Kepada Yth.

: Tutorial Infeksi Tropis

Rencana baca :
Waktu/tempat : Online Zoom Meeting

PEMERIKSAAN NEUTRALIZING ANTIBODY (NAb) PADA SEVERE ACUTE

RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) DENGAN
METODE PLAQUE REDUCTION NEUTRALIZATION TEST (PRNT)
Fierna Darmawanti Hanafi, Irda Handayani, Nursin Abd. Kadir
Program Studi Ilmu Patologi Klinik
Program Pendidikan Dokter Spesialis
Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin / RSUP Dr. Wahidin Sudirohusodo

1. PENDAHULUAN
Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)
merupakan virus baru yang menyebabkan Coronavirus Disease 2019 (COVID-
19) pada manusia. Pada bulan Desember COVID-19 pertama kali dilaporkan di
Hubei China, yang kemudian pada tanggal 11 maret 2020 World Health
Organization (WHO) menetapkan COVID-19 sebagai pandemi. Berdasarkan
data WHO jumlah kasus terkonfirmasi COVID-19 di dunia sampai dengan 27
september 2021 sebanyak 234 juta jiwa dengan angka kematian 4,7 juta jiwa.
Pada tanggal 2 maret 2020 Indonesia pertama kali mengkonfirmasi 2 kasus
COVID-19, hingga tanggal 27 september 2021 kasus COVID-19 terkonfirmasi
sebanyak 4,21 juta jiwa dengan kematian 141.000 jiwa. Jumlah kasus COVID-
19 di Sulawesi Selatan sebanyak 108.406 jiwa dengan angka kematian 2.201
jiwa.1-4
Coronavirus Disease 2019 sangat infektif dan mudah menyebar.
Penularan COVID-19 terjadi melalui droplet terutama saluran pernafasan dan
saluran pencernaan. Virus memasuki epitel manusia untuk melakukan infeksi,
virus melekat pada sel inang (manusia) dengan berikatan pada suatu molekul
reseptor yang disebut angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). Struktur
SARS-CoV-2 memiliki 4 protein struktur utama yaitu glikoprotein spike (S),
glikoprotein small envelope (E), glikoprotein membrane (M), dan protein
nucleocapsid (N). Bagian virus yang menempel pada reseptor ACE2 adalah
protein spike (S) virus, tepatnya pada bagian receptor binding domain (RBD)

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 1

 yang berada pada domain S1. Pada saat terjadi perlekatan virus dan reseptor
maka manusia bisa dikatakan dalam keadaan “terinfeksi” dan sistem imun
dalam tubuh manusia akan aktif melawan virus penyebab infeksi.5,6
Infeksi akut SARS-CoV-2 akan mengaktifkan innate immunity dan
adaptive immunity. Innate imunity dimulai saat sel dendritik dan makrofrag
yang merupakan Antigen Precenting Cell (APC) berfungsi untuk membunuh
virus dan mengirimkan informasi kepada adaptive immunity untuk mebuat
antibodi spesifik yang menetralkan virus (menginfektif). Antibodi terbagi
menjadi 2 berdasarkan efek terhadap patogen, yaitu Neutralizing Antibody
(NAb) dan Non-Neutralizing Antibody (non-NAb). Neutralizing Antibody
adalah jenis antibodi dalam tubuh manusia yang memiliki kemampuan untuk
menetralisir patogen (termasuk virus). Ketika virus dinetralisir maka
kemampuan virus untuk menginfeksi sel inang akan hilang. NAb merupakan
bagian dari respon sistem imun yang diproduksi secara natural ketika virus
masuk atau ketika mendapatkan vaksinasi. NAb berikatan dengan molekul
virus yang masuk sehingga virus ternetralisir dan tidak mampu menyebabkan
infeksi. Kekebalan yang terbentuk oleh NAb ini dikenal sebagai kekebalan
steril, karena kekebalan tersebut terbentuk sebelum infeksi terjadi.7,8
Addetia et al dalam penelitian retrospektif NAb dan infeksi SARS-
CoV-2 di Amerika Serikat melaporkan adanya NAb dari infeksi sebelumnya
secara signifikan terkait dengan perlindungan terhadap re-infeksi SARS-CoV-
2. Hal ini membuktikan bahwa NAb memiliki efek protektif terhadap infeksi
SARS-CoV-2. NAb dapat terdeteksi dalam 7 sampai 14 hari setelah onset
penyakit dan terus meningkat terutama pada hari ke 14 sampai dengan hari ke
22 , kemudian mulai mendatar dan menurun setelah minggu ke delapan . Titer
NAb umumnya ditemukan lebih tinggi pada pasien COVID-19 dengan derajat
kritis dan berat, sedangkan titer NAb ditemukan sedikit pada derajat ringan dan
sedang.9

