Mikroba & Infeksi yang Muncul

2020, VOL. 9
https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1772678

ddPCR: alat yang lebih akurat untuk deteksi SARS-CoV-2 pada spesimen viral load rendah

Tao Suo Sebuah* , Xinjin Liu b * , Jiangpeng Feng b * , Ming Guo b * , Wenjia Hu c * , Dong Guo b , Ha fi z Ullah b , Yang Yang b ,
Qiuhan Zhang b , Xin Wang b , Muhanmmad Sajid b , Zhixiang Huang b , Liping Deng c , Tielong Chen c , Fang Liu b ,
b , Yingle Liu b , Yong Xiong c , Guozhong Chen Sebuah , Ke Lan b, d dan Yu Chen b
Ke Xu b , Yuan Liu b , Qi Zhang
Sebuah Laboratorium Kunci Negara Virologi, Rumah Sakit Renmin, Universitas Wuhan, Wuhan, Manusia ' s Republik Cina; b Laboratorium Utama Negara Virologi, Pusat Penelitian
Virologi Modern, Sekolah Tinggi Ilmu Hayati, Universitas Wuhan, Wuhan, Manusia ' s Republik Cina; c Departemen Penyakit Menular, Rumah Sakit Zhongnan, Universitas Wuhan,
Wuhan, Orang ' s Republik Cina; d Pusat Sains Perbatasan untuk Imunologi dan Metabolisme, Universitas Wuhan, Wuhan, Manusia ' s Republik Cina

ABSTRAK
PCR waktu nyata kuantitatif (RT-PCR) banyak digunakan sebagai standar emas untuk deteksi klinis SARS-CoV-2. Namun, karena spesimen viral load rendah
dan keterbatasan RT-PCR, signifikan fi jumlah laporan negatif palsu yang tidak dapat dihindari, yang mengakibatkan kegagalan untuk mendiagnosis tepat waktu,
potong o ff transmisi, dan menilai kriteria pembuangan. Untuk memperbaiki situasi ini, droplet digital PCR (ddPCR) yang dioptimalkan digunakan untuk
mendeteksi SARS-CoV-2, yang menunjukkan bahwa batas deteksi ddPCR adalah signifikan. fi lebih rendah dari RT-PCR. Kami lebih jauh mengeksplorasi
kelayakan ddPCR untuk mendeteksi SARS-CoV-2 RNA dari 77 pasien, dan membandingkan dengan RT-PCR dalam hal akurasi diagnostik berdasarkan hasil
survei tindak lanjut. 26 pasien COVID-19 dengan laporan RT-PCR negatif dilaporkan positif oleh ddPCR. Sensitivitas, spesi fi kota, PPV, NPV, rasio kemungkinan
negatif (NLR) dan akurasi ditingkatkan dari 40% (95% CI: 27 - 55%), 100% (95% CI: 54 - 100%), 100%, 16% (95% CI: 13 - 19%), 0,6 (95% CI: 0,48 - 0,75) dan 47%
(95% CI: 33 - 60%) untuk RT-PCR hingga 94% (95% CI: 83 - 99%), 100% (95% CI: 48 - 100%), 100%, 63% (95% CI: 36 - 83%), 0,06 (95% CI: 0,02 - 0,18), dan 95%
(95% CI: 84 - 99%) untuk ddPCR. Selain itu, pemulihan 6/14 (42,9%) terdeteksi sebagai positif oleh ddPCR pada 5 - 12 hari setelah keluar. Secara keseluruhan,
ddPCR menunjukkan keunggulan dalam diagnosis klinis SARS-CoV-2 untuk mengurangi laporan negatif palsu, yang dapat menjadi pelengkap yang kuat untuk
RT-PCR.

SEJARAH PASAL Diterima 2 Mei 2020; Direvisi 16 Mei 2020; Diterima 19 Mei 2020

KATA KUNCI SARS-CoV-2; tetesan PCR digital; RT-PCR; deteksi klinis; negatif palsu

pengantar
Pandemi penyakit coronavirus 2019 (COVID-
19) yang disebabkan oleh infeksi virus korona 2 (SARS-CoV-2, juga
disebut sebagai HCOV-19) yang disebabkan oleh infeksi sindrom
pernafasan akut yang parah, menimbulkan ancaman besar bagi
kesehatan masyarakat di seluruh dunia [ 1 , 2 ]. Ini menghadirkan
tantangan besar untuk diagnosis patogen ini. Menurut Organisasi
Kesehatan Dunia (WHO) dan Pusat Pengendalian dan Pencegahan
Penyakit China (CDC), standar emas saat ini untuk diagnosis infeksi
SARS-CoV-2 didasarkan pada waktu nyata. fl uorescent kuantitatif PCR
(RT-PCR), yang dapat mendeteksi asam nukleat SARS-CoV-2 dari
pasien ' s spesimen [ 3 , 4 ]. Kelebihan metode RT-PCR adalah throughput karena itu, RT-PCR menghasilkan negatif palsu selama diagnosis
yang tinggi dan relatif sensitif. Namun pada praktek klinis telah
ditemukan beberapa pasien yang mengalami demam dan
menunjukkan gejala suspek pneumonia virus seperti lesi lobus bawah
paru-paru dengan chest computed tomography (CT), tetapi uji asam
nukleat tenggorokan.
usap menggunakan RT-PCR tidak menunjukkan hasil positif sampai 5 - 6
hari setelah timbulnya pneumonia virus. Hebatnya, dilaporkan bahwa
sekitar 60% dari infeksi SARS-CoV-2 tidak menunjukkan gejala [ 5 ].
Selain itu, diperkirakan hanya 30% - 60% hasil positif dapat diperoleh di
antara pasien COVID-19 yang menipu lebih lanjut fi rmed oleh CT dada
dan alat bantu diagnostik lainnya [ 6 ]. Hal ini mungkin dijelaskan oleh
viral load yang relatif rendah di usap tenggorokan pasien dan
keterbatasan teknologi RT-PCR, yang dengan mudah ff dipengaruhi
oleh penghambat sampel, ampli buruk fi kation e ffi ciency, kurang presisi
dalam sampel konsentrasi rendah, cut-o subjektif ff nilai-nilai dan
quanti tersebut fi kation tergantung pada kurva kalibrasi [ 7 - 9 ]. Oleh
klinis, yang mengarah pada potensi risiko penularan virus. Selain itu,
pasien yang seharusnya sembuh, yang akan segera keluar, terutama
membutuhkan tes asam nukleat virus dengan hasil negatif yang
sebenarnya untuk penipu fi rmation dan out of

KONTAK Yu Chen chenyu@whu.edu.cn ; Ke Lan klan@whu.edu.cn ; Guozhong Chen guozhongch6389@163.com ; Yong Xiong
yongxiong64@163.com
* Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama.

