BMC Fellahi et al.

BMC Res Notes (2016) 9: 231 DOI 10,1186 / s13104-016-2037-z

Catatan Penelitian

PENELITIAN PASAL Perbandingan SYBR

hijau I real-time RT-PCR dengan berbasis gel
agarosa konvensional RT-PCR untuk diagnosis
virus bronkitis menular infeksi pada ayam di
Maroko
Siham Fellahi1,2, Mehdi El Harrak3, Jens H. Kuhn4, Ghizlane Sebbar3, El Arbi Bouaiti5, Khadijah
Khataby2, Ouafae Fassi Fihri1, Mohammed El Houadfi1 † dan saya Mustapha Ennaji2 * †
Abstrak Latar Belakang: A cepat, sensitif , dan metode molekul spesifik untuk diagnosis infeksi menular virus
bronkitis (IBV) penting dalam mengendalikan wabah bronkitis menular di Maroko dan negara-negara lain. Metode:
Dalam penelitian ini, mudah-untuk-melakukan hijau SYBR I real-time reverse transcriptase polymerase chain
reaction (RT-PCR) menargetkan gen nukleokapsid dari IBV dikembangkan dan dibandingkan dengan berbasis gel
agarosa konvensional RT-PCR untuk deteksi infeksi IBV. Hasil: Kami menemukan bahwa SYBR hijau saya
real-time RT-PCR setidaknya 10 kali lebih sensitif dibandingkan dengan metode deteksi gel elektroforesis agarosa.
Uji dipamerkan spesifisitas tinggi untuk infeksi IBV. Semua kontrol negatif, seperti Newcastle virus penyakit, infeksi
virus penyakit bursal, dan virus flu burung, tidak terdeteksi. Kesimpulan: SYBR hijau saya real-time uji RT-PCR
yang dijelaskan di sini dapat digunakan untuk dengan cepat membedakan IBV dari patogen pernapasan lainnya,
yang penting untuk diagnosis dan pengendalian wabah bronkitis menular di Maroko. Tes adalah metode berharga
dan berguna sebagai alat tes rutin untuk diagnosis infeksi IBV klinis pada ayam resmi commer-. Kata kunci:
Coronavirus, Gammacoronavirus, IBV, virus bronkitis Menular, SYBR hijau, Real time RT-PCR, RT-PCR
© 2016 Fellahi et al. Artikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Atribusi 4.0 License Internasional
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang memungkinkan penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam
media apapun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli (s) dan sumber, menyediakan link ke lisensi
Creative Commons, dan menunjukkan jika perubahan yang dilakukan. Creative Commons Public Domain Dedication pengabaian
(http://creativecommons.org/ domain publik / zero / 1.0 /) berlaku untuk data yang tersedia dalam artikel ini, kecuali dinyatakan
lain.

Buka Akses
Latar Belakang Infectious bronchitis (IB), seorang, virus penyakit akut yang sangat menular pernafasan bagian atas
ayam, adalah salah satu penyakit yang paling signifikan secara ekonomi menghambat industri unggas intensif di
seluruh dunia. IB mempengaruhi ayam dari segala usia, menyebabkan pernapasan, reproduksi, dan manifestasi ginjal
[1]. Meskipun pengendalian infeksi IBV terutama dicapai melalui vaksin hidup yang dilemahkan,
infeksisulit untuk mengandung karena imunisasi dengan serotipe yang berbeda dari virus tidak necessar- ily lintas
melindungi terhadap serotipe lainnya [2]. Dalam sebuah kawanan unggas yang terinfeksi, deteksi cepat dan akurat
dari keberadaan virus sangat penting untuk benar Vaksin yang cinate ternak yang tidak terinfeksi. Selain itu,
pembedaan cepat infeksi IBV dari saluran pernapasan mereda dis atas lainnya (misalnya, flu burung, penyakit
Newcastle, laringotrakeitis menular, mycoplasmosis burung) adalah penting agar langkah yang tepat dapat diambil
 secara tepat waktu manusia-* Korespondensi: m. ennaji@yahoo.fr
ner [3]. † Mohammed El Houadfi dan saya Mustapha Ennaji
kontribusi sama untuk 2 pekerjaan ini Laboratorium Virologi, Mikrobiologi dan Kualitas / Ekotoksikologi & Keanekaragaman,
Fakultas Ilmu dan Teknik-Universitas Hassan