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 2

 Kemampuan NAb dalam menetralisir virus dapat ditentukan
pemeriksaan kuantitatif NAb, yaitu dengan mengukur seberapa banyak
konsentrasi NAb terhadap SARS-CoV-2 dalam tubuh seseorang setelah
terjadinya infeksi atau setelah mendapatkan vaksinasi. Pemeriksaan NAb dapat
dilakukan dengan tujuan untuk monitoring pasien COVID-19, mengevaluasi
efektivitas vaksin dan mengevaluasi kadar NAb dalam plasma konvalesen
yang hendak digunakan sebagai tatalaksana COVID-19. Pemeriksaan NAb
dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu Plaque Reduction
Neutralization Test (PRNT), Surrogate Virus Neutralization Test (sVNT),
Chemiluminescence Immunoassay (CLIA) dan Point of Care Testing
(POCT).10

Metode PRNT dianggap sebagai gold standard dalam pemeriksaan

NAb, karena menggunakan virus SARS-CoV-2 yang di kultur untuk melihat
NAb, namun metode PRNT memiliki beberapa kekurangan, antara lain:11
a. Kurang praktis untuk digunakan sebagai alat evaluasi serodiagnosis dan
vaksin skala besar
b. Metode rumit dan memerlukan waktu 3-5 hari menunggu proses
terbentuknya plak
c. Membutuhkan tenaga ahli dan biaya yang cukup besar
d. Proses pemeriksaan memerlukan laboratorium dengan standar Biosafety
Level 3 (BSL-3).
Pemeriksaan NAb dengan metode PRNT di Indonesia hanya dapat dilakukan
di Lembaga Eijkman RS Cipto Mangunkusumo Jakarta.

2. TUJUAN
Tujuan tutorial ini adalah mengetahui kemampuan Neutralizing Antibody
(NAb) pada Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
dengan menggunakan metode Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT).

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 3

3. METODE
3.1. Pra analitik
a. Persiapan pasien
Tidak ada persiapan khusus dalam pemeriksaan ini, namun ada
beberapa faktor yang dapat mempengaruhi seperti pengaruh konsumsi
obat-obat dan waktu pemeriksaan sampel.

b. Persiapan sampel
Sampel yang digunakan dalam pemeriksaan ini adalah sampel
darah atau serum manusia. Pertama, sampel didilusikan mulai dari 1:20
hingga 1:640 dalam Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) yang
mengadung 2% Fetal Bovine Serum (FBS).12,13,14
Kemudian, sampel yang telah didilusikan dicampur dengan
larutan virus yang mengandung 50 PFU SARS-CoV-2 dengan rasio 1:1
dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 1 jam pada suhu
37°C.12,13,14
c. Alat dan bahan
1) Alat:
a) 12-well plate (Gambar 1A)
b) Mikropipet (Gambar 1B)
c) Inkubator CO2 (Gambar 2)

A B

Gambar 1. A. Multi-well plate. B. Mikropipet.

(Fisher Scientific [Internet]. 2021 [cited 20 July 2021]. Available from:
https://www.fishersci.com/us/en/products/ITOBNV0S/cell-culture-analysis.html)

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 4

 Gambar 2. Inkubator CO2.
(Hartmann IK, Wagener J. CO2 Incubators – Best Practices for Selection, Set-up and Care.
White Pap. 2015;(29):1–10).15

2) Bahan:12,13,14
a) Sel Vero E6; telah terbukti permisif terhadap SARS-CoV-
2, berfungsi sebagai media agar virus dapat replikasi.
b) Isolat SARS-CoV-2
c) Media pemeliharaan sel; Dulbecco modified Eagle
medium (DMEM) yang mengadung 2% Fetal Bovine
Serum (FBS), fungsi DMEM sebagai media kultur virus
dan FBS berfungsi untuk meningkatkan pertumbuhan sel
kultur.
d) Formalin buffer netral 10% , berfungsi untuk
mengendalikan PH lingkungan virus.
e) Kristal violet 0,5%, berfungsi untuk pewarnaan plak.
f) Etanol 20%.