Data tambahan untuk artikel ini dapat diakses di https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1772678

© 2020 The Author (s). Diterbitkan oleh Informa UK Limited, diperdagangkan sebagai Taylor & Francis Group, atas nama Shanghai Shangyixun Cultural Communication Co., Ltd Ini adalah artikel Akses Terbuka yang didistribusikan di
bawah persyaratan Lisensi Atribusi Creative Commons ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan karya asli dikutip dengan benar.
1260 T. Suo dkk.
karantina untuk menghindari penularan dan kekambuhan virus. Oleh
karena itu, sangat diperlukan metode deteksi yang lebih sensitif dan
akurat untuk deteksi patogen yang melengkapi deteksi saat ini.
PCR digital didasarkan pada prinsip pengenceran terbatas,
PCR titik akhir, dan statistik Poisson, dengan quanti absolut. fi kation
sebagai jantungnya [ 10 ]. Sampel didistribusikan secara acak ke
dalam partisi terpisah (ribuan tetesan), beberapa di antaranya
tidak berisi template dan lainnya berisi satu atau lebih template.
Partisinya adalah ampli fi ed ke titik akhir dan kemudian dihitung
oleh pembaca tetesan untuk menentukan jumlah partisi positif,
dari mana konsentrasinya diperkirakan dengan pemodelan
sebagai distribusi Poisson. Oleh karena itu, quanti fi kation kurang a ff
dipengaruhi oleh ampli yang buruk fi kation e ffi efisiensi dan
penghambat ampli fi kation yang mungkin ada dalam sampel.
Proses partisi sampel juga e ff Secara efektif memusatkan molekul
cetakan dalam reaksi mikro, meningkatkan kepekaan analitis
untuk spesies langka dengan mengurangi persaingan antara di ff target Sampel usap tenggorokan dikumpulkan melalui mulut sesuai
yang salah untuk ampli fi reagen kation dalam campuran reaksi [ 11 - 13dengan pedoman sementara WHO, dan direndam dalam 500 μ l
]. Pada tahun 2011, Hindson mengembangkan teknologi droplet
digital PCR (ddPCR) berdasarkan PCR digital tradisional [ 14 ].
Campuran reaksi dapat dibagi menjadi puluhan ribu nanodroplet
selama proses berlangsung. Tetesan oli yang luas dan sangat
konsisten ini secara substansial meningkatkan jangkauan dinamis
deteksi dan akurasi PCR digital dalam format praktis dan berbiaya
rendah [ 15 ]. Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi ini telah
banyak digunakan, seperti analisis viral load absolut dari sampel
klinis, analisis variasi nomor salinan gen, deteksi alel langka,
ekspresi gen, analisis microRNA, dan deteksi edit genom [ 13 - 17 ].
Untuk meningkatkan akurasi diagnostik deteksi asam nukleat
SARS-Cov-2 dalam sampel viral load rendah menggunakan droplet
digital PCR, kami membandingkan rentang dinamis dan batas
deteksi (LoD) dengan probabilitas pengulangan 95% antara ddPCR
dan RT-PCR di laboratorium, dan menguji sampel klinis dari 77
pasien dengan ddPCR dan RT-PCR untuk perbandingan langsung.
Bahan dan metode
Pernyataan etika
Dewan peninjau kelembagaan Rumah Sakit Renmin Universitas
Wuhan menyetujui penelitian ini (WDRY2020K089). Persetujuan
tertulis telah diperoleh.
Pengumpulan spesimen
Pengumpulan data direncanakan sebelum dilakukan uji indeks
dan standar referensi (studi prospektif). Untuk melakukan tes
sampel klinis, tenggorokan
Sampel swab dari 63 pasien yang diduga pasien rawat jalan dan 14 pasien
yang diduga sembuh dikumpulkan oleh petugas medis ff s dari COVID-19
Renmin dan Rumah Sakit Zhongnan yang ditunjuk di Universitas Wuhan.
Sampel usap tenggorokan masing-masing pasien fi pertama kali
dikumpulkan untuk o ffi Diagnosis RT-PCR yang disetujui secara resmi di
rumah sakit dan laboratorium yang membutakan tes RT-PCR dan ddPCR
secara bersamaan dengan primer / set probe yang sama yang disetujui
oleh CDC China. Pasien dilakukan oleh rumah sakit secara mandiri.
Semua peristiwa yang terjadi di rumah sakit dan laboratorium tidak
diketahui satu sama lain selama pengujian. Survei tindak lanjut dan
informasi klinis dari kohort terdaftar dikumpulkan setelah tes laboratorium
oleh staf medis ff s.
Ekstraksi RNA
PBS dan pusaran dengan diameter manik-manik 3 mm (Novastar,
China) selama 15 detik segera. Total RNA diekstraksi dari
supernatan menggunakan QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen)
mengikuti pabrikan ' s instruksi. CDNA untai pertama disintesis
menggunakan PrimeScript RT Master Mix (TakaRa) dengan primer
acak dan primer oligo dT untuk pengujian selanjutnya dari RT-PCR
dan ddPCR di laboratorium secara bersamaan.
Primer dan probe
Primer dan probe (RainSure Scienti fi c) menargetkan ORF1ab
dan N SARS-CoV-2 menurut CDC Cina.
Target 1 (ORF1ab), meneruskan: 5 ′ - CCCTGTGGG
TTTTACACTTAA-3 ′,
kebalikan: 5 ′ - ACGATTGTGCATCAGCTGA-3 ′,
probe: 5 ′ - FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAA
GGTTATGG-BHQ1 - 3 ′;
Target 2 (N), maju: 5 ′ - GGGGAACTTCTCCT GCTAGAAT-3 ′,
kebalikan: 5 ′ - CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3 ′,
probe: 5 ′ - HEX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-
TAMRA-3 ′ [ 18 ].
Kerja PCR digital tetesan fl ow
Semua prosedur mengikuti petunjuk pembuatan Sistem PCR Digital
Droplet QX200 menggunakan supermix untuk probe (tanpa dUTP)
(Bio-Rad). Brie fl y, campuran reaksi PCR TaqMan dirakit dari 2 ×
supermix untuk probe (tanpa dUTP) (Bio-Rad), 20 × primer dan
probemix ( fi konsentrasi akhir 900 dan 250 nM, masing-masing) dan
template (volume variabel, cDNA sampel klinik atau standar DNA
linier) dalam a fi volume akhir 20 μ l. Dua puluh mikroliter dari setiap
campuran reaksi diubah menjadi tetesan dengan generator tetesan
QX200

