BIOKIMIA

RESUME JURNAL ANALISIS PCR PADA SAMPEL CORONA

DETEKSI CORONAVIRUS NOVEL 2019 (2019-NCOV) SECARA REAL-TIME RT-PCR

OLEH :

PUTRI NABILLAH JAKARIA

(P07134019083)

SEMESTER IIB

KEMENTERIAN KESEHATAN RI

POLTEKKES KEMENKES DENPASAR

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

2020
 DETEKSI CORONAVIRUS NOVEL 2019 (2019-NCOV) SECARA REAL-TIME RT-PCR

1. Latar Belakang Penelitian

Wabah yang sedang berlangsung dari coronavirus novel yang baru muncul (2019-
nCoV) menimbulkan tantangan bagi laboratorium kesehatan masyarakat karena isolat virus
tidak tersedia sementara ada bukti yang berkembang bahwa wabah ini lebih luas daripada
yang diperkirakan sebelumnya, dan penyebaran internasional melalui pelancong sudah
terjadi.
Menurut Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), Kantor WHO Negara China diberitahu
tentang kasus pneumonia etiologi yang tidak diketahui di Kota Wuhan, Provinsi Hubei, pada
31 Desember 2019. Sebuah coronavirus baru yang saat ini disebut 2019-nCoV secara resmi
diumumkan sebagai agen penyebab oleh otoritas Cina pada 7 Januari. Urutan genom virus
dirilis untuk dukungan kesehatan masyarakat langsung melalui komunitas online resource
virological.org pada 10 Januari (Wuhan-Hu-1, nomor aksesi GenBank MN908947), diikuti
oleh empat gen lain yang disimpan pada 12 Januari dalam viral database urutan yang
dikuratori oleh Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID). Urutan genom
menunjukkan adanya virus yang terkait erat dengan anggota spesies virus yang disebut
sindrom pernafasan akut berat (SARS) terkait CoV, spesies yang didefinisikan oleh agen
wabah SARS 2002/03 pada manusia. Spesies ini juga terdiri dari sejumlah besar virus yang
sebagian besar terdeteksi pada kelelawar rhinolophid di Asia dan Eropa.
Pada 20 Januari 2019, 282 kasus manusia yang dikonfirmasi di laboratorium telah
diberitahukan ke WHO. Kasus yang dikonfirmasi dalam pelancong dari Wuhan diumumkan
pada 13 dan 17 Januari, di Thailand serta pada 15 Januari di Jepang dan 19 Januari di Korea.
Sejauh ini penularan dari manusia ke manusia pada 2019-nCoV tidak jelas pada saat
penulisan laporan ini, tetapi ada bukti beberapa penularan dari manusia ke manusia.
Di antara prioritas utama untuk memfasilitasi intervensi kesehatan masyarakat adalah
diagnosis laboratorium yang andal. Pada infeksi pernapasan akut, RT-PCR secara rutin
digunakan untuk mendeteksi virus penyebab dari sekresi pernapasan. Kami sebelumnya telah
menunjukkan kelayakan memperkenalkan teknologi deteksi yang kuat berdasarkan real-time
RT-PCR di laboratorium kesehatan masyarakat selama darurat kesehatan internasional
dengan koordinasi antara laboratorium publik dan akademik. Dalam semua situasi ini, isolat
virus tersedia sebagai substrat utama untuk menetapkan dan mengendalikan pengujian dan
kinerja pengujian.
 Dalam kasus 2019-nCoV saat ini, isolat virus atau sampel dari pasien yang terinfeksi
sejauh ini tidak tersedia untuk komunitas kesehatan masyarakat internasional. Kami
melaporkan di sini tentang pembentukan dan validasi alur kerja diagnostik untuk skrining
2019-nCoV dan konfirmasi spesifik, yang dirancang tanpa adanya isolat virus yang tersedia
atau spesimen pasien asli. Desain dan validasi dimungkinkan oleh keterkaitan genetik yang
dekat dengan SARS-CoV 2003, dan dibantu oleh penggunaan teknologi asam nukleat
sintetis.
2. Metode Penelitian
2.2. Sampel klinis dan supernatan kultur sel koronavirus untuk evaluasi uji awal

