I.

Judul Praktikum
Pemisahan Tetrasiklin HCl dan Vitamin B12 secara KLT.

II. Tujuan Praktikum

Mahasiswa mampu melakukan pemisahan campuran Tetrasiklin HCl
dan Vitamin B12 dalam sediaan menjadi komponen-komponennya
secara KLT.

III. Dasar Teori

Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas

komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi
masing-masing komponen di antara dua fase yaitu fase diam dan fasa
gerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat disebabkan
oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap
(adsorpsi) atau perbedaan distribusi di antara dua fasa yang tidak
bercampur (partisi).

Fase diam (stationary phase) merupakan salah satu komponen

yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena
adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi
(tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase diam dapat
berupa bahan atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau
cairan yang umumnya dilapisi pada padatan pendukung.

Fase gerak (mobile phase) merupakan pembawa analit dapat

bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak
ini tidak hanya dalam bentuk cairan tapi juga dapat berupa gas inert
yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah
menguap.

Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu

kecenderungan sebagai berikut; (a) kecenderungan molekul-molekul
komponen untuk melarut dalam cairan (b) kecenderungan molekul-
molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan halus
(adsorpsi/penyerapan) (c) kecenderungan molekul-molekul komponen
untuk bereaksi secara kimia (penukar ion). Komponen yang dipisahkan
harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk
berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya,
teradsorpsi, atau bereaksi secara kimia (penukar ion). Pemisahan
terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu
sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi
(analisis kualitatif), penetapan kadar (analisis kuantitatif), dan
pemurnian suatu senyawa (pekerjaan preparatif).

Kromatografi kolom adalah merupakan pilihan yang baik jika

ingin memisahkan campuran senyawa yang masih dalam bentuk
ekstrak. Alasannya adalah lebih murah dan tidak memakan waktu yang
lama. Hasil dari pemisahan menggunakan kolom kromatografi ini bisa
berupa fraksi-fraksi yang masih berupa campuran, dan bisa juga
menghasilkan senyawa yang telah murni. Kadang kala hanya dengan
menggunakan kolom kromatografi, target pemisahan campuran telah
berhasil dilakukan tapi akan mengalami kesulitan jika campuran yang
akan dipisahkan itu jumlahnya sedikit, karena ada kecenderungan
campuran tersebut akan tertinggal pada fase diam.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada dasarnya sangat mirip

dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya.
Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahnya, yakni diguankannya
lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca,
aluminium atau plastik sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis
adsorben ini pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam.

Teknik KLT dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan

Schaiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak
sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang
 fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai
kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam
pemisahan dan sensitive. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah
untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya

adalah silica gel, tetapi kadangkala bubuk selulosa dan tanah diatome,
kieselguhr juga dapat digunakan. Untuk fase diam hidrofilik dapat
digunakan pengikat seperti semen Paris, kanji, dispersi koloid plastik,
silica terhidarsi. Untuk meratakan pengikat dan zat pada pengadsorpsi
digunakan suatu aplikator. Sekarang ini telah banyak tersedia
kromatografi lapisan tipis siap pakai yang dapat berupa gelas kaca
yang telah terlapisi, kromatotube dan sebagainya. Kadar air dalam
lapisan ini harus terkendali agar didapat hasil analisis yang
reprodusibel (Khopkar, 2010:164).

Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan

dengan kromatografi kertas karena dapat digunakan teknik-teknik
umum yang lebih banyak. Kerapkali, noda tidak berwarna atau tidak
berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat ditampakkan dengan
cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod. Uap iod akan
berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia
atau berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.