(Bio-Rad). Sampel yang dipartisi tetesan kemudian dipindahkan ke
pelat 96-sumur, disegel dan didaur ulang dalam T100 Thermal Cycler
(Bio-Rad) di bawah protokol siklus berikut: 95 ° C selama 10 menit
(aktivasi polimerase DNA), diikuti oleh 40 siklus 94 ° C selama 30 detik
(denaturasi) dan 60 ° C selama 1 menit (anil) diikuti dengan in fi nite 4
derajat tahan. Pelat yang didaur ulang kemudian dipindahkan dan
dibaca di saluran FAMandHEX menggunakan pembaca QX200
(Bio-Rad). Untuk menghindari risiko infeksi virus dan hasil positif palsu
yang berpotensi akibat kontaminasi laboratorium, semua percobaan
dilakukan di dalam lemari biosafety di laboratorium biosafety
bertekanan negatif menggunakan fi tip filter.
RT-PCR
Primer dan probe yang digunakan dalam ddPCR juga digunakan dalam
sistem RT-PCR yang dibuat di laboratorium. A 20 μ l campuran reaksi
disiapkan berisi 8 μ l template (volume variabel, cDNA sampel klinik atau
standar DNA linier), 10 μ l reaksi bu ff eh, 1 μ l 20 × primer dan campuran
probe dan 1 µl campuran Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo fi sher).
Siklus termal dilakukan pada 95 ° C selama 5 menit dan kemudian 40
siklus 95 ° C selama 10 detik, 55 ° C selama 40 detik dalam sistem
Deteksi PCR Waktu Nyata Sentuh BIO-RAD CFX96 (Bio-Rad). Untuk
menghindari risiko infeksi virus dan kontaminasi laboratorium, tindakan
biosafety yang sama diambil seperti yang dilakukan untuk ddPCR.
Rentang dinamis dan LoD RT-PCR dan ddPCR
Rentang dinamis linier dari uji RT-PCR dan ddPCR dinilai
menggunakan pengenceran serial standar DNA linier yang berisi
wilayah target. Untuk menentukan LoD dari RT-PCR dan
ddPCR, cDNA sampel usap tenggorokan orang sehat dibubuhi
dengan standar DNA linier dalam konsentrasi serial yang
mendekati batas deteksi. LoD dihitung dengan analisis regresi
Probit dengan 95% probabilitas berulang, yang merupakan jenis
analisis regresi yang umum digunakan ketika secara empiris
menentukan batas analit yang dapat dideteksi secara andal
dengan uji molekuler [ 19 ].
Analisis statistik data
Analisis data ddPCR dilakukan dengan software analisis Quanta
Soft v.1.7.4.0917 (Bio-Rad) untuk menghitung konsentrasi target.
Populasi positif untuk setiap primer / probe diidentifikasi fi ed
menggunakan kontrol positif dan negatif dengan primer tunggal
(yaitu tidak multipleks) - set probe. Selain itu, plot regresi linier
dilakukan dengan GraphPad Prism 7.00, dan analisis probit
untuk LoD dilakukan dengan perangkat lunak MedCalc v19.2.1.
Mikroba & Infeksi yang Muncul 1261
Kasus kehilangan kontak tidak dimasukkan dalam studi
analisis kami karena kondisi yang tidak jelas. Laporan dugaan
ddPCR (perlu deteksi lebih lanjut) tidak dimasukkan dalam studi
analisis kami sesuai dengan pernyataan etika karena tidak ada
lagi pengambilan sampel untuk uji laboratorium. Hasil deteksi
dibandingkan dengan survei lanjutan termasuk catatan klinis CT
scan dada, IgM / IgG, deteksi etiologi lain, dan lebih lanjut. ffi cial
disetujui RT-PCR con fi rmation 2 - 12 hari kemudian. Kinerja
diagnostik RT - PCR dan ddPCR dihitung oleh MEDCALC ( https://www.medcalc.o
php ).
Hasil
Perbandingan rentang dinamis ddPCR dan RT-PCR
Untuk membandingkan rentang dinamis ddPCR dan RTPCR, pengenceran
serial dari standar DNA linier kontrol positif SARS-CoV-2 diuji
menggunakan primer / set probe yang menargetkan ORF1ab dan N dari
SARS-CoV-2 untuk ddPCR dan RT - PCR. Seperti yang ditunjukkan di Gambar
1 , kisaran ddPCR yang dapat dilaporkan adalah 10 - 5 × 10 4 salinan / reaksi
untuk kedua bilangan prima ORF1ab dan N / set probe dengan R2 =
0.9935 dan 0.9908, masing-masing ( Gambar 1
(A, B)). Sedangkan yang di RT-PCR adalah 1000 - 10 7
salinan / reaksi untuk kedua bilangan prima / probe ORF1ab dan N dengan
R2 = 0,9921 dan 0,9898, masing-masing ( Gambar 1 (CD)). Hasil penelitian
menunjukkan bahwa jangkauan deteksi minimum ddPCR adalah signifikan fi lebih
rendah dari RT-PCR.
Perbandingan LoD antara ddPCR dan RTPCR
Untuk lebih menentukan LoD ddPCR dan RT-PCR yang akurat,
standar DNA linier seri diencerkan ke konsentrasi di bawah
kisaran deteksi minimum ddPCR atau RT-PCR oleh cDNA sampel
usap tenggorokan dari orang sehat (dengan serum negatif SARS-
CoV-2 IgM / IgG), yang dapat bermanfaat fi t untuk mengurangi
hasil positif palsu (FPR). Setiap konsentrasi dianalisis dengan
delapan ulangan. LoD dihitung dengan regresi probit dengan 95%
probabilitas berulang. Seperti yang ditunjukkan di Gambar 2 , LoD
(95% probabilitas) dari ddPCR adalah 2,1 (95% CI: 1,5 - 4.2)
salinan / reaksi dan 1.8 (95% CI: 1.4 - 3.3) salinan / reaksi untuk
ORF1ab ( Gambar 2 (A)) dan N ( Gambar 2 (B)) primer / set probe,
masing-masing. Sebaliknya, LoD (95% probabilitas) dari RT-PCR
adalah 1039 (95% CI:
763.2 - 1862) salinan / reaksi dan 873,2 (95% CI:
639.8 - 1633.2) salinan / reaksi untuk ORF1ab ( Gambar 2
(C)) dan N ( Gambar 2 (D)) primer / set probe, masing-masing. Secara
bersama-sama, dengan ORF1ab dan N primes / probe set dan template
yang sama, ddPCR untuk SARS-
1262 T. Suo dkk.

Gambar 1. Plot hasil dari eksperimen linieritas untuk menentukan rentang ddPCR dan RT-PCR yang dapat dilaporkan yang menargetkan ORF1ab dan
N dari SARS-CoV-2. (A dan B) Nilai yang diharapkan (dikonversi ke log 10) diplot di X- sumbu versus nilai terukur dari ddPCR (con-
verted ke log 10) di Y- sumbu menggunakan penargetan Prisma Pad Grafik (A) ORF1ab dan (B) N. (C dan D) Nilai yang diharapkan (dikonversi ke log 10)
diplot di X- sumbu versus nilai Ct terukur dari RT-PCR di Y- sumbu menggunakan penargetan Graph Pad Prism (C) ORF1ab dan (D)
N. Data mewakili tiga percobaan independen dengan 3 ulangan untuk setiap konsentrasi (mean ± SD).