IB adalah penyakit yang berdampak negatif terhadap industri mencoba poul- dari negara-negara berkembang.
Misalnya, di Maroko, IB terus menjadi masalah yang tidak terkendali II Mohammedia, PO Box 146, Quartier
Yasmina-Mohammedia, 20.650 Casablanca, Maroko Daftar lengkap informasi penulis tersedia di akhir artikel
[4-6] karena kurangnya hubungan capabili- diagnostik di-negara yang dapat dilakukan dengan cepat dan
diinterpretasikan dengan mudah
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 2 dari 9 oleh staf lokal di lingkungan yang berpotensi
underequipped atau sebaliknya menantang.
Agen penyebab IB, virus infectious bronchitis (IBV), adalah anggota dari spesies Avian coronavirus, genus
Gammacoronavirus, keluarga Coronaviridae [7]. IBV adalah menyelimuti, positif-rasa, untai tunggal RNA virus
(panjang genom = 27,6 kb) [8], mengungkapkan tiga protein struktural utama: protein nukleokapsid (N) yang
mengelilingi RNA virus, glikoprotein membran (M), dan spike glikoprotein (S) terletak pada permukaan amplop
virus. Protein S berisi dua subunit pascatranslasi, S1 dan S2 [9].
Tes diagnostik saat ini untuk IBV termasuk virus lation iso- dalam telur berembrio, budaya organ trakea,
immunoassays kultur sel, dan tes molekuler yang mendeteksi RNA virus [10]. Isolasi virus telah con- sidered
menjadi standar acuan. Namun, isolasi tersebut mahal dan memakan waktu karena beberapa bagian mungkin
diperlukan untuk mendeteksi virus. Immunoassays menggunakan IBV khusus ies antibod- monoklonal untuk
mendeteksi virus pada antibodi fluoresen langsung atau tidak langsung dan Immunosorbent Assay (ELISA) format
enzyme-linked. Meskipun lebih cepat dan lebih sederhana dari isolasi virus, immunoassays cenderung kurang
spesifik dan sensitivitas. Tak satu pun dari immunoassay ini mendeteksi semua strain atau jenis IBV [11-13]. Tes
molekuler, seperti reaksi balik transcriptase-polymerase chain (RT-PCR), untuk mendeteksi IBV yang umum
digunakan karena hasil yang sangat spesifik dan sensitif dapat diperoleh pada waktu yang tepat. Tes molekuler
mendeteksi RNA virus langsung dari sampel klinis atau dari virus terisolasi dalam sistem host laboratorium. Ketika
RT-PCR digunakan untuk memperkuat lonjakan glikoprotein (S) dari IBV, assay yang dapat digabungkan dengan
analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi atau sekuensing asam nukleat untuk mengidentifikasi serotipe virus
[2, 10, 12-16]. Baru-baru ini, banyak real-time berbasis tes-probe neon RT PCR telah dikembangkan untuk
mendeteksi IBV strain [2, 3, 9, 10, 15, 17]. Real-time tes TaqMan RT-PCR telah dikembangkan yang memperkuat
fragmen diterjemahkan wilayah 5 'dari genom IBV untuk mendeteksi coronavirus kalkun dan IBV [17] atau target
bahwa gen N untuk IBV deteksi [9].
Sayangnya, melakukan sebagian besar tes ini memerlukan sangat terlatih staf, struktur infra canggih, atau dana
moneter yang cukup besar, dan karena itu tidak selalu pilihan yang layak untuk mengembangkan- negara ing seperti
Maroko. Tes berbasis Saya SYBR hijau RT-PCR telah terbukti menjadi salah satu alat yang paling efektif dalam
deteksi cepat dan diferensial dari berbagai penyakit virus seperti flu burung, penyakit Newcastle, dan IB. Ini tes
murah dan eas- ily dilakukan penting untuk secara cepat mengidentifikasi
agen penyebab penyakit pernapasan bagian atas atau perubahan kualitas kulit telur dan produksi telur pada ayam
[17, 18].
Namun, assay menggunakan real-time RT-PCR dengan SYBR hijau saya mewarnai untuk menargetkan gen N dari
IBV kurang. Di sini kita melaporkan perkembangan real-time RT-PCR assay dengan SYBR hijau saya mewarnai
untuk deteksi cepat IBV RNA virus langsung dari sampel klinis Maroko. Kami juga membandingkan assay dengan
elektroforesis gel konvensional RT-PCR dan agarosa untuk mendeteksi produk PCR IBV-diperkuat.
Hasil Reproducibility SYBR hijau I real-time RT-PCR CDNA IBV Beaudette regangan (bronchi- menular virus tis /
G.gallus-wt / FRA / 1995 / Beaudette) digunakan untuk mengekstrak standar kontrol RNA genom yang saat itu
menjabat sebagai sumber cDNA Template. Konsentrasi standar cDNA mulai 10-106 salinan / ml diuji berulang kali
(Gambar. 1) oleh SYBR hijau-I-berbasis real-time RT PCR. Hasilnya direproduksi melalui 10 cDNA salinan / ml.
Konvensional gel berbasis RT-PCR PCR ditargetkan urutan yang sesuai dengan daerah dari protein IBV N. Produk
PCR yang diperoleh dari 130 bp panjang dipisahkan pada gel agarosa 1,5% diwarnai dengan ethidium bromide (Gbr.
2). Produk PCR yang terdeteksi pada pengenceran 100 cDNA salinan / ml.
Kekhususan SYBR hijau I real-time RT-PCR puncak lebur analisis pada produk PCR dari H120, MA5, dan 4/91
strain vaksin dan sepuluh kali lipat serial diencerkan cDNA (data tidak ditampilkan) tidak menunjukkan dimer
primer- atau produk spesifik. Amplifikasi spesifik
Gambar. 1 Real-time reaksi berantai terbalik transcriptase polymerase untuk mendeteksi virus bronkitis menular. cDNA yang
berasal dari IBV Beau- dette ketegangan RNA genomik terdilusi serial 106-101 eksemplar / ml dan terdeteksi oleh real-time
PCR. Sumbu x menunjukkan jumlah siklus PCR, sedangkan sumbu y menunjukkan intensitas fluoresensi atas latar belakang. NC
kontrol negatif, PCR polymerase chain reaction
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 3 dari 9 target urut IBV diidentifikasi oleh generasi puncak
lelehan pada 68 ± 0,20 ° C. Kekhususan dari SYBR hijau-I real-time RT-PCR adalah 100% sejak sinyal neon
terdeteksi tidak diamati dengan kontrol negatif (NC), virus flu burung (FLUAV), infeksi penyakit bursal virus
(IBDV), dan Penyakit Newcastle virus (NDV) asam nukleat. Hanya vaksin galur materi genetik IBV terdeteksi
(Gambar. 3).
Sensitivitas SYBR hijau I real-time RT-PCR Untuk menentukan titik akhir sensitivitas uji ini, pengenceran serial
cDNA pada konsentrasi mulai 1,25-100 kopi / ml dianalisis. Real-time kurva fluoresensi RT-PCR berasal dari
konsentrasi standar serial diencerkan (cDNA dari H120 vaksin strain) menunjukkan sensitivitas tinggi deteksi turun
ke 100 eksemplar / ml cDNA (Gambar. 4).
Untuk menentukan linearitas dari reaksi dan efisiensi RT PCR, ambang siklus (Ct) nilai-nilai pengenceran vidual
puncak-dianalisis. Assay memiliki jangkauan deteksi dinamis yang membentang 102-106 cDNA salinan / ml.
Kecuali untuk cDNA murni, hubungan linear terbalik yang kuat diamati antara jumlah masukan cDNA dan
nilai-nilai Ct lebih dari enam log
10