Supernatan kultur sel yang mengandung tipe coronavirus dan virus pernapasan
lainnya disediakan oleh Charite dan laboratorium penelitian Universitas Hong
Kong. Sampel pernapasan diperoleh selama 2019 dari pasien yang dirawat di
rumah sakit di pusat medis Charite dan diuji oleh panel patogen pernapasan
NxTAG (Luminex, S´Hertogenbosch, Belanda) atau dalam kasus MERS-CoV
oleh tes MERS-CoV upE seperti yang dipublikasikan sebelumnya.

Sampel tambahan dipilih dari biobanks di Rijksinstituut voor Volksgezondheid

en Milieu (RIVM), Bilthoven, di Erasmus University Medical Centre,
Rotterdam, di Public Health England (PHE), London, dan di University of Hong
Kong. Sampel dari semua koleksi terdiri dahak serta usap hidung dan
tenggorokan dengan atau tanpa media transportasi virus.

Sampel-sampel tinja yang mengandung sampel-sampel CoV terkait-SARS yang

diturunkan-kelelawar (diidentifikasi oleh nomor-nomor tambahan GenBank)
diuji: KC633203, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_eur / BB98-98 / BGR / 2008;
KC633204, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_eur / BB98–92 / BGR / 2008;
KC633201, Betacoronavirus BtCoV / Rhi_bla / BB98–22 / BGR / 2008;
GU190221 Betacoronavirus Bat coronavirus BR98–19 / BGR / 2008;
GU190222 Betacoronavirus Bat coronavirus BM98-01 / BGR / 2008;
GU190223, Betacoronavirus Bat coronavirus BM98–13 / BGR / 2008.

Semua RNA sintetis yang digunakan dalam penelitian ini diukur secara
fotometrik.

2.3. Ekstraksi RNA

 RNA diekstraksi dari sampel klinis dengan sistem MagNA Pure 96 (Roche, Penzberg,
Jerman) dan dari supernatan kultur sel dengan mini kit RNA virus (QIAGEN, Hilden,
Jerman).

2.4. PCR reverse-transkripsi real-time

Reaksi 25μL mengandung 5μL RNA, 12,5μL buffer reaksi 2 × yang dilengkapi dengan
Superscript III satu langkah sistem RT-PCR dengan Platinum Taq Polymerase
(Invitrogen, Darmstadt, Jerman; mengandung 0,4 mM dari masing-masing
deoksiribont trifosfat (dNTP) dan 3,2 mM magnesium sulfat), 1μL reverse
transcriptase / campuran Taq dari kit, 0,4μL dari larutan magnesium sulfat 50 mM
(Invitrogen), dan 1μg albumin serum sapi yang tidak diasetilasi (Roche). Urutan
primer dan probe, serta konsentrasi yang dioptimalkan ditunjukkan pada Tabel 1.
Semua oligonukleotida disintesis dan disediakan oleh Tib-Molbiol (Berlin, Jerman).
Siklus termal dilakukan pada 55 ° C selama 10 menit untuk transkripsi terbalik, diikuti
oleh 95 ° C selama 3 menit dan kemudian 45 siklus dari 95 ° C selama 15 detik, 58 ° C
selama 30 detik. Laboratorium yang berpartisipasi menggunakan instrumen Roche
Light Cycler 480II atau Applied Biosystems ViiA7 (Applied Biosystems, Hong Kong,
Cina).