Deteksi CoV-2 dengan probabilitas 95%, sekitar 500 kali (maksimum) dugaan infeksi SARS-CoV-2, yang perlu deteksi lebih lanjut.
lebih sensitif daripada RT-PCR pada analit level rendah. Hasil 0 salinan / reaksi untuk ORF1ab dan N primer / set probe
dinilai sebagai negatif.
Seperti yang ditunjukkan di Gambar 3 , sampel usap tenggorokan masing-masing

diduga pasien rawat jalan fi pertama-tama dikumpulkan untuk tes RT-PCR

Deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 dari sampel usap
tenggorokan pasien dengan ddPCR dan RT-PCR
Untuk menghindari potensi FPR akibat kontaminasi laboratorium,
semua percobaan dilakukan di dalam lemari biosafety di laboratorium
biosafety bertekanan negatif menggunakan fi tip filter. Untuk menilai
lebih lanjut FPR sistematis, cDNA sampel usap tenggorokan dari orang
sehat diuji dengan ddPCR untuk 32 pengulangan (16 pengulangan
untuk setiap primer / set probe, data tidak ditampilkan). Secara total, 29
dari 32 hasil (91%) menunjukkan pembacaan negatif (0 salinan /
reaksi). Tiga dari 32 hasil (9%) menunjukkan satu tetesan positif tunggal
(sekitar 1 salinan / reaksi), yang kurang dari LoD ddPCR untuk ORF1ab
(2,1 salinan / reaksi) dan N (1,8 salinan / reaksi) primer / set probe .
Oleh karena itu, ambang positif ddPCR untuk deteksi SARS-CoV-2
adalah de fi Ned sama atau lebih besar dari LoD ddPCR masing-masing
untuk set ORF1ab danNprimers / probe. Hasil antara 0 salinan / reaksi
dan LoD ddPCR untuk setiap set primer / probe adalah de fi ned sebagai
laboratorium, tes ddPCR dan o ffi Diagnosis RTPCR yang disetujui secara
resmi di rumah sakit secara bersamaan dengan primer / set probe yang
sama yang disetujui oleh CDC China ( Tabel 1 ). Kemudian pasien rawat
jalan yang dicurigai didiagnosis dengan CT dada. Berdasarkan o ffi Program
medis resmi China, pasien rawat jalan dengan o ffi RT-PCR (positif) atau CT
dada (gambar kekeruhan kaca dasar, GGO) yang disetujui secara resmi
harus dirawat di rumah sakit. Selanjutnya, sampel usap tenggorokan dari
semua pasien yang dirawat di rumah sakit dikumpulkan lagi dan diberi o ffi tes
RT-PCR yang disetujui secara resmi pada hari-hari yang ditentukan setelah
dirawat Tabel 1 ) untuk memantau viral load secara terus menerus
berdasarkan o ffi program medis resmi.
Kesembuhan yang diharapkan adalah: (1) suhu kembali
normal selama lebih dari 3 hari, dan gejala pernafasan yang
signifikan. fi terus meningkat; (2) Pencitraan CT dada menunjukkan
signifikansi fi tidak bisa penyerapan dalam fl cinta; (3) uji asam
nukleat dari patogen pernapasan negatif untuk dua kali
berturut-turut, dan interval pengambilan sampel harus paling
sedikit.