IV. Uraian Bahan

A. Tetrasiklin HCl
Nama resmi : Tetracyclini Hidrochloridum.
Nama lain : Tetrasiklina Hidroklorida
 Pemerian : Serbuk hablur; kuning; rasa pahit; amfoter.
Kelarutan : Larut dalam 10 bagian air dan 100 bagian etanol
(95%) P; larut dalam air jika dibiarkan menjadi
keruh karena pengendapan Tetrasiklina; praktis
tidak larut dalam Kloroform P; dalam eter P dan
dalam aseton P; larut dalam larutan alkali
hidrosida dan dalam larutan alkali karbonat.
Khasiat : Penggunaan antibiotikum.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindung dari
cahaya. Jika dalam udara lembab terkena sinar
matahari langsung, warna menjadi gelap; larutan
dengan pH tidak lebih dari dua menjadi inaktif dan
rusak pada pH 7 atau lebih. Jika yang dimaksud
untuk injeksi, disimpan dalam wadah steril, tertutup
kedap.

B. Vitamin B12
Nama resmi : Cyanocobalaminum
Nama lain : Sianokobalamina
Pemerian : Hablur atau serbuk hablur; merah tua; tidak
berbau. Bentu anhidrat sangat higroskopik.
Kelarutan : agak sukar larut dalam air dan dalam etanol (95%)
P; Praktis tidak larut dalam kloroform P; dalam eter
P dan dalam aseton P.
Khasiat : Penggunaan vitamin.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindung dari
cahaya.
C. Eluen
1. Asam Asetat
Nama resmi : Acidum Aceticum
Nama lain : Asam asetat, asam cuka.
Pemerian : Cairan jernih; tidak berwarna; bau
menusuk; rasa asam; tajam.
Kelautan : dapat campur dengan air, dengan etanol
(95%) P dan dengan gliserol P.
Khasiat : Penggunaan zat tambahan.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.
 2. Air
Nama resmi : Aqua destilata
Nama lain : Air suling.
Pemerian : Cairan jernih; tidak berwarna; tidak berbau;
tidak mempunyai rasa.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

3. Etanol
Nama resmi : Aethanolum
Nama lain : Etanol danalkohol.
Pemerian : Cairan tak berwarna, jenih, mudah
menguap dan mudah bergerak, bau khas,
rasa panas. Mudah terbakar memberi nyala
biru yang tidak berasa.
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam
kloroform P, dan dalam eter P.
Khasiat : Penggunaaan zat tambahan.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung
dari cahaya, di tempat sejuk, jauh dari nyala
api.
V. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Lempeng KLT
b. Bejana Pengembang
c. Corong putih
2. Bahan
a. Tetrasiklin HCL
b. Vitamin B12
c. Eluaen

VI. Cara Kerja

1. Disiapakan larutan sampel, larutan baku tetrasiklin HCL dan
vitamin B12 dan larutan baku campurkan tetrasiklin HCL dan
vitamin B12 dalam etanol
2. Disiapakan fase diam silika gel Gf 254, potong sesuai ukuran
bejana pengembang.
3. Diberi tanda pada silika gel Gf 254 batas bawah dan atas
pengembang
 4. Dibuat larutan pengembang yang terdiri dari campuran butanol,
asam asetat, air ( 40 : 5 : 55 ) dengan mencampurkan dalam
corong pisah, hingga homogen, tunggu beberapa saat kemudian
lalu ambil fase butanolnya
5. Dimasukan eluen yang telah homogen tersebut kedalam bejana
pengembang, jenuhkan
6. Ditotolkan larutan sampel, larutan baku tetrasiklin dan larutan
baku vitamin B12 pada silika gel Gf 254 yang telah tersedia.
7. Dimasukan silika gel Gf 254 tersebut kedalam bejana
pengembang yang telah jenuh, kembangkan.
8. Dihentikan pengembangan bila sudah sampai batas
pengembangan, angkat dan keringkan. Hitung
Rfnya.
VII. Data Pengamatan
1. Perhitungan bahan untuk vitamin B12 dengan konsentrasi

500g
ditimbang 50 mg 50 mg 1 mg 1000 mcg
} ; =
dilarutkandalam 50 mg 50 mL 1ml 1 ml