2.5. Opsi protokol dan catatan aplikasi

Laboratorium yang berpartisipasi dalam evaluasi menggunakan TaqMan Fast Virus 1-
Step Master Mix (Thermo Fisher) dengan konsentrasi oligonukleotida dan kondisi
siklus yang sama. Kit QIAGEN One-Step RT-PCR juga diuji dan terbukti kompatibel.
 Reaktivitas silang yang dimaksudkan dari semua tes dengan RNA virus SARS-CoV
memungkinkan kita untuk menggunakan tes tanpa harus bergantung pada sumber
eksternal RNA 2019-nCoV spesifik.
Untuk alur kerja rutin, kami menyarankan uji gen E sebagai alat skrining lini pertama,
diikuti oleh pengujian konfirmasi dengan uji gen RdRp. Penerapan uji gen RdRp
dengan teknologi dua warna dapat membedakan 2019-nCoV (kedua probe positif) dari
SARS-CoV RNA jika yang kedua digunakan sebagai kontrol positif. Atau,
laboratorium dapat memilih untuk menjalankan pengujian RdRp hanya dengan probe
spesifik 2019-nCoV.
2.6. Pernyataan etis
Penggunaan internal sampel untuk optimasi alur kerja diagnostik telah disetujui
berdasarkan aturan etika medis masing-masing mitra yang berpartisipasi.
3. Hasil Pengamatan

Gambar 1

Gambar 2
 Gambar 3
Tabel2
Tes virus pernapasan dan bakteri yang diketahui dalam sampel klinis dan persiapan kultur sel
untuk reaktivitas silang pada 2019 novel coronavirus E dan uji gen RdRp (n = 310)

Clinical samples with known

Clinical samplesa Virus isolatesb
viruses

HCoV-HKU1 14 1c

HCoV-OC43 16 2d

HCoV-NL63 14 1e

HCoV-229E 18 2f

MERS-CoV 5 1g
Clinical samples with known
Clinical samplesa Virus isolatesb
viruses

Influenza A(H1N1)pdm09 17 1

Influenza A(H3N2) 16 1

Influenza A (untyped) 11 NA

Influenza A(H5N1) 1 1

Influenza A(H7N9) 0 1

Influenza B (Victoria or Yamagata) 31 1

Rhinovirus/enterovirus 31 NA

Respiratory syncytial virus (A/B) 33 NA

Parainfluenza 1 virus 12 NA

Parainfluenza 2 virus 11 NA
 Clinical samples with known
Clinical samplesa Virus isolatesb
viruses