Gambar 2. Analisis probit kurva sigmoid melaporkan LoD ddPCR dan RT-PCR. Replikasi reaksi (A) ORF1ab dan (B) N ddPCR atau (C) ORF1ab dan (D) N RT-PCR
dilakukan pada konsentrasi di sekitar titik akhir deteksi yang ditentukan dalam percobaan pengenceran awal. Itu X- sumbu menunjukkan konsentrasi yang diharapkan
(salinan / reaksi). Itu Y- sumbu menunjukkan fraksi hasil positif di semua reaksi paralel yang dilakukan. Garis dalam adalah kurva probit (aturan dosis-respons). Garis
terluar adalah 95% con fi interval dence (95%
CI). Data mewakili tiga percobaan independen dengan 8 ulangan untuk setiap konsentrasi.
suatu hari, berdasarkan o ffi program medis resmi. Dalam penelitian ini, dua
sampel usap tenggorokan dari masing-masing yang diduga sembuh
dikumpulkan untuk laboratorium RT-PCR, ddPCR dan o ffi Tes RT-PCR yang
disetujui secara resmi secara bersamaan dengan primer / set probe yang
sama ( Meja 2 ). Selanjutnya, sampel usap tenggorokan dari pasien yang
sudah sembuh dikumpulkan lagi dan diberi o ffi tes RT-PCR yang disetujui
secara resmi pada hari yang ditentukan setelah keluar dari rumah sakit
untuk menilai viral load setelah keluar ( Meja 2 ).
Dalam tes laboratorium, RNA sampel usap tenggorokan
diekstraksi dan ditranskripsikan terbalik ke cDNA yang dikenai
tes RT-PCR dan ddPCR. Survei tindak lanjut dan informasi klinis
dari kohort terdaftar tercantum dalam Tabel S1 tambahan
setelah tes laboratorium.
Analisis dan perbandingan kinerja ddPCR dan RT-PCR untuk
diagnosis SARS-CoV-2
Di antara 63 terduga pasien rawat jalan (P1 - P63), 21 positif dan
42 negatif dilaporkan oleh o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi
di dua rumah sakit, yang juga diperiksa ulang oleh laboratorium
kami RT-PCR (secara kolektif disebut sebagai RT-PCR dalam
kinerja
Mikroba & Infeksi yang Muncul 1263
analisis). Sebaliknya, 49 positif, 10 negatif, dan 4 dugaan infeksi
SARS-CoV-2 dilaporkan oleh ddPCR sesuai dengan kriteria di atas ( Tabel
3 ). Survei tindak lanjut ( Tabel 1 dan Tabel tambahan S1)
mengungkapkan bahwa 47 kasus (P1 - P47) dari 63 dirawat di rumah
sakit kemudian dengan ground glass opacities image (GGO) dari CT
dada [ 20 ], yang merupakan penipuan lebih lanjut fi r disebut sebagai
infeksi SARS-CoV-2 oleh o ffi RT-PCR yang disetujui resmi di 2 - 10
hari pasca rawat inap. Selain itu, 7 kasus (P48 - P54) dengan ddPCR
positif (1 dicurigai), RT-PCR negatif dan gambar CT dada lainnya
(bukan GGO) disarankan untuk dikarantina di rumah dengan
mempertimbangkan laporan positif / dugaan ddPCR. Survei lanjutan
mengungkapkan bahwa 4 kasus (P50, P51, P53, dan P54) dari 7
kasus berkembang ffi kesulitan bernapas kemudian, dan ditipu fi rmed
sebagai infeksi SARS-CoV-2 di rumah sakit lain. Sisa 3 kasus (P48,
P49, dan P52) dari 7 kehilangan kontak untuk pelacakan. Dari
catatan, 1 kasus (P55) dengan ddPCR negatif, RT-PCR negatif dan
gambar CT dada normal adalah SARS-CoV-2 IgM / IgG positif. Tes
lebih lanjut oleh o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi masih
menunjukkan laporan negatif pada 4, 6, dan 8 hari kemudian,
menunjukkan infeksi SARS-CoV-2 tanpa gejala. Sedangkan 6 dari 8
kasus (P56-P63) dengan ddPCR negatif (1
1264 T. Suo dkk.
Gambar 3. Diagram alir desain penelitian ini. (A) Desain penelitian untuk pasien rawat jalan yang dicurigai dan (B) yang seharusnya sembuh. Hasil ini diperoleh secara buta dari
rumah sakit dan laboratorium secara independen. The o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi dilakukan oleh rumah sakit. Survei tindak lanjut dan informasi klinis dari pasien
yang terdaftar digunakan untuk mengevaluasi kinerja ddPCR dan RTPCR.
dicurigai), RT-PCR negatif dan gambar lain (bukan GGO) dari CT
dada dikeluarkan oleh laporan negatif SARS-CoV-2 IgM / IgG
(P56, P61, dan P62) dan o ffi Tes RT-PCR yang disetujui secara
resmi pada 5 - 8 hari kemudian (P56, P58, P59, dan P61 - P63)
dalam survei tindak lanjut. Selain itu, dari 6 kasus tersebut
semuanya telah melaporkan kesehatan yang baik. 2 kasus lainnya
(P57 dan P60) kehilangan kontak untuk dilacak. Kami menganalisis
lebih lanjut dan membandingkan kinerja RT-PCR dan ddPCR untuk
deteksi asam nukleat SARS-CoV-2 menurut survei tindak lanjut
dan informasi klinis ( Tabel 4 ). 5 kasus kehilangan kontak tidak
dimasukkan dalam studi analisis kami karena kondisi yang tidak
jelas. Sensitivitas, spesi fi kota, PPV, NPV, NLR, dan akurasi
ditingkatkan dari 40% (95% CI: 27 -
55%), 100% (95% CI: 54 - 100%), 100%, 16% (95% CI: 13 - 19%),
0,6 (95% CI: 0,48 - 0,75), dan 47% (95% CI: 33 - 60%) untuk
RT-PCR hingga 94% (95% CI: 83 - 99%), 100% (95% CI: 48 - 100%),
100%, 63%
(95% CI: 36 - 83%), 0,06 (95% CI: 0,02 - 0,18), dan 95% (95% CI:
84 - 99%) untuk ddPCR.
Di antara 14 yang seharusnya sembuh (P64 - P77), yang
semua sampelnya dilaporkan negatif oleh o ffi RT-PCR yang
disetujui secara resmi, 7 positif, 5 negatif, dan 2 dugaan infeksi
SARS-CoV-2 dilaporkan oleh ddPCR ( Tabel 3 ). Survei tindak
lanjut ( Meja 2 dan Tabel tambahan S1) mengungkapkan bahwa
5 kasus (P64, P65, dan P69 - P71) dari 9 (P64 -
P72) dengan ddPCR positif (2 dicurigai), RT-PCR negatif dan
lesi yang diserap gambar CT dada telah didiagnosis sebagai
asam nukleat SARS-CoV-2 positif lagi oleh o ffi RT-PCR resmi
disetujui pada 5 - 12 hari setelah keluar. 4 kasus sisanya (P66 - P68
dan P72) dari 9 tetap sebagai asam nukleat negatif. Sedangkan
4 kasus lainnya (P73 - P76) dari 5 (P73 - P77) dengan ddPCR
negatif, RT-PCR negatif, dan lesi yang diserap gambar CT dada
masih tetap negatif asam nukleat pada 7 hari
 Mikroba & Infeksi yang Muncul 1265

Tabel 1. RT-PCR dan ddPCR Hasil pasien rawat jalan yang diduga COVID-19 dan informasi klinis lebih lanjut.
Hasil RT- Hasil ddPCR PCR di lab (Ct
(salinan /
nilai) a, b reaksi) a, b
Seri Penilaian oleh Awal o ffi cial Diagnosis lebih lanjut oleh Sabar HAI ffi laporan resmi oleh RT-PCR

Tidak. ORF1ab N ORF1ab N ddPCR laporan oleh RT-PCR Sebuah CT dada c kondisi d lagi setelah (hari) e

P1 ND ND 0 2.0 P. N GGO c Rawat inap P (4 hari)

P2 39.46 38.90 0 2.0 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P3 ND ND 0 2.0 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P4 35.20 35,98 4.8 20.8 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P5 ND 39.59 0 3.6 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P6 36.24 35.45 32.4 104 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P7 ND ND 3.4 13.6 P. N GGO Rawat inap P (2 hari)

P8 36.87 36.10 18.6 36.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P9 39.19 38.87 1.6 13.2 P. N GGO Rawat inap P (3d)

P10 ND ND 0 1.6 S N GGO Rawat inap P (4 hari)

P11 35.08 33.52 4.8 16.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P12 ND ND 0 3.6 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P13 ND ND 0 4.6 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P14 38.09 37.63 2.6 3.8 P. N GGO Rawat inap P (2 hari)

P15 ND ND 0 3.6 P. N GGO Rawat inap P (2 hari)

P16 ND ND 0 1.8 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P17 33.97 32.76 24.4 60.8 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P18 ND ND 0 7.4 P. N GGO Rawat inap P (2 hari)

P19 ND ND 0 1.8 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P20 37.77 36.63 16.2 36.2 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P21 ND ND 3.8 1.8 P. N GGO Rawat inap P (3d)

P22 ND ND 2.4 0 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P23 32.19 31.81 108 132 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P24 28.02 27.49 1130 4440 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P25 ND ND 0 1.8 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P26 ND ND 0 1.4 S N GGO Rawat inap P (5d)

P27 25.33 24.25 544 1384 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P28 27.02 26.30 22.8 98.2 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P29 ND ND 0 2.2 P. N GGO Rawat inap P (10 hari)

P30 36.15 36.02 26.2 68.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P31 ND ND 0 6.6 P. N GGO Rawat inap P (8 hari)

P32 34.93 33.52 32.6 64.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P33 ND ND 4.4 14.2 P. N GGO Rawat inap P (7 hari)

P34 28.98 28.69 746 1954 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P35 ND 39.46 0 3.2 P. N GGO Rawat inap P (4 hari)

P36 31.49 30.63 36.2 140 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P37 28.22 27.26 20.8 40.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P38 27.09 26.48 8.6 36.2 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P39 ND ND 0 1.8 P. N GGO Rawat inap P (8 hari)