Perbandingan sensitivitas dan spesifisitas hijau SYBR I real-time RT-PCR assay dengan konvensional RT-PCR The
pengenceran terendah cDNA yang SYBR hijau I real-time RT-PCR assay mampu mendeteksi adalah urutan nitude
Mag- lebih tinggi dari uji RT-PCR konvensional (Tabel 1). Receiver operasi analisis kurva karakteristik dari UES Ct
val- diperoleh dari SYBR hijau saya real-time RT-PCR assay menunjukkan linearitas reaksi dan efisiensi uji ini (Gbr.
7). Assay memiliki sensitivitas maksimum Gambar. 2 Agarose gel elektroforesis konvensional RT-PCR diperkuat
dan spesifisitas lebih dari jangkauan deteksi yang membentang
104 produk dari virus bronkitis menular N gen. Elektroforesis
gencDNA salinan / ml (Tabel 1). PCR amplifikasi setelah
pengenceran serial strain IBV Beaudette dalam gel agarosa 1,5% diwarnai dengan etidium bromida. Jalur 1 dan 10 50-bp DNA
ladder; jalur 2 kontrol negatif; jalur 3 108 eksemplar / ml; jalur 4 107 eksemplar / ml; lane 5 106 eksemplar / ml; jalur 6 105
eksemplar / ml; jalur 7
Deteksi IBV di penyeka trakea dari sampel klinis metode Dioptimalkan SYBR hijau I real-time RT 104 eksemplar / ml; jalur 8
103 eksemplar / ml; lane 9 102 eksemplar / ml. bp pasangan basa,
PCR dan konvensional RT-PCR yang diterapkan untuk IBV
virus bronkitis menular klinis, RT-PCR membalikkantranscriptase--polimer

sampeldari ayam broiler menunjukkan tanda-tanda

klinis dari reaksi berantai ase
IB, termasuk batuk, bersin, rales, dan dis hidung - biaya. Dari 34 penyeka trakea diuji, semua sampel dan kontrol
positif positif untuk IBV oleh hijau SYBR I real-time RT-PCR menargetkan gen IBV N (data tidak ditunjukkan dan
Gambar. 8 untuk subset dari total penyeka diuji). Namun, hanya 28 dari 34 sampel positif untuk IBV oleh
konvensional RT-PCR (data tidak ditampilkan).
Intra dan antar-assay variabilitas The SYBR hijau saya real-time RT-PCR assay menunjukkan pengulangan tinggi
dengan koefisien variasi dalam berjalan (variabilitas intra-assay) dan antara berjalan (variabilitas antar assay) yang
berkisar 0,6-1,5 dan 0,6 -1,8%, masing-masing (Tabel 2).
Satu langkah RT PCR amplifikasi gen dan urutan analisis IBV S1 Untuk konfirmasi lebih lanjut dari hasil kami,
kami menyelidiki apakah sampel trakea yang diuji IBV-positif menggunakan SYBR hijau I real-time RT-PCR
menargetkan gen IBV N juga akan menjadi positif menggunakan satu langkah RT-PCR terarah kepada gen IBV S1.
The IBV S1 gen dari strain vaksin komersial IBV (H120, MA5 dan 4/91) dan strain lapangan “Maroko 30” dan
“Maroko 38” (dipilih secara acak dari 34 sampel ayam broiler) yang terdeteksi dan diperkuat dengan menggunakan
satu langkah RT -PCR. Produk RT PCR yang diperoleh, 700 bp, berhubungan dengan pengenceran diprediksi
ukuran (Tabel 1),
(Gambar. 9) [19]. Urutan yang diperoleh selaras
dengan seperti yang ditunjukkan oleh plot regresi linear sederhana dari dua
orang dari IBV disimpan di GenBank (H120
[M21970];.. Variabel (Gambar 5)
MA5 [AY561713]; Italia 02 [AJ457137]; Italia 497 / 02-1 [DQ901377]; Ark / C6d [EU283056]; QX [AF193423];
konvensional RT-PCR
regangan 04/1991 [AF093794], dan D274 [X15832]),
menggunakan Hasil dari RT-PCR konvensional menggunakan IBV N
perangkat lunak BLAST. Hasil gen lapangan
sequencing menegaskan bahwa produk RT-PCR yang diperoleh adalah
strain dibandingkan dengan strain referensi IBV
mengkonfirmasi bahwa 130 bp panjang, dan produk PCR yang terdeteksi
urutan diperkuat berhubungan dengan rujukan terbaik
IBV pada konsentrasi 100 eksemplar / ml (Gambar. 6).
strain ence [GenBank: KJ701019 dan KJ701020].
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 4 dari 9 Gambar. 3 berbasis gen Kekhususan IBV N hijau SYBR I real-time
RT-PCR. Amplifikasi petak mewakili IBV (H120, MA5, 4/91), FLUAV, IBDV, NDV, dan kontrol negatif (NC). Kurva biru
menunjukkan plot amplifikasi sampel IBV-positif sementara kurva pirus menunjukkan plot dari IBV- strain negatif. FLUAV flu
burung virus A, IBV virus bronkitis menular, IBDV bursal menular virus penyakit, NDV newcastle virus penyakit

Diskusi Penggunaan PCR untuk diagnosis penyakit virus telah meningkat ke titik bahwa uji ini sekarang dianggap
sebagai standar emas bukan isolasi virus [ 20]. Real-time PCR telah dikatalisasi penerimaan yang lebih luas dari
PCR sebagai alat tic diagnos- karena lebih cepat, sensitif, dan reproduci- ble, dan risiko kontaminasi akumulasi
diminimalkan dibandingkan dengan PCR konvensional [21].
Ara. 4 SYBR hijau I real-time RT-PCR amplifikasi Plot berasal dari cDNA dari IBV H120 galur vaksin. IBV virus bronkitis
menular, RT