Parainfluenza 3 virus 14 NA

Parainfluenza 4 virus 11 NA

Human metapneumovirus 16 NA

Adenovirus 13 1

Human bocavirus 6 NA

Legionella spp. 3 NA

Mycoplasma spp. 4 NA

Total clinical samples 297 NA

4. Pembahasan
Sebelum rilis urutan virus dari kasus 2019-nCoV, mengandalkan laporan media sosial
yang mengumumkan deteksi virus mirip SARS. Dengan demikian kami mengasumsikan
bahwa CoV terkait SARS terlibat dalam wabah. Kami mengunduh semua urutan virus
lengkap dan sebagian (jika> 400 nt) terkait SARS yang tersedia di GenBank pada 1 Januari
2020. Daftar (n = 729 entri) diperiksa secara manual dan urutan buatan (yang diturunkan dari
laboratorium, sintetis, dll), seperti duplikat urutan juga dihapus, menghasilkan daftar akhir
375 urutan. Urutan ini diselaraskan dan perataan digunakan untuk desain pengujian
(Tambahan Gambar S1). Setelah merilis urutan 2019-nCoV pertama di virological.org, tiga
tes dipilih berdasarkan seberapa baik mereka cocok dengan genom 2019-nCoV (Gambar 1).
Penyelarasan ini dilengkapi dengan sekuens tambahan yang dirilis secara independen di
GISAID (https://www.gisaid.org), mengonfirmasi kecocokan yang baik dari primer terpilih
untuk semua sekuens. Penyelarasan domain pengikat primer dengan 2019-nCoV, SARS-CoV
serta CoV terkait-SARS terkait kelelawar terpilih ditunjukkan pada Gambar 2.
4.1. Sensitivitas pengujian berdasarkan virion coronavirus SARS
Untuk mendapatkan penilaian awal sensitivitas analitik, digunakan supernatan kultur sel
murni yang mengandung virion SARS-CoV Frankfurt-1 yang ditumbuhkan pada sel
Vero. Supernatan itu ultrafilter dan dengan demikian terkonsentrasi dari 20 kali lipat
volume supernatan kultur sel. Langkah konsentrasi secara bersamaan mengurangi
konsentrasi relatif asam nukleat latar belakang seperti RNA virus yang tidak dikemas
virion. Persiapan virion dikuantifikasi oleh RT-PCR real-time menggunakan standar
kuantifikasi RNA in vitro-transkrip spesifik seperti yang dijelaskan dalam Drosten et al.
[8]. Semua pengujian menjadi sasaran pengujian ulangan untuk menentukan frekuensi
deteksi stokastik pada setiap titik akhir sensitivitas pengujian (Gambar 3A dan B).
Semua tes sangat sensitif, dengan hasil terbaik yang diperoleh untuk gen E dan uji gen
RdRp (5,2 dan 3,8 salinan per reaksi pada probabilitas deteksi 95%, masing-masing).
Dua tes ini dipilih untuk evaluasi lebih lanjut. Salah satu laboratorium yang
berpartisipasi dalam evaluasi eksternal menggunakan reagen RT-PCR dasar lainnya
(TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix) dan mengulangi studi sensitivitas, dengan hasil
yang setara (gen E: 3,2 RNA salinan / reaksi (95% CI: 2,2 -6.8); RdRP: 3,7 salinan
RNA / reaksi (95% CI: 2,8-8,0). Dari catatan, uji gen N juga dilakukan dengan baik
tetapi tidak mengalami validasi lebih lanjut intensif karena sedikit kurang sensitif
(Tambahan Gambar S2Kesilmpulan)
4.2. Sensitivitas berdasarkan pada RNA yang ditranskrip secara in vitro identik dengan
urutan target virus korona 2019 yang baru
Meskipun kedua tes mendeteksi 2019-nCoV tanpa polimorfisme di situs pengikatan
oligonukleotida (Gambar 2), juga menghasilkan standar RNA yang ditranskripsi secara
in vitro yang persis sama dengan urutan 2019-nCoV untuk kuantifikasi absolut dan
mempelajari batas deteksi (LOD). Reaksi replikasi dilakukan pada konsentrasi di sekitar
titik akhir deteksi yang ditentukan dalam percobaan pengenceran awal. LOD yang
 dihasilkan dari tes ulangan adalah 3,9 salinan per reaksi untuk uji gen E dan 3,6 salinan
per reaksi untuk uji RdRp (Gambar 3C dan D). Angka-angka ini mendekati tingkat hit
95% dari 2,9 salinan per reaksi, menurut distribusi Poisson, diharapkan ketika satu
molekul RNA terdeteksi.