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 5

 A B

Gambar 3. A. Formalin buffer netral 10%. B. Kristal violet 0,5%

(Fisher Scientific [Internet]. 2021 [cited 20 July 2021]. Available from:
https://www.fishersci.com/us/en/products/ITOBNV0S/cell-culture-analysis.html)

3.2. Analitik
a. Prinsip tes
PRNT merupakan pemeriksaan yang mengukur NAb melalui
netralisasi virus secara in-vitro. PRNT dapat mereduksi plak hingga 50%
atau 90% dibandingkan dengan kontrol negatif. Pemeriksaan dengan
PRNT dilakukan dengan mencampurkan virus hidup dengan sampel serum
yang telah diencerkan dengan rasio 1:1 ke dalam sel pada plate. Plate
didiamkan selama beberapa hari untuk menunggu proses pembentukkan
plak. Pewarna ditambahkan untuk memberikan visualisasi yang lebih baik
dalam masing-masing plate.13,14
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, NAb dapat menetralisir
SARS-CoV-2 dengan mencegah ikatan antara virus dengan reseptor ACE2
sel inang. NAb menargetkan RBD pada protein spike virus sehingga
menghambat ikatan virus dengan reseptor ACE2 sel inang. Semakin
banyak dan efektif NAb yang terbentuk, maka semakin tinggi pula

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 6

 persentase netralisasi, hal ini dapat dilihat dari adanya reduksi plak yang
terlihat di sel pada plate.13,14

b. Cara kerja : 12,13,14

1. Pemeriksaan NAb dengan metode PRNT dilakukan dalam 12-well
plate untuk masing-masing sampel.
2. Sampel campuran virus-serum yang telah disiapkan sebelumnya
dimasukkan ke 12-well plate yang mengandung sel Vero E6 .
3. Campuran virus-serum-sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama
1 jam pada suhu 37°C.
4. Selanjutnya, sel-sel dilapisi dengan karboksimetilselulosa 1,5%.
5. Inkubasi kembali dalam inkubator CO2 5% selama 72 jam pada suhu
37°C.
6. Setelah inkubasi 72 jam, lapisan atas sel dihilangkan dan sel difiksasi
dengan formalin buffer netral 10% selama 1 jam pada suhu kamar.
7. Lapisan tunggal yang tersisa pada plate diwarnai dengan kristal violet
0,5% selama 10 menit dan dicuci dengan etanol 20%.
8. Plak yang terbentuk pada plate dihitung dan dibandingkan dengan
kontrol.
9. Titer antibodi didefinisikan sebagai resiprokal dari dilusi serum
tertinggi yang menghasilkan >90% (PRNT90) atau >50% (PRNT50)
reduksi jumlah plak.
10. Jumlah plak yang telah dihitung pada masing-masing plate dibagi
dengan jumlah awal virus yaitu 50 PFU untuk menentukan persentase
netralisasi.

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 7

 Serum

Penghitungan
jumlah plak

Gambar 4. Rangkuman prosedur PRNT.

(Liaison® SARS-CoV-2 solutions. DiaSorin).

Rekomendasi Biosafety:
Meskipun SARS-CoV-2 untuk sementara diklasifikasikan sebagai patogen
kategori B, biosafety yang berlaku untuk patogen kategori A sangat disarankan
selama menangani patogen ini. Manipulasi SARS-CoV-2 hanya boleh dilakukan
di fasilitas laboratorium dengan standar Biosafety Level 3 (BSL-3) dengan sistem
teknologi yang sesuai seperti adanya tekanan udara negatif demi meningkatkan
keselamatan pekerja laboratorium. Semua individu yang bekerja dengan SARS-
CoV-2 harus telah menjalani pelatihan biosafety yang tepat untuk bekerja di
laboratorium BSL3 dan dinyatakan telah mahir dalam melakukan prosedur
terkait SARS-CoV-2.16

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 8

 3.3. Pascaanalitik
a. Nilai rujukan:
Hasil pemeriksaan dianggap positif apabila tampak reduksi plak
atau tidak ada plak pada plate. Sedangkan hasil pemeriksaan dianggap
negatif apabila tidak tampak reduksi plak (Gambar 5).8

Negatif; tidak tampak reduksi plak

Positif; tampak reduksi / tidak ada plak

Gambar 5. Hasil Pemeriksaan NAb dengan PNRT.

(Valcourt EJ, Manguiat K, Robinson A, Chen JCY, Dimitrova K, Philipson C, et al. Evaluation of a
commercially-available surrogate virus neutralization test for severe acute respiratory syndrome
coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Diagn Microbiol Infect Dis. 2021;99(4):115294).