Diagnosis IB umumnya didasarkan pada isolasi virus dalam telur berembrio, diikuti oleh imunologi identi- PCR
reverse transcriptase-polymerase chain reaction
fikasi dari isolat. Prosedur ini adalah waktu yang ditangkap di dan membutuhkan penggunaan poliklonal tertentu
atau monoklonal
Tabel 1 Sensitivitas dan spesifisitas SYBR Hijau I real-time RT-PCR di deteksi cDNA dari strain vaksin IBV H120
dibandingkan dengan RT-PCR elektroforesis gel agarosakonvensional
cDNAkonsentrasi
metodeDetection (log
10
eksemplar / ml)
SYBR hijau I real-timeRT-PCR konvensional
RT-PCR
nilaiCt Sensitivitas Spesifisitas P / NP /
N%CI% CI
101 36,31 0 0-69,5 100 19,3-100 - - 102 33,19 33,33 5,5-88,4 100 19,3-100 + - 103 26,59 66,67 11,6-94,5 100 19,3-100 + + 104
24,79 100 30,5-100 100 19,3-100 + + 105 21.90 100 30,5-100 50 8,2-91,8 + + 106 17,29 100 30,5 -100 0 0-80,7 + +
CI interval kepercayaan, Ct ambang siklus rata-rata, RT-PCR membalikkan reaksi transcriptase-polymerase chain, + positif (P), -
negatif (N)
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 5 dari 9 Gambar. 5 Simple garis regresi linear pengenceran serial (106-10
salinan / ml) dari nilai-nilai Ct vs log
10
dari sepuluh kali lipat standar genom RNA dari cDNA dari H120 galur vaksin. Ctambang siklus

genmemiliki sensitivitas yang lebih tinggi daripada konvensional RT-PCR dalam mendeteksi IBV asam nukleat.
Menargetkan gen N telah didalilkan menjadi pilihan yang lebih baik untuk meningkatkan sensitifitas sen- dari PCR
dibandingkan dengan gen S1, sebagai N pro-Tein berlimpah dalam sel yang terinfeksi [9, 27].
Kekhasan uji kami ditunjukkan oleh tidak adanya reaksi positif dengan genetik mate- rial diperoleh dari virus
RNA lain, seperti FLUAV,
Gambar. 6 Agarose gel elektroforesis produk RT-PCR konvensional dari gen N dari IBV H120 ketegangan. Produk diperkuat
yang sepa- dinilai dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5% dan diwarnai dengan

IBDV, dan NDV (Gambar. 3). Puncak lebur optimal IBV amplikon strain adalah 68 ± 0,20 ° C. Tidak ada
primer-dimer atau produk spesifik yang terdeteksi. Hasil ini bromida ethidium. Lane 1 100 bp DNA ladder; jalur 2
107 eksemplar / ml;
sebanding dengan yang dilaporkan sebelumnya hijau SYBR
saya realtime jalur 3 106 eksemplar / ml; jalur 4 105 eksemplar / ml; lane 5 104 eksemplar / ml; jalur 6 103 eksemplar / ml; lane 7
102 eksemplar / ml; jalur 8 10 eksemplar / ml. IBV virus bronkitis menular, RT-PCR membalikkan rantai
transcriptase-polymerase reac- tion

waktu tes RT-PCR didirikan untuk coronavirus dan tipe tertentu IBV multipleks SYBR hijau I real-time RT PCR
[24, 28].
SYBR hijau Aku real-time RT-PCR dan konvensional RT PCR yang diterapkan untuk 34 sampel klinis yang
diperoleh dari antibodi, yang mungkin tidak tersedia. Selain itu, beberapa
ternak ayam broiler Maroko menunjukkan tanda-tanda
klinis dari isolat bisa menjadi campuran dari serotipe yang berbeda dari IBV
IB. IBV N gen amplifikasi dengan SYBR hijau I
real-time yang dapat membingungkan interpretasi hasil. RT-PCR tech-
RT-PCR dideteksi semua strain IBV yang dinilai,
sedangkan tehnik menggunakan RNA diekstraksi dari cairan allantoic dan raksasa melewati
hanya 28 dari 34 penyeka klinis diuji positif untuk
IBV penyeka cheal dari ayam IBV terinfeksi sangat efisien
dengan RT konvensional -PCR. Meningkatkan
sensitivitas dari dalam mendeteksi IBV [22, 23]. Namun, konvensional
real-time RT-PCR dibandingkan dengan konvensional
RT-PCR RT-PCR adalah memakan waktu, rawan kesalahan, dan kurang
mungkin disebabkan karena deteksi sinyal neon emit-
sensitif daripada real-time RT-PCR [3 , 9, 24-26].
ted oleh produk amplifikasi tertentu [24]. Oleh karena
itu, Dengan hijau SYBR I real-time RT-PCR assay bahwa kita
SYBR Hijau I real-time RT-PCR assay dikembangkan
di sini dikembangkan, kami membandingkan kinerja novel ini
menggunakan kasus lapangan Maroko bisa menjadi
teknik alat penting untuk konvensional agarosa gel berbasis RT-PCR di
untuk screening sampel selama IB-dugaan kasus
mendeteksi produk IBV RT-PCR spesifik. Berdasarkan seri-
sebagai uji yang cepat, sederhana, efisien, sangat
spesifik, dan sekutu diencerkan standar cDNA, yang SYBR hijau saya real-time
sensitif. RT PCR terdeteksi turun ke 100 cDNA
salinan / ml dari IBV
Baru-baru ini, real-time tes RT-PCR digambarkan
bahwa H120 vaksin regangan bahan genom. The SYBR hijau saya
bisa mendeteksi IBV baik semata-mata atau dalam
satu set multipleks [24, 26, real-time RT PCR assay menargetkan sangat dilestarikan N
28,29]. Namun, tidak ada tes ini dimanfaatkan SYBR
Gambar. 7 Receiver operasi analisis kurva karakteristik dari nilai-nilai Ct diperoleh dari-I berbasis green SYBR real-time RT-PCR
terhadap conven- tional RT-PCR. RT-PCR terbalik transcriptase-polymerase chain reaction
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 6 dari 9 Gambar. 8 deteksi Virus di penyeka trakea dengan hijau SYBR I
real-time RT-PCR. Penyeka trakea (34) diambil dari ayam broiler acara-ing tanda-tanda klinis bronchitis menular. Sebuah subset
dari hasil dari 34 penyeka trakea menggunakan SYBR hijau I real-time RT-PCR yang akan ditampilkan. Kontrol negatif NC,
RT-PCR reverse-transcriptase reaksipolymerase chain
Tabel 2 Intra dan inter-assay reproduktifitas SYBR-I-berbasis greenreal-timeRT-PCR
koefisienCV variasi

