Komposisi larutan-larutan fiksatif

Alkohol, etil alkohol baik yang berkosentrasi tinggi (96% sampai absolut), maupun
yang 30% sampai 35%.
Formalin, biasanya yang dipergunakan untuk fiksasi adalah formalin 10%
Komposisi larutan Zenker
Akuades 100 ml
Kalium bikhromat 2,5 g
Merkuri khlorida 5 g
Natrium sulfat 1 g
Asam cuka glasial 5 ml
Larutan Lavdowsky
Akuades 100 ml
Kalium bikhromat 5 g
Merkuri khlorida 0,15 g
Asam cuka glacial 2 ml
Larutan Helly
Akuades 90 ml
Kalium bikhromat 2,5 g
Merkuri khlorida 5 g
Natrium sulfat 1 g
Formalin 10 g
Larutan Bouin
Asam pikrat jenuh 75 ml
Formalin 25 ml
Asam cuka glasial 5 ml

Fiksasi (fixation

Dehidrasi dehydration

Pembeningan clearing

Pembenaman embedding

Pengecoran blocking
Pemotongan jaringan sectioning

Pewarnaan staining

Perekatan mounting

Pelabela ( labelling

METODE PARAFIN
Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai berikut :

Sampling

Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini diambil beberapa organ
sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka dipotong-potong terlebih dahulu.

Pengambilan jaringan :

 Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer

 Pemotongan harus dengan pisau yang tajam
 Ukuran potongan sebaiknya 1 cm
 Secepatnya difiksasi

Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca mati dan perubahan

struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan. Kesulitan dari tahap ini adalah
waktunya yang sedikit harus dipercepat dalam pengerjaannya sehingga terkesan menjadi
terburu-buru.

Fiksasi (fixation)

Tujuan utama fiksasi adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan,
terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak
mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan
yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung
dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis.

Dengan kata lain fiksasi bertujuan :

 Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat

sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
 Mencegah autolisis
 Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan
komponen cairan fiksatif.
Kesulitan dari tahap ini hanyalah memerlukan waktu yang lama untuk pengerjaannya, karena
fiksasi membutuhkan waktu yang lama untuk dapat membuat spesimen awet.

Dehidrasi (dehydration)

Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu dengan menggunakan
bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupakan langkah penting yang memerlukan
perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus. Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan
terhalangnya proses penamanan dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses
dehidrasi tersebut. Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah
memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut :

 Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air tersebut
 Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh medium penjernih
 Tidak merusak dan mengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya sehingga
misalnya tisu akan menjadi terlalu lunak kembali ataupun malah memperkeras tisu
tersebut menjadi rapuh.

Kesulitan dari tahap ini adalah dalam pemilihan dehidran yang digunakan agar sesuai
sehingga tisu tidak menjadi terlalu lunak dan malah menjadi terlalu keras.

Penjernihan (clearing)

Tujuan utama proses penjernihan adalah menggantikan tempat alkohol dalam tisu yang telah
mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih menjelang proses
penanaman sebelum dilakukan proses penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau
benzene pada proses penjernihan ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini
yang menjadi alasan bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu dalam
medium penjernih bergantung pada :

 Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu

 Jenis reagen yang dipakai
 Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka proses
penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah hingga tiga jam. Bila tisu
dibiarkan cukup lama dalam medium penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu
akan menjadi keras dan rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.

Kesulitan dari tahap ini adalah adalah ketepatan waktu yang dibutuhkan saat penjernihan ini
sendiri. Karena jika terlalu lama dapat membuat tisu menjadi keras dan rapuh untuk tahap
penyayatan.

Infiltrasi (infiltration)

Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyusupkan media penanaman kedalam tisu
dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media
penamanam/embedding yang umum dipakai adalah parafin. Untuk jenis tisu hewan yang
biasanya digunakan parafin bertitik didih 58°C. Sebelum jaringan masuk kedalam parafin
murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam xylol.

Kesulitan dalam tahap ini adalah teknik yang harus dilakukan untuk menyusupkan media
penanaman ke dalam tisu.

Penanaman (embedding)
Penanama merupakan proses memasukkan atau menanam tisu kedalam blok-blok parafin
(cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan dengan bantuan mikrotom.
Beberapa teknik percetakan tersebut menggunakan :

 Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L dialas kaca
dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak.
 Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas karton atau manila
 Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini tisu dapat
ditanamkan sekaligus.

Kesulitan tahap ini adalah pemilihan teknik dan pemilihan cetakan yang tepat untuk dapat
dimasukkan dalam tisu agar sesuai dengan kebutuhan spesimen.

Pemotongan (section)

Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang
telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan
adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu
seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh. Mikrotom adalah
Alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan
yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop.

Kesulitan dalam tahap penyayatan ini adalah cara penyayatan, keterampilan dalam menyayat,
karena pada tahap penyayatan ini akan dihasilkan spesimen yang sangat tipis agar dapat
dilihat pada mikroskop.

Afiksasi (afixing)

Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan sayatan tisu yang
pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu. Kesulitan dari tahapan ini adalah
ketepatan dalam melakukannya pada kaca preparat. Jika terjadi kesalahan posisi akan sulit
digunakan.

Deparafinisasi

Deparafinisasi adalah proses penghilangan parafin menggunakan xylol. Adapun langkah-

langkah deparafinisasi adalah :

 Jaringan dimasukkan kedalam xylol (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 30

menit
 Redehidrasi dengan alkohol dari tinggi ke rendah (100%, 96%, 80%, 70%, 50% dan
30%) kemudian cuci dengan air mengalir setelah itu celupkan ke dalam akuades.
Pewarnaan (staining)

Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen tisu,
terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Motoda
pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata preparat metode parafin adalah metoda
pewarnaan Hematoxilin-eosin.

Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan setelah melalui
proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran tempat keduanya tampaknya
akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari
pada pewarna paduannya yang umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas
pewarnaanya dapat diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin.

Kesulitan tahapan ini adalah memilih jenis pewarna, karena dengan ketepatan pemilihan
bahan pewarna dapat menyesuaikan bagian apa pada spesimen tersebut yang akan dilihat.
Jika terjadi kesalahan dapat terjadi kekeliruan dalam tujuan penglihatan spesimen.

Mounting

Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum ditutup secara
permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop apakah jaringan tersebut sudah
dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas
penutup. Hindari terbentuk gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali
diwabah mikroskop.

Kesulitan pada tahapan ini adalah keterampilan pada penutupan spesimen agar tidak terdapat
gelembung-gelembung yang tersisa sehingga nantinya saat diamati pengamatan spesimen
tersebut tidak terganggu.