Diambil 25 mL hasil larutan

Dilarutkan 50mL aquadest

500 g
x 50 ml=25 ml
1000 g

Catatan : dalam praktikum tidak dilakukan pengenceran karena

500 mcg
dalam sediaan sudah terkandung ml

2. Perhitungan bahan untuk sampel tetrasiklin dengan

konsentrasi 500g.

ditimbang 50 mg 50 mg
} , 500 g
dilarutkandalam 100 ml aquadest 100 mg

3. Hasil pengamatan

Jarak eluen = 6,5 cm

 Jarak sampel = 3,5cm
Jarak baku vitamin B12 = 2,7cm
Jarak baku tetra = 2,4 cm

VIII. Perhitungan
jarak gerakan zat terlarut /komponen/noda
Rf = jarak gerakan pelarut /eluen/rambat

1. Rf sampel
3,5 cm
=0,53 cm
Rf = 6,5

2. Rf vitamin B12
2,7 cm
=0,41cm
Rf = 6,5 cm

3. Rf baku tetra
2,4 cm
=0,3 cm
Rf = 6,5 cm
IX. Pembahasan
Dalam pratikum Kromatogrfi Lapis Tipis kali ini bertujuan agar
praktikan mampu melakukan pemisahan campuran tetrasiklin HCl
dan vitamin B dalam sediaan menjadi komponen-komponennya secara
KLT. Diantara berbagai jenis teknik kromatografi, kromatografi lapis
tipis adalah yang paling cocok untuk analisis obat di laboratorium
farmasi. Metode ini hanya memerlukan investasi yang kecil untuk
perlengkapan, menggunakan waktu yang singkat untuk menyelesaikan
analisis ( 15-60 menit), dan memerlukan jumlah cuplikan yang sangat
sedikit. Dimana Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sendiri merupakan
metode pemisahan fisikokimia.
Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir
butir (fase diam atau lapisan penyerap), ditempatkan pada penyangga
berupa pelat gelas atau penyangga berupa pelat gelas, logam , atau
lapisan yang cocok. Campuran yang akan di pisahkan, berupa
larutan,di totolkan berupa bercak atau pita (awal). Campuran yang
akan dipisahkan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, lebih
menguntungkan jika dipakai pelarut pengembang (fase gerak) atau
pelarut yang kepolarannya sama dengan pengembang
Fase Diam atau lapisan penjerap dibuat dari salah satu
penjerap yang khusus digunakan untuk KLT. Penjerap yang umum
ialah Silika Gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa dan
turunannya, poliamida, dan lain-lain. Dapat dipastikan bahwa silika
gel paling banyak digunakan. Silica gel menghasikan perbedaan
dalam efek pemisahan yang tergantung kepada cara pembuatannya.
Selain itu harus diingat bahwa penjerap seperti aluminium oksida dan
silica gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap daya
pemisahnya.

Fase gerak (pelarut pengembang) ialah medium angkut dan

terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam,
yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Yang digunakan
hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperluhkan system
pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran sederhana
mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Angka banding
campuran dinyatakan dalam bagian volume sedemikian rupa sehingga
volume total 100. Namun dalam praktikum dibuat sesuai kebutuhan
sehingga volumenya tidak mencapai 100. Komponen yang digunakan
dalam praktikum ini butanol, air dan asam asetat. lapisan kemudian
dimasukan kedalam bejana nyata gembang yang berisi pelarut yang
dalamnya sekitar 1 cm yang akan bertindak sebagai fase gerak. Hal ini
dilakukan demikian rupa sehingga pelarut berkintak dengan lapisan
pada ujung yang dekat dengan berkas totolan. Pemisahan terjadi
selama perambatan kapiler (pengembangan ).
Pengembangan adalah proses pemisahan campuran cuplikan
akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak
pengembangan normal, yaitu jarak antara garis antara garis awal dan
garis depan, ialah 100 mm. Disamping pengembanngan sederhana,
yaitu perambatan satu kali sepanjang 10 cm ke atas, pengembangan
ganda dapat juga di gunakan untuk memperbaiki efek pemisahan-
yaitu dua kali merambat 10 cm ke atas berturut- turut pada
pengembangan dua kali. Lapisan KLT harus dalam keadaan kering
diantara keduanya mengembang, ini dilakukan dengan membiarkan
pelat di udara selama 5-10 menit.
Kromatografi biasanya dilakukan didalam bejana yang telah
dijenuhkan sejenuh mungkin dengan fase gerak. Untuk campuran
yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan system
larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya
bekerja sama untuk mencapai pemisahan. Selain itu, hal yang juga
penting adalah memiliki kondisi kerja yang optimum yang meliputi
sifat pengembangan, atmosfer bejana dan lain-lain. Jarak
pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya di nyatakan
dengan angka Rf atau hRf. Dengan rumus