hijau Saya kimia untuk deteksi spesifik dan tion quantifica- dari IBV menargetkan gen N. Keuntungan utama dari
SYBR hijau saya tes lebih dari format deteksi PCR real-time lainnya adalah: (1) SYBR hijau saya adalah murah
fluorochrome; (2) SYBR hijau saya tes lebih sederhana untuk digunakan, terutama dalam hal primer desain dan
optimasi prosedur [25]; dan (3) artefak umum diamati pada probe yang spesifik, terutama pada siklus amplifikasi
melebihi putaran ke-30, yang minimal dan dapat dikesampingkan dengan pelelehan analisis kurva. Uji dijelaskan di
sini karena itu ideal untuk membangun IB kemampuan diagnostik di negara-negara berkembang seperti Maroko.
Kesimpulan Sebagai kesimpulan, kami melaporkan untuk pertama kalinya satu langkah SYBR hijau I real-time
protokol RT-PCR untuk deteksi gen IBV N. Assay adalah yang sensitif, sederhana, efisien, dan
metodehemat biaya yang dapat diterapkan dengan mudah untuk labo-
Copy
Berarti
Intra-assay
Inter-assay

ratory diagnosis infeksi IBV. Jumlah

persimpangan titik
CV (%)
CV (%)
101 32,90 1,5 102 28,25 1,2 103 25,17 0,9 104 21,84 0,7 105 18,26 0,6 106 16,63 0,6 1,6 1,8 1,4 1,2 0,7 0,6

Metode Virus IBV disebarkan di 9-11-hari-tua spe berembrio - cific telur ayam bebas patogen seperti yang
dijelaskan sebelumnya [30]. Cairan allantoic dipanen 48 jam tion pasca-inocula- dan disimpan pada -80 ° C sampai
ekstraksi RNA. Virus ferent yang dif- digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 3.
sampel standar Klinis Untuk memvalidasi keandalan SYBR hijau berbasis-I real-time RT-PCR, diukur IBV
Beaudette ketegangan digunakan sebagai kontrol standar, dan allantoic cairan dengan titer ferent dif- virus diperoleh.
Penyeka trakea dari ayam IBV terinfeksi sampel trakea diperoleh dari Unit Avian, Agronomi dan Kedokteran Hewan
Institut Hassan II, Rabat, Maroko. Sampel ini diidentifikasi selama upaya diagnostik tine rou- dan berasal dari 34
ekor ayam broiler commer- resmi dengan tanda-tanda klinis menunjukkan IB, termasuk batuk, bersin, rales, dan
nasal discharge. Semua sampel telah dikonfirmasi untuk menjadi IBV-positif dengan isolasi virus, tetapi serotipe
tidak ditentukan. Untuk penelitian ini, semua sampel diuji oleh-I berbasis green SYBR real-time RT-PCR dan
konvensional RT-PCR. Penyeka dihentikan pada 300 ml phosphate-buffered saline,
Gambar. 9 Agarose gel elektroforesis dari satu langkah RT-PCR produk diperkuat dari gen IBV S1. Vaksin komersial IBV (IBV
H120, MA5, dan 4/91) dan strain lapangan ( “Maroko 30” dan “Maroko 38”) dipisahkan dengan elektroforesis pada gel agarosa
1,5% bernoda dengan etnik yang idium bromida. Lane 1 100 bp DNA ladder; jalur 2 Maroko 30 galur; jalur 3 kontrol negatif;
jalur 4 Maroko 38 galur; jalur 5, 6 kontrol negatif; lane 7 MA5 vaksin komersial; jalur 8 H120 vaksin komersial; lane 9 4/91
vaksin komersial. Ukuran produk, 700 bp. Pasangan basa bp, IBV menular virus bronkitis, RT-PCR membalikkan transcriptase-
reaksi berantai polimerase
 Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 7 dari 9 Tabel 3 Virus yang digunakan dalam penelitian ini
(konsentrasi akhir primer masing-masing adalah 10 M) dan cukup
Virus strain Sumber
Jenis vaksin

diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 1500 × g pada 4 ° C selama 15 min, dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1
jam. The virus- mengandung supernatan yang diperoleh dari penyeka trakea digunakan untuk ekstraksi langsung dari
RNA virus.
Ekstraksi RNA IBV RNA dan kontrol RNA negatif (NDV [183,6 ng / ml], IBDV [67,5 ng / ml], FLUAV [92,1 ng /
ml]) yang diekstrak dari 140 ml supernatan dari cairan allantoic menggunakan QIAamp Viral RNA atau RNeasy Kit
Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Setiap fraksi RNA dielusi di 50 ml air RNase
bebas.
SYBR hijau berbasis-I real time RT PCR SYBR hijau I-berdasarkan real time RT-PCR dilakukan dengan
menggunakan sepasang primer yang terdiri dari (a) primer hilir, AIBV-fr, menargetkan posisi gen N nukleotida
811-832 (5' ATGCTCAACCTTGTCCCTAGCA-3 '); dan (b) hulu primer, AIBV-sebagai, menargetkan posisi gen N
nukleotida 921-941 (5'-TCAA-ACTGCGGATCA-TC ACGT-3 ', TIB Molbiol, Berlin, DE) seperti yang dijelaskan
sebelumnya oleh Meir et al. [9]. Untuk meminimalkan pembentukan primer-dimer, konsentrasi set primer dan
kondisi thermocycling keduanya dioptimalkan (data tidak ditampilkan).
PCR dilakukan pada Cahaya Cycler (Roche Diag- nostics Ltd Rotkreuz, CH). Setiap reaksi dilakukan dengan
menggunakan 5 ml RNA dimurnikan dan 20 ml dari campuran reaksi, yang mengandung 0,5 ml RT (50 U) (Applied
Biosystems, Grand Island, NY, USA), 0,5 ml RNase inhibitor (20 U), 0,5 ml
MgCl2

air nuklease bebas (Promega, Madison, WI, USA) untuk volume akhir 20 uL untuk setiap reaksi. The pro termal
Infectious bronchitis
virus (IBV)
H120 MA5 Biopharma
Massachussetts serotipevaksin MSD Kesehatan Hewan Nobilis IB MA5

berkasterdiri dari 10 menit dari transkripsi terbalik pada 50 ° C, 10 menit dari hot-start aktivasi enzim pada 95 ° C,
diikuti oleh 45 siklus PCR pada 95 ° C selama 10 s (denaturasi), 58 ° C selama 20 s (anil), dan 72 ° C selama 30 s
(elongasi). Untuk menghindari 4/91 MSD Kesehatan Hewan
lintas kontaminasi dan sampel akumulasi, sebelum dan sesudah Nobilis IB vaksin 4/91
PCR pengolahan sampel dilakukan di kamar terpisah.
Virus penyakit Beaudette Newcastle
(NDV)
Ploufragan-Plouzané
laboratoriumLiar dilemahkan ketegangan