4.3. Diskriminasi 2019 coronavirus baru dari SARS coronavirus oleh uji RdRp
Mengikuti alasan bahwa RNA SARS-CoV dapat digunakan sebagai kontrol positif untuk
seluruh prosedur laboratorium, sehingga menghindarkan kebutuhan untuk menangani
RNA 2019-nCoV, kami merumuskan uji RdRp sehingga berisi dua probe: probe rentang
luas bereaksi dengan SARS-CoV dan 2019-nCoV dan probe tambahan yang hanya
bereaksi dengan 2019-nCoV. Dengan membatasi percobaan pengenceran, kami
mengkonfirmasi bahwa kedua probe, apakah digunakan secara individual atau dalam
kombinasi, memberikan LOD yang sama untuk setiap virus target. Probe spesifik
RdRP_SARSr-P2 mendeteksi hanya transkrip RNA 2019-nCoV tetapi bukan RNA
SARS-CoV.
4.4. Jangkauan deteksi untuk coronavirus terkait-SARS dari kelelawar
Saat ini, paparan potensial terhadap sumber lingkungan umum dalam kasus yang
dilaporkan awal berimplikasi kemungkinan infeksi zoonosis independen dengan
peningkatan variabilitas urutan. Untuk menunjukkan bahwa pengujian tersebut dapat
mendeteksi virus terkait SARS terkait kelelawar lainnya, kami menggunakan uji gen E
untuk menguji enam sampel feses yang berasal dari kelelawar yang tersedia dari Drexler
et al. und Muth et al. Sampel virus-positif ini berasal dari kelelawar rhinolofid Eropa.
Deteksi outlier filogenetik ini dalam clade terkait-SARS menunjukkan bahwa semua
virus Asia kemungkinan akan terdeteksi. Ini akan, secara teoritis, memastikan
sensitivitas luas bahkan dalam kasus akuisisi beberapa virus varian independen dari
reservoir hewan.
4.5. Pengujian spesifisitas
Untuk mengecualikan reaktivitas non-spesifik oligonukleotida antara satu sama lain,
menyebabkan sinyal fluoresen buatan, semua tes diuji 120 kali secara paralel dengan air
dan tidak ada asam nukleat lain kecuali oligonukleotida yang disediakan. Tidak satu pun
dari reaksi ini yang terdeteksi sinyal positif.
4.6. Reaktivitas silang dengan coronavirus lain
Supernatan kultur sel yang mengandung semua virus korona manusia endemik (HCoV)
-229E, -NL63, -OC43 dan -HKU1 serta MERS-CoV diuji dalam rangkap dua dalam tiga
tes (Tabel 2). Untuk HCoV-HKU1 yang tidak dapat ditanami, supernatan dari kultur
 saluran napas manusia digunakan. Konsentrasi RNA virus dalam semua sampel
ditentukan oleh RT-PCR real-time spesifik dan standar RNA yang ditranskripsi secara in
vitro yang dirancang untuk kuantifikasi absolut viral load. Supernatan kultur sel yang
belum diencerkan (tetapi tidak dikuantifikasi) diuji seperti dirangkum dalam Tabel 2. Ini
juga dicampur ke dalam sampel sputum manusia negatif. Tidak ada virus yang diuji atau
preparat virus yang menunjukkan reaktivitas dengan uji apa pun.
4.7. Eksklusivitas 2019 novel coronavirus berdasarkan sampel klinis pra-tes positif untuk
virus pernapasan lainnya
Dengan menggunakan uji gen E dan RdRp, kami menguji total 297 sampel klinis dari
pasien dengan penyakit pernapasan dari biobank lima laboratorium yang menyediakan
layanan diagnostik (satu di Jerman, dua di Belanda, satu di Hong Kong, satu di Inggris).
Dipilih 198 sampel dari tiga pusat medis universitas di mana pasien dari bangsal
perawatan umum dan intensif serta sebagian besar departemen rawat jalan anak terlihat
(Jerman, Belanda, Hong Kong). Sampel yang tersisa disumbangkan oleh layanan
kesehatan publik nasional yang melakukan studi pengawasan (RIVM, PHE), dengan
sampel yang sebagian besar diserahkan oleh praktisi. Sampel berisi jangkauan terluas
agen pernapasan yang mungkin dan mencerminkan spektrum umum konsentrasi virus
yang ditemukan di laboratorium diagnostik di negara-negara ini (Tabel 2). Secara total,
pengujian ini tidak menghasilkan hasil positif palsu. Dalam empat reaksi uji individu,