jarak gerakan zat terlarut /komponen/noda

Rf = jarak gerakan pelarut /eluen/r ambat

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat di

tentukan dua decimal. hRf ialahangka Rf di kalikan factor 100 (h),
menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100. Jika dipilih 10 cm
sebagai jarak pengembangan, maka jarak rambat suatu senyawa (titik
awal titik bercak dalam cm) 10 menghasilkan angka hRf. Tetapi,
karena angka Rf merupakan fungsi sejumlah factor, angka ini harus di
anggap sebagai petunjuk saja. Inilah yang menjadi alas angka hRf
yang dicantumkan untuk menunjukan letak suatu senyawa pada
kromatogram.
Jika keadaan luar, misalnya kelembaban atmosfer yang
tidak cukup atau penjerap yang sifatnya agak menyimpang,
menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukan angka Rf
dari berbagai komponen lebih rendah atau lebih tinggi, maka system
pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih
tinggi daripadaangka hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus
dikurangi; jika angka hRf lebih rendah, komponen polar pelarut harus
dinaikan.
 Kromatografi Lapis Tipis mempunyai kelebihan dan
kekurangan. Kelebihan khas dari KLT ialah keserbagunaan, kecepatan
dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan
bahwa disamping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda
dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain dan digunakan
untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh
sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan
merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa labil. Akhirnya,
kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlakukan dapat
dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran g. Satu
kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputan pelat kaca dengan
penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan adanya
penyaput otomatis. Meski pun begitu, dengan menggunakan alat itu
pun harus dibersihkan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan
lemak.
X. Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpilkan bahwa:
A. Teknik pemisahan dengan KLT merupakan teknik kromatografi
dimana zat-zat dipisahkan berdasarkan perbedaan migrasi zat
terlarut dalam fase diam (adsorben dilapisi silika gel ) dan fase
gerak (larutan pengembang).
B. Semakin polar senyawa organik, semakin kuat ia menjerap
molekil air sehingga keaktifannya menurun.
C. Hasil dari pemisahan dengan metode KLT digunakan harga RF
(retardation factor) dengan rumus:
jarak gerakan zat terlarut /komponen/noda
Rf = jarak gerakan pelarut /eluen/rambat

D. Keakuratan pemisahan dengan metode KLT tergantung pada

pemilihan adsorben sebagai fase diam, kepolaran pelarut, ukuran
kolom terhadap jumlah material, dan laju fase gerak.
E. Suatu senyawa dikatakan murni jika noda yang ditotolkan
terjerat,dengan bentuk yang konstan atau tidak meniggalkan noda
pada jalan yang dilalunya pada pelat.
XI. Daftar Pustaka

Egon, Stahl. 1985. Analisa Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi.

Penerbit ITB. Bandung

Harborne, J.B 1996. Metode Fitokimia Terbitan Kedua. Penerbit ITB.

Bandung

Roy J. Gritter, James M. Bobbit dan Arthur E. Schwarting. 1991. Pengantar

Kromatografi. Edisi Kedua. Penerbit ITB. Bandung