Terpasang kiat pipet yang digunakan untuk mentransfer semua cairan untuk elim- aerosol inate. Produk cDNA
diperkuat terdeteksi oleh mencair analisis kurva yang terdiri dari 95 ° C selama 5 s dan 65 ° C selama 60 s, dan
dipanaskan sampai 97 ° C untuk mengukur perubahan secara terus-ous di fluoresensi dari SYBR hijau I. Setelah
amplifikasi, peleburan sebuah analisis kurva dilakukan dengan perangkat lunak Cahaya Cycler instrumen (software
rilis 1.5.0, versi 1.5.0.39) sesuai dengan petunjuk dari produsen. Negatif kontrol template (air dietil pyrocar-
Bonate-diperlakukan) dan Template positif kontrol (yaitu, NDV, IBDV, FLUAV) yang disertakan dengan setiap PCR
dijalankan. Masing-masing strain yang digunakan diuji dalam rangkap tiga.
Reproduksibilitas-I berbasis green SYBR real-time RT-PCR Untuk mengevaluasi reproduktifitas penetapan kadar,
analisis kuantifikasi IBV cDNA dikembangkan menggunakan sampel 34 clini- cal standar dari ayam broiler Maroko.
cDNA dari RNA genom dari IBV Beaudette strain digunakan sebagai sumber template DNA. Setelah tion
quantifica-, IBV Beaudette ketegangan cDNA serial diencerkan (106-10 salinan / ml) dan digunakan sebagai kontrol
standar. Tiga seri pengenceran terpisah diuji dalam menjalankan tunggal untuk mengevaluasi variasi intra-assay,
sedangkan variasi antar-assay diukur dengan menguji masing-masing pengenceran di tiga kali berturut-turut
terpisah. Standar deviasi (SD) dihitung menggunakan Light Cycler Software 480 versi 1.5 (Roche Diagnostics Ltd
Rotkreuz, CH). Koefisien variasi (CV) ditentukan mengikuti rumus CV = (SD [Ct-nilai] / keseluruhan berarti
[Ct-nilai]) ×
100.-I-berbasisgreen Sensitivitas SYBR real-time RT-PCR Sensitivitas yang berbasis hijau-I SYBR real-time assay
RT PCR diuji oleh pengenceran uji membatasi [31]. RNA genomik dari vaksin H120 dilemahkan Massachusetts
serotipe kemudian diencerkan ke ≈100 (151,6 ng / ml), 20 (35,6 ng / ml), 5 (12,9 ng / ml), dan 1,25 (0,7 ng / ml)
salinan / ml seperti sebelumnya dijelaskan [32]. Tabung pada setiap konsentrasi diuji menggunakan maju dan reverse
primer. Prinsip keuangan sam- dengan nilai-nilai Ct kurang dari 32 dianggap positif.
Sebaliknya transcriptase polymerase chain reaction konvensional konvensional RT-PCR dilakukan dalam thermal
cycler (Techne, Staffordshire, UK), sesuai dengan petunjuk Lasota Biopharma
HB1 jenis, Lasota galurbursal Infeksi
penyakitvirus (IBDV)
bidang Maroko regangan Biopharma
Vaksin Strain influenza Avian virus
(FLUAV)
subtipe H5N1 Biopharma
dilemahkan vaksin
galur

(50 mM), 2 ml FastStart DNA Guru Mix SYBR hijau saya (yang mengandung Taq DNA polymerase, SYBR
hijau saya, campuran trifosfat deoksinukleotida [Life Technologies, Grand Island, NY, USA] ), dan 0,5 ml dari dua
primer
Halaman Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9: 231 8 dari 9 disediakan oleh produsen. RT-PCR per- dibentuk
dalam satu langkah, dalam volume akhir 20 ml. Secara singkat, volume akhir terdiri (25 mM), 2,5 ml
deoxyribonucleotide 2,5 ml buffer, 2,5 trifosfat
ml
MgCl2

(10 mM), 9,7 ml air, 0,5 ml RNase inhibitor (20 U), 0,3 ml reverse transcriptase (50 U), 0,5 ml Taq poli- merase
(Emas) (5 U), dan 0,75 ml dari masing-masing primer (maju dan mundur) (10 M).
Salah satu langkah, reverse transkripsi dilakukan pada 48 ° C selama 30 menit dan 95 ° C selama 5 menit. cDNA
ampli- fied melalui 35-siklus PCR yang terdiri dari denaturasi pada 94 ° C selama 30 s, anil pada 52 ° C selama 30 s,
dan ekstensi pada 72 ° C selama 30 s, dengan satu siklus ekstensi akhir pada 72 ° C selama 10 menit. Produk PCR
yang diperkuat dari gen N dievaluasi oleh 1,5% agarose elektroforesis gel dalam buffer Tris-borat-EDTA diwarnai
dengan ethidium bro- mide (Promega).
Perbandingan sensitivitas dan spesifisitas SYBR hijau I real-time RT-PCR dengan assay RT-PCR konvensional
Sensitivitas analisis dan spesifisitas hijau SYBR I real-time assay RT-PCR ditentukan oleh Test- ing pengenceran
sepuluh kali lipat berurutan dalam vitro-ditranskripsi RNA, yang diperoleh seperti yang dijelaskan sebelumnya,
dalam air nuklease bebas (Promega).
Satu langkah RT-PCR amplifikasi dari IBV S1 gen PCR amplifikasi gen IBV S dilakukan dengan menggunakan
vaksin komersial (H120, MA5 dan 4/91) dan strain lapangan, “Maroko 30” dan “Maroko 38” dari ayam dengan
tanda-tanda pernapasan. Setiap 25 ml PCR campuran tion reac- terdiri dari 2,5 ml buffer (10X), 2,5 ml
MgCl2