P40 ND ND 0 3.2 P. N GGO Rawat inap P (8 hari)

P41 32.73 33.18 16.2 11.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P42 34.16 33.09 22.4 32.8 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P43 25.02 27.30 1.8 2.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P44 37.01 36.57 16.6 28.4 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P45 35.85 35.26 10.2 32.2 P. P. GGO Rawat inap P (6 hari)

P46 ND ND 0 0 N N GGO Rawat inap P (6 hari)

P47 ND ND 0 0 N N GGO Rawat inap P (8 hari)

P48 ND 39.27 0 3.4 P. N Lepuh pleura Karantina Rumah NA, kehilangan kontak Karantina
P49 ND ND 0 1.2 S N Lobus bawah Rumah NA, kehilangan kontak
radang paru-paru

P50 ND ND 1.6 4.0 P. N Radang paru-paru Karantina Rumah P (10d)

P51 ND 38.83 0 3.8 P. N Paru sekunder Karantina rumah P (9 hari)

tuberkulosis
P52 39.83 38.51 0 5.6 P. N Normal Karantina rumah NA, kehilangan kontak

P53 39.60 38.16 3.0 16.2 P. N Garis-garis berserat Karantina rumah P (7 hari)

P54 ND ND 0 2.0 P. N Nodul subpleural Karantina rumah P (11 hari)

P55 ND ND 0 0 N N Normal Karantina rumah Negatif (4, 6 dan 8d), tanpa

gejala
P56 ND ND 0 1.2 S N Normal Pengecualian N (6 hari)

P57 ND ND 0 0 N N Empisema Pengecualian NA, kehilangan kontak

P58 ND ND 0 0 N N Garis-garis berserat Pengecualian N (6 hari)

P59 ND ND 0 0 N N Normal Pengecualian N (5d)

P60 ND ND 0 0 N N Normal Pengecualian NA, kehilangan kontak

P61 ND ND 0 0 N N Radang paru-paru Pengecualian N (6 hari)

P62 ND ND 0 0 N N Garis-garis berserat Pengecualian N (6 hari)

P63 ND ND 0 0 N N Nodul Pengecualian N (8 hari)

Catatan: P, positif; N, Negatif; S, tersangka; ND, tidak terdeteksi; NA, tidak berlaku.
Sebuah Sampel usap tenggorokan adalah fi pertama-tama dikumpulkan untuk tes RT-PCR laboratorium, tes ddPCR dan o ffi Diagnosis RT-PCR yang disetujui secara resmi di rumah sakit secara bersamaan menggunakan primer / set

probe yang sama yang disetujui oleh CDC China. Dalam tes laboratorium, RNA sampel usap tenggorokan diekstraksi dan ditranskripsikan terbalik ke cDNA yang selanjutnya dilakukan tes RT-PCR dan ddPCR.

b Sistem reaksi laboratorium RT-PCR dan ddPCR adalah 20 μ l / reaksi.

c Hasil CT dada selanjutnya digunakan untuk mendiagnosis COVID-19 di rumah sakit berdasarkan o ffi program medis resmi Cina. GGO, gambar kekeruhan kaca tanah.

d Pasien rawat jalan dengan CT dada (GGO) atau o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi (positif) dirawat di rumah sakit. Pasien rawat jalan dengan CT dada (tanpa GGO), o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi (negatif)

tetapi ddPCR (positif) disarankan untuk dikarantina di rumah. Pasien rawat jalan dengan CT (normal), o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi (negatif), ddPCR (negatif) dan uji klinis pendukung lainnya (Tabel tambahan

S1) dikeluarkan untuk COVID-19.

e Infeksi SARS-CoV-2 telah ditipu fi rmed oleh o ffi uji RT-PCR yang disetujui secara resmi setelah hari-hari yang ditentukan.
1266 T. Suo dkk.

Meja 2. Hasil RT-PCR dan ddPCR untuk penyembuhan yang seharusnya yang akan dipulangkan setelah perawatan.
Hasil RT- Hasil ddPCR
PCR di lab (Ct (salinan /
Nilai) b, c reaksi) b, c
Sabar HAI ffi laporan resmi oleh Penilaian oleh HAI ffi laporan resmi oleh RT-PCR lagi
Jumlah Status pasien RT-PCR Sebuah ORF1ab N ORF1ab N ddPCR setelah (hari) d

P64 Seharusnya sembuh N ND ND 0 2.4 P. P (12 hari)

P65 Seharusnya sembuh N ND ND 0 2.2 P. P (7 hari)

P66 Seharusnya sembuh N 39.33 39.05 11.4 12.0 P. N (7 hari)

P67 Seharusnya sembuh N ND 40.07 0 9.0 P. N (6 hari)

P68 Seharusnya sembuh N 40.03 39.82 0 16.0 P. N (7 hari)

P69 Seharusnya sembuh N ND ND 1.8 0 S P (7 hari)

P70 Seharusnya sembuh N ND ND 0 2.2 P. P (7 hari)

P71 Seharusnya sembuh N 39.79 38.90 3.8 106 P. P (5d)

P72 Seharusnya sembuh N ND 40.02 1.4 1.4 S N (7 hari)

P73 Seharusnya sembuh N ND ND 0 0 N N (7 hari)

P74 Seharusnya sembuh N 39.61 ND 0 0 N N (7 hari)

P75 Seharusnya sembuh N ND 40.01 0 0 N N (7 hari)

P76 Seharusnya sembuh N ND ND 0 0 N N (7 hari)

P77 Seharusnya sembuh N ND ND 0 0 N P (7 hari)

Catatan: P, positif; N, Negatif; S, tersangka; ND, tidak terdeteksi.

Sebuah Sampel usap tenggorokan yang seharusnya sembuh fi pertama kali dikumpulkan untuk o ffi Uji RT-PCR yang disetujui secara resmi dan uji RT-PCR dan ddPCR laboratorium.

b Sampel yang dikumpulkan diuji untuk RT-PCR dan ddPCR di laboratorium secara bersamaan menggunakan sistem reverse transcriptase yang sama dan primer / set probe yang disetujui oleh CDC China.

c Sistem reaksi laboratorium RT-PCR dan ddPCR adalah 20 μ l / reaksi.

d Asam nukleat SARS-CoV-2 diuji lagi oleh o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi setelah hari yang ditentukan untuk menilai viral load dari pemulihan yang dipulangkan.

pasca keluar, menunjukkan penyembuhan fungsional. Dari catatan, 1 kasus Deteksi langsung virus tidak tergantikan. Di ff erent dari RT-PCR
(P77) dengan kondisi yang sama telah kembali menjadi asam nukleat positif bahwa data diukur dari satu ampli fi kurva kation dan nilai Cq,
pada 7 hari pasca pembuangan. yang sangat bergantung pada reaksi e ffi ciency, dimer primer,
dan kontaminan sampel, ddPCR diukur pada titik akhir reaksi
yang secara virtual menghilangkan potensi jebakan ini.
Diskusi

