqudes) dan pewarnaan--> pencucian dengan air kran untuk
melunturkan pewarna---> dehidrasi--> penjernihan--> mounting
• Dehidrasi: proses pengambilan air dlm jaringan. Banyak air selama proses fiksasi dan
pencucian menghalangi proses selanjutnya, jadi air mesti diambil. (alkohol-asam) secara
bertingkat.
• Penjernihan/dealkoholisasi/clearing: untuk menghilangkan alkohol dr dehidrasi
menggunakan terpinol (minyak esensial dari tanaman lilac) Biasanya alkohol:xylol
• Mounting: meletakkan zat perekat di antara kaca benda dan kaca penutupsehingga obyek
atau irisan tnggal tetap, permanen di dalamnya dan dalamkeadaan transparan, untuk
pemeriksaan di bawah mikroskop. Zat perekat (mounting media/adhesive) yang digunakan
untuk mounting adalah balsam kanada atau gliserol. Tujuan: penutupan sampel ini akan
membuat preparat dapat bertahan lama, bisa sampe 2-5 tahun

SMEAR
• Pembuatan preparat dengan mengoles/membuat selaput (film) dari substansi yang berupa
cairan/bukan cairan diatas objek glass bersih dan bebas lemak untuk selanjutnya difiksasi,
diwarnai dan ditutup gelas penutup
• Disebut metode apusan darah
• contoh:

SQUASH
• Pembuatan preparat dengan memencet suatu potongan jaringan/ organisme keseluruhan
sehingga didapakan sediaan yang tipis untuk diamati di mikroskop. Digunakan ntuk jaringan
yg sel2nya mudah lepas.
• Contoh: pengamatan inti sel/kromosom dengan tujuan untuk mengamati proses pembelahan
sel/mitosis dan mempelajari fase-fasenya
• Tahap:
1. Dipotong ujung akar
2. masukin ke lar fiksatif (lar alkohol dan as. asetat 3:1)
3. Hidrolosis lamela tengah
4. Maserasi
-Pewarnaan
-Penutup

Tanpa pretreatment:
• Fiksasi dengan etanol/metanol di ruang dingin selama 24 jam dan bisa beberapa
hari/beberapa minggu. Larutan farmer: etanol/metanol : as.asetat glasial 3;1). Lar Carnoy
(Etanol : kloroform : as. asetat glasial 6:3:1)
• hidrolisis lamela tengah: asam klorida 60 derjat celcius. (4-5 menit) ga boleh lama bisa
ancur.
• dicuci dengan air selama beberapa menit
• pindahin ke slide bersih
• dilihat bagian ujung akar yg berwarna putih susu
• diberi pewarna acetorcein 2%
• ditutup
• di squash
• dilewatkan api 1 detik 3-4x

Pre-treatment bermanfaat dalam metode squash. Itu

pretreatment memiliki beberapa tujuan:
• Menghentikan formasi spindel
• Meningkatkan jumlah tahap metafase dengan penangkapan kromosom di pelat metafase.
• Menyempitkan panjang kromosom dengan jelas penyempitan
• Meningkatkan viskositas sitoplasma

• Pretreatment Air dingin diterapkan ke tanaman yang memiliki banyak kromosom.

Pretreatment cocok untuk kromosom sereal. (contoh pada akar)
masukkan ke dalam vial yang sudah diisi dingin air. Tutupi vial dengan lapisan es yang tebal.
Menjaga di lemari es selama 12 hingga 24 jam (4-5C suhu kulkas). Perawatan awal untuk
akar barley atau akar gandum direkomendasikan 16 masing-masing menjadi 18 jam dan 24
jam. Pretreatment lebih lama akan memendekan kromosom.

• 8-Hydroxyquinoline
1. Pretreatment dengan 8-hydroxyquinoline adalah efektif untuk tanaman dengan ukuran
kromosom kecil/pendek.
2. Akar tetap dalam 0,002 M 8- hydroxquinoline solusi selama 3-5 jam pada 16-18oC. Lebih
hangat suhu menyebabkan lengketnya kromosom.
3. 8-hydroxyqui-noline dibuat dengan cara dilarutkan 0,3-0,5 g 8-hydroxyquinoline dalam
satu liter ddH2O.

• Paradichlorobenzene (PDB)
Mirip dengan 8-hydroxyquinoline, PDB adalah yang terbaik bila diaplikasikan untuk tanaman
dengan ukuran kecil kromosom. Perawatan tersebut membutuhkan 1,5% PDB (dalam format
dH2O). Pelarutan 1,5% dilakukan pada suhu 60oC selama semalam. Root pretreatment
dilakukan saat larutan dingin dengan lama perlakuan 2-2,5 jam pada 15-20 oC atau RT.
Sebaiknya ditemperatur hangat, dilarutkan menggunakan beaker/erleyenmayer, diaduk
semalaman pada suhu 60C.
• Colchicine
Konsentrasi rendah kolkisin (0,1-0,5%), artinya 0,1 - 0,5 gram adalah
direkomendasikan untuk pretreatment (1-2 jam, di RT). Aplikasi kolkisin konsentrasi tinggi
menyebabkan poliploidi. Akar kedelai yang dierami selama 1,5 jam menghasilkan hasil
terbaik.
• α-Bromonaphthalene
Efek α-bromonaphthalene mirip dengan colchicines. Pretreatment menggunakan
αbromonaphthalene dalam kondisi jenuh selama 2 jam di kamar suhu. Perlakuan awal cocok
untuk kromosom gandum dan barley.
• Pretreatment-> fiksasi (lar Carnoy)-> cuci dengan air-> hidrolisis (hcl)-> pewarnaan
• Tujuan Pretreatment: Menghentikan pembentukan spindel, meningkatkan tahap metafase
dengan menahan kromosom pada plat metafase, meningkatkan kekentalan sitoplasma.
• Tujuan pelarutan (hidrolisis) lamela tengah: agar kromosom inti kelihatan. Hidrolisis lamela
tengah dilakukan dengan larutan asam.
• antera dipanen dan difiksasi di larutan FAA (formalin, acetic acid, alcohol)

Etanol 770% 90 ml, as. asetat glasial 5 ml, formalin 5 ml. Selanjutnya dimasukan ke larutan Carnoy,
lalu diberi pewarna acetocarmin, ditutup, dipencet lembut, dilewatkan di api.

• Pewarna biologi disimpan di botol gelap (aluminium foil)