urutan ditentukan menggunakan primer yang sama (S15mod dan CK2) [19] dan BigDye® Terminator v1.1 Cycle
Sequencing Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Pemurnian kedua dilakukan oleh Big Dye X
terminator Pemurnian Kit.
Analisis statistik perbedaan yang signifikan antara rata-rata nilai Ct sesuai untuk setiap pengenceran virus yang
dianalisa dengan analisis satu arah varians (ANOVA) menggunakan Paket Statistik untuk Ilmu Sosial (SPSS) ver-
sion 13 software (IBM, Armonk , NY, USA). Sebuah penerima operasi kurva karakteristik uji statistik digunakan
untuk membandingkan sensitivitas dan spesifisitas dari SYBR--I-berbasis green real-time RT-PCR selama
konvensional RT-PCR. Nilai p kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Singkatan bp: pasangan basa; Ct: ambang batas siklus; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay; FLUAV: virus flu burung;
IB: bronkitis menular; IBDV: infeksi virus penyakit bursal; IBV: virus bronkitis menular; M: protein membran; N: protein
nukleokapsid; NC: kontrol negatif; NDV: virus penyakit newcastle; RNA: asam ribonukleat; RT-PCR: membalikkan reaksi
berantai transcriptase-polymerase; S: lonjakan protein.
Kontribusi penulis MME dikandung penelitian, dan SF, MEH, MME berpartisipasi dalam desain penelitian. SF, KK, dan MEH
dianalisis dan diinterpretasikan data. SF, MEH, GS, dan MME dirancang dan SF, MEH, dan JHK diedit naskah. EB berpartisipasi
dalam analisis statistik. SF dan KK berpartisipasi dalam analisis molekuler. OFF berpartisipasi dalam virus sequencing. Semua
penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Rincian penulis

(25 mM), 2,5 ml Deoksinukleotida triphos-

1 Unit Avian Patologi, agronomi dan Kedokteran Hewan Institut Hassan II, BP 6202, Rabat, Maroko. 2
Laboratorium Virologi, Mikrobiologi dan Kualitas / phates (10 mM), 0,75 ml masing-masing primer (10 M) (CK2
dan S15mod) [19], dan 9,7 ml air steril. Pada akhirnya, 0,5 ml RNAase inhibitor (20 U / ml), 0,3 ml RT (50
Ekotoksikologi & Keanekaragaman, Fakultas Ilmu dan Teknik-Universitas Hassan II Mohammedia, PO Box 146, Quartier
Yasmina-Mohammedia, 20.650 Casablanca, Maroko . 3 Laboratory of Molecular Biology-Society of Biological Products and
Veterinary Pharmaceuticals (Biopharma), BP 4569, U/μl), 0.5 μl of Taq gold polymerase (ThermoFisher Sci- entific) (5 U/μl), and
5 μl of IBV RNA were added. This one-step RT-PCR reaction was carried out using Smart
Km 2, Route de Casa, Rabat, Morocco. 4 Integrated Research Facility at Fort Detrick, National Institute of Allergy and Infectious
Diseases, National Institutes of Health, B-8200 Research Plaza, Fort Detrick, Frederick, MD 21702, USA. 5 Laboratory of
Epidemiology and Clinical Research. Faculty of Medicine, BP Thermal Cycler, (Smart Cycler Cepheid, Sunnyvale, CA,

1014, 4, Avenue Ibn Battouta, Rabat, Morocco. USA)

following the protocol of 48 °C for 30 min, 95 °C for 5 min, 40 cycles of 95 °C for 30 s, 52 °C for 30 s, 72 °C for
Acknowledgements We thank Laura Bollinger (Integrated Research Facility at Fort Detrick) for pro- 30 s, and a final extension
cycle of 72 °C for 10 min.
viding Technical Writing Services in critically editing this manuscript on behalf of Battelle Memorial Institute.
Nucleotide sequencing and sequence analysis