Semakin banyak alat deteksi asam nukleat telah dikembangkan

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa 26 sampel dari
untuk SARS-CoV-2 baru-baru ini berdasarkan RTPCR untuk
pasien rawat jalan COVID-19 dengan RT-PCR negatif terdeteksi
memenuhi persyaratan diagnosis molekuler klinis skala besar.
positif oleh ddPCR menggunakan sampel yang sama. Dengan
Telah dilaporkan bahwa 6 jenis kit deteksi RT-PCR dibandingkan
demikian, NPV dari ddPCR (63%, 36 - 83) jelas lebih tinggi dari
dan dianalisis untuk kinerja pendeteksiannya, yang menunjukkan
RT-PCR (16%, 13 - 19), yang menunjukkan bahwa sebagian dari
bahwa terdapat perbedaan ff kesalahan dalam kemampuan deteksi
pasien rawat jalan COVID-19 yang benar (26 laporan positif oleh
untuk sampel yang positif lemah, dan akurasi, sensitivitas, dan
ddPCR dalam penelitian ini) tidak dapat didiagnosis tepat waktu oleh
reproduktifitas beberapa kit tidak ideal [ 8 ]. Sementara itu, metode
RT. - PCR, berpotensi menyebabkan risiko penyakit parah dan
lain seperti CT dada dan deteksi imunologi IgM / IgG telah
penyebaran virus yang lebih tinggi ( Tabel 3 dan 4 ). Hebatnya, 4 kasus
digunakan untuk membantu diagnosis COVID-19. Namun,
(P50, P51, P53, dan P54) dengan ddPCR positif, RT-PCR negatif dan
gambar lain (bukan GGO) dari CT dada fi r disebut sebagai infeksi
SARS-CoV-2 7 - 11 hari kemudian, menunjukkan bahwa saran
karantina kami sesuai dengan laporan ddPCR adalah wajar.
Tabel 3. Ringkasan laporan RT-PCR dan ddPCR untuk sampel klinis dibandingkan
dengan survei tindak lanjut. Penerapan ddPCR untuk diagnosis SARS-CoV-2 akan membantu

Mengikuti Total mengikuti- pengobatan dini dan mengendalikan penularan virus. Kesimpulannya,
RT-PCR # ddPCR survei up survei dibandingkan dengan RT-PCR, ddPCR menunjukkan keunggulan
63 pasien rawat jalan 21 Hal 21 Hal 21 Hal 52 Hal untuk deteksi klinis SARS-CoV-2 untuk mengurangi negatif palsu,
42 N 28 Hal 26 Hal 6N
2L 5L
yang bisa menjadi pelengkap yang kuat untuk RT-PCR standar saat
10 N 3 Hal ini.
5N
2L
4S 2 Hal

1N
1 liter

14 seharusnya 14 N 7 Hal 4 Hal 6 Hal Khususnya, 6 kasus (P64, P65, P69 - P71, dan P77) dari 14
penyembuhan 3N 8N
(42,9%) pasien yang diduga sembuh, yang negatif untuk tes asam
5N 1 Hal

4N nukleat usap tenggorokan dua kali dengan RT-PCR, masih

2S 1 Hal membawa SARS-CoV-2 menurut survei tindak lanjut. Meskipun
1N
risiko penularan virus tidak diketahui, virus tersebut bereplikasi,
Catatan: N, Negatif; P, positif; L, kehilangan kontak; S, tersangka.
#
Hasil o ffi RT-PCR yang disetujui secara resmi di dua rumah sakit juga diperiksa oleh laboratorium RT-PCR yang menyebabkan peningkatan viral load. Oleh karena itu, arus
(secara kolektif disebut sebagai RT-PCR).
 Mikroba & Infeksi yang Muncul 1267

Tabel 4. Kinerja diagnostik ddPCR dan RT-PCR untuk pasien rawat jalan yang dicurigai.

PPV
Secara klinis Secara klinis Kepekaan Speci fi kota (95% NPV Rasio kemungkinan negatif Ketepatan
positif negatif (95% CI) (95% CI) CI) (95% CI) (95% CI) (95% CI)

RT- Tes positif 21 Sebuah 0b 40% 100% 100% 16% 0.60 47%
PCR Tes negatif 31 c 6d (27 - 55%) (54 - 100%) (NA) (13 - 19%) (0.48 - 0,75) (33 - 60%)
ddPCR Tes positif 47 Sebuah 0b 94% 100% 100% 63% 0,06 95%
Tes negatif 3c 5d (83 - 99%) (48 - 100%) (NA) (36 - 83%) (0,02 - 0,18) (84 - 99%)
Tersangka 2 1

Catatan: Sensitivitas = [a / (a + c)] × 100%; Speci fi kota = [d / (b + d)] × 100%; PPV = [a / (a + b)] × 100%, nilai prediksi positif; NPV = [d / (c + d)] ×
100%, nilai prediksi negatif; Rasio kemungkinan negatif = (1-Sensitivitas) / Speci fi kota; Akurasi = [(a + d) / (a + b + c + d)] × 100%; NA, tidak berlaku.

Dihitung oleh MEDCALC ( https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php ).

praktik klinis bahwa pasien yang sembuh terus dikarantina setidaknya
selama dua minggu adalah wajar dan perlu. Oleh karena itu, kami
merekomendasikan bahwa ddPCR dapat menjadi pelengkap RTPCR
standar saat ini untuk digunakan kembali fi rm yang sembuh, yang akan
menguntungkan fi t untuk mengurangi risiko epidemi SARS-CoV-2 dan
kepanikan sosial.
2020020201010012], Dana Penelitian Fundamental untuk Universitas
Pusat dan Proyek Besar Nasional tentang Pencegahan Penyakit
Menular Utama [nomor hibah 2017ZX10103005]. Penelitian ini
dirancang, dilakukan, dianalisis, dan diinterpretasikan oleh penulis
sepenuhnya terlepas dari sumber pendanaan. Para peneliti menipu fi rm
kemandirian mereka dari pemberi dana dan sponsor.