reaktivitas awal yang lemah terlihat tetapi mereka negatif setelah pengujian ulang dengan
uji yang sama. Sinyal-sinyal ini tidak terkait dengan virus tertentu, dan untuk setiap virus
yang terjadi reaktivitas positif awal, ada sampel lain yang mengandung virus yang sama
pada konsentrasi yang lebih tinggi tetapi tidak dinyatakan positif. Mengingat hasil dari
kualifikasi teknis yang luas yang dijelaskan di atas, disimpulkan bahwa reaktivitas awal
ini bukan karena ketidakstabilan kimia probe PCR real-time tetapi kemungkinan besar
karena masalah penanganan yang disebabkan oleh pengenalan cepat tes diagnostik baru
dan kontrol selama evaluasi pembelajaran.
5. Kesimpulan
Laporan ini menggambarkan pembentukan alur kerja diagnostik untuk mendeteksi
virus yang muncul tanpa adanya sumber fisik asam nukleat genom virus. Desain pengujian
yang efektif dimungkinkan oleh kesediaan para ilmuwan dari China untuk berbagi informasi
genom sebelum publikasi formal, serta ketersediaan pengetahuan urutan luas dari sekitar 15
tahun investigasi virus terkait SARS di reservoir hewan. Kemudahan relatif yang tes dapat
dirancang untuk virus ini, berbeda dengan SARS-CoV pada tahun 2003, membuktikan nilai
kolektif yang sangat besar dari studi deskriptif ekologi penyakit dan keragaman genom virus.
Real-time RT-PCR digunakan secara luas dalam virologi diagnostik. Dalam kasus
darurat kesehatan masyarakat, laboratorium diagnostik mahir dapat mengandalkan teknologi
yang kuat ini untuk membuat tes diagnostik baru dalam layanan rutin mereka sebelum tes
pra-formulasi tersedia. Selain informasi tentang reagen, oligonukleotida, dan kontrol positif,
laboratorium yang bekerja di bawah program kontrol kualitas perlu mengandalkan
dokumentasi kualifikasi teknis formulasi pengujian serta data dari tes evaluasi klinis
eksternal. Penyediaan template RNA kontrol telah secara efektif dilaksanakan oleh proyek
EVAg yang menyediakan reagen terkait virus dari koleksi penelitian akademik. SARS-CoV
RNA dapat diambil dari EVAg sebelum wabah ini; produk spesifik seperti transkrip RNA
untuk pengujian yang dijelaskan di sini pertama kali diambil dari katalog online EVAg pada
14 Januari 2020 (https://www.european-virus-archive.com). Data kualifikasi teknis
berdasarkan bahan kultur sel dan konstruksi sintetik, serta hasil dari pengujian eksklusivitas
pada 75 sampel klinis, dimasukkan dalam versi pertama protokol diagnostik yang diberikan
kepada WHO pada 13 Januari 2020. Berdasarkan kolaborasi efisien dalam informal jaringan
laboratorium, data ini ditambah dalam waktu 1 minggu terdiri dari hasil pengujian
berdasarkan berbagai patogen pernapasan dalam sampel klinis dari infeksi alami. Studi
evaluasi yang sebanding selama kualifikasi peraturan tes diagnostik in vitro dapat memakan
waktu berbulan-bulan untuk organisasi, implementasi hukum dan logistik dan biasanya
datang setelah puncak wabah telah berkurang. Kecepatan dan efektivitas upaya penyebaran
dan evaluasi saat ini dimungkinkan oleh jaringan penelitian nasional dan Eropa yang
dibentuk sebagai respons terhadap krisis kesehatan internasional dalam beberapa tahun
terakhir, menunjukkan kapasitas respons luar biasa yang dapat dilepaskan melalui tindakan
terkoordinasi dari laboratorium akademik dan publik . Kapasitas laboratorium ini tidak hanya
mendukung intervensi kesehatan masyarakat langsung tetapi memungkinkan situs untuk
mendaftarkan pasien selama tanggapan penelitian klinis yang cepat.
 DAFTAR PUSTAKA
Corman,Victor M., Landt, Olfert,, & Kaiser, Marco. 2020. Detection of 2019 novel
coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill, 25(3), 6-17.
doi : 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045