Competing interests Following amplification, 20 μl of

each S1 PCR reaction
The authors declare that they have no competing
interests. for “Moroccan 30” and “Moroccan 38” field strains and vaccine strains (H120, Ma5 and 4/91) were
subjected to
Sources of support The content of this publication does not necessarily reflect the views or 1.5 % agarose gel
electrophoresis (under 70 V for 30 min) and stained with ethidium bromide. The appropriate bands were excised and
purified using the Gene Clean Kit
policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the
authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute's prime contract with the US National Institute of
Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract (ExoSAP-IT, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) accord- ing to the
manufacturer's recommendations. Nucleotide
No. HHSN272200700016I. A subcontractor to Battelle Memorial Institute who performed this work is JHK, an employee of
Tunnell Government Services, Inc. The Agronomic and Veterinary Institute Hassan II, Rabat, Morocco, Ministry of
Page 9 of 9 Fellahi et al. BMC Res Notes (2016) 9:231
Higher Education of Morocco, University Hassan II Mohammedia-Casablanca, Mohammedia, Morocco, and the Society of
Biological Products and Veterinary Pharmaceuticals (Biopharma), Rabat, Morocco, sponsored the molecular analyses and
sequencing of the different samples.
Received: 1 February 2015 Accepted: 11 April 2016
References 1. Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus. Vet Res.
2007;38(2):281–97. 2. Keeler CL Jr, Reed KL, Nix WA, Gelb J Jr. Serotype identification of avian
infectious bronchitis virus by RT-PCR of the peplomer (S-1) gene. Avian Dis. 1998;42(2):275–84. 3. Callison SA, Riblet SM,
Oldoni I, Sun S, Zavala G, Williams S, Resurreccion
RS, Spackman E, Garcia M. Development and validation of a real-time Taqman PCR assay for the detection and quantitation of
infectious laryn- gotracheitis virus in poultry. J Virol Methods. 2007;139(1):31–8. 4. Alarabi MAH: A field study of kidney
disease among the broiler flocks in
Morocco and its relationship to infectious bronchitis virus. Ph.D tesis. Agronomic and Veterinary Institute Hassan II, Rabat;
2004. 5. El Bouqdaoui M, Mhand RA, Bouayoune H, Ennaji MM. Genetic group-
ing of nephropathogenic avian infectious bronchitis virus isolated in Morocco. Int J Poult Sci. 2005;4:721–7. 6. El-Houadfi M,
Jones RC, Cook JK, Ambali AG. The isolation and characteri- sation of six avian infectious bronchitis viruses isolated in
Morocco. Pathol Avian. 1986;15(1):93–105. 7. King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, eds. Virus taxonomy: clas-
sification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego:
Elsevier Academic Press; 2012. http://www.ictvonline.org/index.asp?bhcp=1. Accessed 19 Sept 2014. 8. Lai MM, Cavanagh D.
The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus
Res. 1997;48:1–100. 9. Meir R, Maharat O, Farnushi Y, Simanov L. Development of a real-time
TaqMan RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus in chickens, and comparison of RT-PCR and virus
isolation. J Virol Methods. 2010;163(2):190–4. 10. Kwon HM, Jackwood MW, Gelb J Jr. Differentiation of infectious bronchitis
virus serotypes using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Avian Dis.
1993;37(1):194–202. 11. Karaca K, Naqi S. A monoclonal antibody blocking ELISA to detect
serotype-specific infectious bronchitis virus antibodies. Vet Microbiol. 1993;34(3):249–57. 12. Karaca K, Naqi S, Gelb J Jr.
Production and characterization of monoclo-
nal antibodies to three infectious bronchitis virus serotypes. Avian Dis. 1992;36(4):903–15. 13. Naqi SA, Karaca K, Bauman B.
A monoclonal antibody-based antigen cap-
ture enzyme-linked immunosorbent assay for identification of infectious bronchitis virus serotypes. Pathol Avian.
1993;22(3):555–64. 14. Jackwood MW, Yousef NM, Hilt DA. Further development and use of a
molecular serotype identification test for infectious bronchitis virus. Avian Dis. 1997;41(1):105–10. 15. Kingham BF, Keeler CL
Jr, Nix WA, Ladman BS, Gelb J Jr. Identification of
avian infectious bronchitis virus by direct automated cycle sequencing of the S-1 gene. Avian Dis. 2000;44(2):325–35. 16.
Cavanagh D, Davis P, Cook J, Li D. Molecular basis of the variation exhib-
ited by avian infectious bronchitis coronavirus (IBV). Adv Exp Med Biol. 1990;276:369–72.
17. Callison SA, Hilt DA, Boynton TO, Sample BF, Robison R, Swayne DE,
Jackwood MW. Development and evaluation of a real-time Taqman RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus
from infected chickens. J Virol Methods. 2006;138(1–2):60–5. 18. Hairul Aini H, Omar AR, Hair-Bejo M, Aini I. Comparison of
Sybr Green I,
ELISA and conventional agarose gel-based PCR in the detection of infec- tious bursal disease virus. Microbiol Res.
2008;163(5):556–63. 19. Eterradossi N, Britton P: Avian infectious bronchitis. In: Biological Stand-
ards Commission, editor. Manual of diagnostic tests and vaccines for ter- restrial animals. edn. World Organisation for Animal
Health; 2013. http:// www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.02_AIB. pdf. Accessed 2 May 2014. 20. De
Wit JJ. Detection of infectious bronchitis virus. Pathol Avian.
2000;29(2):71–93. 21. Mackay IM. Real-time PCR di laboratorium mikrobiologi. Clin Microbiol
Infect. 2004;10(3):190–212. 22. Cavanagh D, Mawditt K, Britton P, Naylor C. Longitudinal field studies of
infectious bronchitis virus and avian pneumovirus in broilers using type- specific polymerase chain reactions. Pathol Avian.
1999;28(6):593–605. 23. Handberg K, Nielsen O, Pedersen M, Jorgensen P. Detection and strain
differentiation of infectious bronchitis virus in tracheal tissues from experimentally infected chickens by reverse
transcription-polymerase chain reaction. Comparison with an immunohistochemical technique. Pathol Avian. 1999;28(4):327–35.
24. Acevedo AM, Perera CL, Vega A, Rios L, Coronado L, Relova D, Frias MT,
Ganges L, Nunez JI, Perez LJ. A duplex SYBR Green I-based real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection and
differentiation of Massa- chusetts and non-Massachusetts serotypes of infectious bronchitis virus. Mol Cell Probes.
2013;27(5–6):184–92. 25. Aldea C, Alvarez CP, Folgueira L, Delgado R, Otero JR. Rapid detection of herpes simplex virus DNA
in genital ulcers by real-time PCR using SYBR green I dye as the detection signal. J Clin Microbiol. 2002;40(3):1060–2. 26.
Cavanagh D, Gelb J: Infectious bronchitis. In: Saif Y, editor. Diseases of
poultry, 12 edn. Ames: Blackwell Publishing Professional; 2008. p. 117–30.
https://www.himakahaunhas.files.wordpress.com/2013/2003/disease-of- poultry.pdf. 27. Spencer KA, Hiscox JA. Expression and
structural analysis of infectious bronchitis virus nucleoprotein. Adv Exp Med Biol. 2006;581:133–8. 28. Escutenaire S, Mohamed
N, Isaksson M, Thoren P, Klingeborn B, Belak S,
Berg M, Blomberg J. SYBR Green real-time reverse transcription-polymer- ase chain reaction assay for the generic detection of
coronaviruses. Arch Virol. 2007;152(1):41–58. 29. Fan WQ, Wang HN, Zhang Y, Guan ZB, Wang T, Xu CW, Zhang AY, Yang
X. Comparative dynamic distribution of avian infectious bronchitis virus M41, H120, and SAIBK strains by quantitative
real-time RT-PCR in SPF chickens. Biosci Biotechnol Biochem. 2012;76(12):2255–60. 30. Villarreal LY, Brandao PE, Chacon
JL, Saidenberg AB, Assayag MS, Jones
RC, Ferreira AJ. Molecular characterization of infectious bronchitis virus strains isolated from the enteric contents of Brazilian
laying hens and broilers. Avian Dis. 2007;51(4):974–8. 31. Taswell C. Limiting dilution assays for the determination of
immunocom-
petent cell frequencies. I. Data analysis. J Immunol. 1981;126(4):1614–9. 32. Chandriani S, Ganem D. Array-based transcript
profiling and limiting-
dilution reverse transcription-PCR analysis identify additional latent genes in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol.
2010;84(11):5565–73.