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 9

 b. Interpretasi hasil
Titer PRNT-50 dengan hasil penghitungan NAb terhadap SARS-
CoV-2 ≥1:20 dianggap positif, sedangkan Titer PRNT-90 ≥1:10
dianggap positif .8,12

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 10

 DAFTAR PUSTAKA

1. Willim HA, Hardigaloeh AT, Supit AI, Handriyani H. Koagulopati pada

Coronavirus Disease-2019 (COVID-19): Tinjauan pustaka. Intisari sains medis
2020, volume 3; 749-756
2. WHO Coronavirus (COVID-19) [Internet]. Covid19.who.int. 2021 [cited 27
September 2021]. Available from: https://covid19.who.int/.

3. Kementrian kesehatan Republik Indonesia. Laporan Analisa data Covid-19

Indonesia periode September 2021. Bidang data dan IT satuan tugas
penanganan Covid-19. http.//covid19.go.id

4. Dinkes provinsi Sulsel. Peta sebaran covid-19 di Sulawesi

Selatan,htttp.//infocoronasulsel.go.id

5. Susilo A, Rumende CM, Pitoyo CW, Santoso WD, Yulianti M, Herikurniawan

H, Sinto R, Singh G, Nainggolan L, Nelwan EJ, Chen LK. Coronavirus disease
2019: Tinjauan literatur terkini. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia. 2020 Apr
1;7(1):45-67.

6. Putcharoen O, Wacharapluesadee S, Chia WN, Paitoonpong L, Tan CW,

Suwanpimolkul G, Jantarabenjakul W, Ruchisrisarod C, Wanthong P,
Sophonphan J, Chariyavilaskul P. Early detection of neutralizing antibodies
against SARS-CoV-2 in COVID-19 patients in Thailand. PloS one. 2021 Feb
12;16(2):e0246864.

7. PDS PatKlin. Nomor 123/PP-PATKLIN/V/2021 tentangPanduan Tatalaksana

Pemeriksaan Antibodi SARS-CoV-2. Indonesia.21 Mei 2021

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 11

8. Valcourt EJ, Manguiat K, Robinson A, Chen JC, Dimitrova K, Philipson C,
Lamoureux L, McLachlan E, Schiffman Z, Drebot MA, Wood H. Evaluation of
a commercially-available surrogate virus neutralization test for severe acute
respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Diagnostic Microbiology
and Infectious Disease. 2021 Apr 1;99(4):115294.

9. Addetia A, Crawford KH, Dingens A, Zhu H, Roychoudhury P, Huang ML,

Jerome KR, Bloom JD, Greninger AL. Neutralizing antibodies correlate with
protection from SARS-CoV-2 in humans during a fishery vessel outbreak with a
high attack rate. Journal of clinical microbiology. 2020 Aug 21;58(11):e02107-
20

10. Padoan A, Bonfante F, Pagliari M, Bortolami A, Negrini D, Zuin S, Bozzato D,

Cosma C, Sciacovelli L, Plebani M. Analytical and clinical performances of five
immunoassays for the detection of SARS-CoV-2 antibodies in comparison with
neutralization activity. EBioMedicine. 2020 Dec 1;62:103101.

11. Aryati, Pemeriksaan pasca vaksin COVID-19. PDS patKLin. Jakarta. 2 Maret
2021

12. Park J-G, Oladunni FS, Chiem K, Ye C, Pipenbrink M, Moran T, et al. Rapid in
vitro assays for screening neutralizing antibodies and antivirals against SARS-
CoV-2. J Virol Methods. 2021 Jan;287:113995.

13. Lau EH, Tsang OT, Hui DS, Kwan MY, Chan WH, Chiu SS, Ko RL, Chan KH,
Cheng SM, Perera RA, Cowling BJ. Neutralizing antibody titres in SARS-CoV-
2 infections. Nature communications. 2021 Jan 4;12(1):1-7.

14. Muruato AE, Fontes-Garfias CR, Ren P, Garcia-Blanco MA, Menachery VD,
Xie X, Shi PY. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19
diagnosis and vaccine evaluation. Nature communications. 2020 Aug 13;11(1):1-
6.

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 12

15. Hartmann IK, Wagener J. CO2 Incubators – Best Practices for Selection, Set-up
and Care. White Pap. 2015;(29):1–10

16. Yu Y, Bu F, Zhou H, Wang Y, Cui J, Wang X, Nie G, Xiao H. Biosafety

materials: an emerging new research direction of materials science from the
COVID-19 outbreak. Materials Chemistry Frontiers. 2020;4(7):1930-53.

Tutorial Infeksi Tropis Halaman | 13