Namun, spesifikasinya fi kota dan PPV adalah 100% untuk

ORCID
RT-PCR dan ddPCR karena tidak ada positif palsu. Sebagian karena
ukuran sampelnya kecil, tetapi sampel klinis yang kami kumpulkan Qi Zhang http://orcid.org/0000-0003-2868-1816
juga berasal dari rumah sakit yang ditunjuk di Wuhan selama Yong Xiong http://orcid.org/0000-0003-0678-4064
Yu Chen http://orcid.org/0000-0003-1300-4652
epidemi COVID-19, yang berarti prevalensi penyakit COVID-19 lebih
tinggi daripada skenario klinis umum. Selain itu, kami hanya
menggunakan primer / kumpulan probe dari China CDC, yang tidak
Referensi
dapat mewakili primer dari o lain ffi lembaga pemerintah. Penelitian
[1] Wu F, Zhao S, Yu B, dkk. Virus korona baru yang terkait dengan
lebih lanjut untuk membandingkan e ffi efisiensi di ini ff Beberapa primer
penyakit pernapasan manusia di China. Alam. 2020 ; 579: 265 - 269.
perlu dilakukan, yang membantu meningkatkan akurasi diagnostik
deteksi SARS-CoV-2 di ff negara yang berbeda. [2] Chen L, Liu W, Zhang Q, dkk. Pendekatan mNGS berbasis RNA
identi fi adalah virus korona manusia baru dari dua kasus pneumonia
individu pada wabah Wuhan 2019. Darurat Mikroba Infeksi. 2020 ; 9:
313 - 319. Organisasi Kesehatan Dunia. Pengujian laboratorium untuk
[3] 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) pada kasus manusia yang
Ucapan Terima Kasih dicurigai [Internet]. 2020 [dikutip 2020 Feb 4].

Kami berterima kasih kepada Beijing Taikang Yicai Foundation atas dukungannya yang luar
biasa untuk pekerjaan ini.
YC, KL dan JF membuat konsep desain studi. TS, WH, LD, TC, YX,
dan GC merekrut pasien, mengumpulkan spesimen, mengumpulkan data
demografis, klinis; Tes laboratorium dilakukan oleh XL, MG, QZ, XW, YY,
MS, DG dan ZH. JF, YL dan QZ merencanakan fi angka; XL, MG, JF dan
YC menganalisis data; ZH, KX, YL, YLL dan YC menafsirkan hasil; JF
menulis draf awal naskah; YC, JF, HU dan KL merevisi naskah dan FL
dan KX mengomentarinya. Semua penulis membaca dan menyetujui fi laporan
akhir.
p. 1 - 7. Tersedia dari: https://www.who.int/
publikasi-detail / laboratorium-pengujian-untuk-2019-novel-
coronavirus-dalam-dugaan-kasus-manusia-20200117 .
[4] Jenderal O ffi ce Komisi Kesehatan dan Kesehatan Nasional O
dari SA TCM. Diagnosis dan pengobatan pneumonitis dengan
jenis baru infeksi virus corona (versi percobaan 5) [Internet].
2020 [dikutip 2020 Feb 6]. Tersedia dari: http://bgs.satcm.gov.cn/
zhengcewenjian / 2020-02-06 / 12848.html .
[5] Qiu J. Infeksi virus korona terselubung dapat menyebarkan wabah
baru [Internet]. Nat. berita. 2020 [dikutip 2020 Mar 20]. Tersedia
dari: https://doi.org/10. 1038 / d41586-020-00822-x .

Pernyataan pengungkapan [6] Wu Z, McGoogan JM. Karakteristik dan pelajaran penting dari
wabah penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) di China:
Tidak ada potensi penipu fl ict minat dilaporkan oleh penulis (s).
ringkasan laporan 72.314 kasus dari pusat pengendalian dan
pencegahan penyakit di China. Jama [Internet]. 2020; 2019: 25 - 28.
Tersedia dari:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32091533 .
Pendanaan
[7] Klein D. Quanti fi kation menggunakan teknologi PCR waktu
Studi ini didukung oleh Dana Khusus untuk Penelitian COVID-19 dari nyata: aplikasi dan batasan. Tren Mol Med.
Universitas Wuhan, Sains Nasional China dan 2002 ; 8: 257 - 260.
Teknologi Utama Proyek [hibah jumlah [8] Guo Y, Wang K, Zhang Y, dkk. Perbandingan dan analisis kinerja
2018ZX10733403 dan 2018YFA0900801], hibah NSFC China [nomor deteksi enam reagen pendeteksi asam nukleat coronavirus baru.
hibah 32041007], Proyek Sains dan Teknologi Darurat COVID-19 Chongqing Med. 2020 ; 14: 1671 - 8348.
Wuhan [nomor hibah
1268 T. Suo dkk.
[9] Kuypers J, Jerome KR. Aplikasi PCR digital untuk
mikrobiologi klinis. J Clin Microbiol. 2017 ; 55: 1621 -
1628.
[10] Vogelstein B, Kinzler KW. PCR digital. Proc Natl Acad Sci AS. 1999
; 96: 9236 - 9241.
[11] Pohl G, Shih IM. Prinsip dan aplikasi PCR digital. Ahli Rev Mol
Diagn. 2004 ; 4: 41 - 47.
[12] Sanders R, Mason DJ, Foy CA, dkk. Evaluasi PCR digital untuk
jumlah RNA absolut fi kation. PLoS One.
2013 ; 8: e75296.
[13] White RA, Blainey PC, Fan HC, dkk. PCR Digital menyediakan
kalibrasi yang sensitif dan absolut untuk pengurutan throughput yang
tinggi. BMC Genomics. 2009 ; 10: 110 - 116. Hindson BJ, Ness KD,
[14] Masquelier DA, dkk. Sistem PCR digital tetesan highhroughput untuk
penghitungan absolut nomor salinan DNA. Anal Chem.
2011 ; 83: 8604 - 8610.
[15] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, dkk. Kuanti mutlak fi kation
dengan tetesan PCR digital versus PCR real-time analog. Metode
Nat. 2013 ; 10: 1003 - 1005. Postel M, Roosen A, Laurent-Puig P, dkk.
[16] PCR digital berbasis tetesan dan sekuensing generasi berikutnya
untuk memantau DNA tumor yang bersirkulasi: perspektif
diagnostik kanker. Ahli Rev Mol. Diagnosis.
2018 ; 18: 7 - 17.
[17] Miyaoka Y, Mayerl SJ, Chan AH, dkk. Deteksi dan quanti fi kation HDR
dan NHEJ yang diinduksi oleh pengeditan genom pada lokus gen
endogen menggunakan droplet digital PCR. Dalam: Karlin-Neumann
G, Bizouarn F, editor. Angka. Metode PCR Protoc. New York, NY:
Springer New York; 2018 . p. 349 - 362. [Internet]. Tersedia dari:
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7778-9_20 .
[18] Institut Nasional Pengendalian Penyakit virus dan pencegahan
RRC. Speci fi c primer dan probe untuk deteksi 2019 novel
coronavirus [Internet]. 2020 [dikutip 2020 Apr 10]. Tersedia dari: http:
//www.chinaivdc. cn / kyjz / 202001 / t20200121_211337.html .
[19] Burd EM. Validasi tes molekuler yang dikembangkan laboratorium
untuk penyakit menular. Clin Microbiol Rev.
2010 ; 23: 550 - 576.
[20] Li M, Lei P, Zeng B, dkk. Penyakit Coronavirus (COVID-19):
spektrum CT fi temuan dan perkembangan sementara penyakit.
Acad Radiol. 2020 : 1 - 6.
https://doi.org/10.1016/j.acra.2020.03.003 .