Analisis Karakter Virologi SARS-COV2

untuk Akurasi Diagnostik dan

Interpretasinya pada PASIEN COVID-19

Priyo Budi Purwono, dr., M.Si, M.Ked.Klin, Sp.MK

Departemen Mikrobiologi

priyo_budi@fk.unair.ac.id 1
ANALISIS KARAKTER VIROLOGI SARS-COV2
UNTUK AKURASI DIAGNOSTIK DAN
INTERPRETASI NYA PADA PASIEN COVID-19

Priyo Budi Purwono, dr., M.Si, M.Ked.Klin, Sp.MK

Dep. Mikrobiologi FK Universitas Airlangga/RSUD Dr
Soetomo
Peneliti di bidang Virologi Kedokteran

Medtrain 2020 (FK Unair), 18 April 2020

priyo_budi@fk.unair.ac.id 2
Outline
1. Pendahuluan
2. Alur pemeriksaan laboratorium untuk karakter virologi
3. Prinsip dan Peran qRT-PCR
4. Prinsip dan Peran kultur virus
5. Aplikasi karakter virologi untuk akurasi diagnostik COVID19
6. Aplikasi karakter virologi untuk interpretasi hasil tes COVID19
7. Rangkuman

priyo_budi@fk.unair.ac.id 3
Kesamaan genetik SARS-COV2 dibandingkan strain
Proteins
virus Corona (SARS-COV dan SARS Bat HKU3-1) •Nucleocapsid (N)
(MiSeq Illumina NGS) •Envelope protein (E)
•Membrane protein (M)
•Spike protein (S)

SARS-CoV-2, a Human Coronavirus (HCoV)

Envelope Virus dengan +ssRNA (30 kb)
• Common HCoVs (lower pathogenicity):
–HCoV-229E (alpha)
–HCoV-NL63 (alpha)
–HCoV-OC43 (beta)
–HCoV-HKU1 (beta)
• Other HCoVs (higher pathogenicity):
–SARS-CoV (beta)
–MERS-CoV (beta)
Peng Zhou et al, 12thMar 2020, Nature,
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7 –SARS-CoV-2* (beta)
priyo_budi@fk.unair.ac.id 4
 Gejala dominan COVID-19
• Penularan
- Droplet
- Kontak konjungtiva
- Airborne ?
- Foodborne ?

• Gejala
1. Demam (64-98%)
2. Batuk (43-82%)
3. Fatigue (21-70%)
4. Sesak napas (2-59%)
5. Pusing (6-34%)
6. Diare (2-17%)
7. Pilek (2%)
Xiaoyi Huang et al , April 2020, Arch Iran Med
priyo_budi@fk.unair.ac.id 5
Alur pemeriksaan karakter virologi pada infeksi COVID-19

Rumah PDP
Sakit
(Ward)

Laborat
orium

RT PCR (BSL-2) Immuneassay (BSL-2) Kultur virus (BSL3)

Mengetahui karakter virology untuk :

1. Akurasi diagnostic ***
Goal 2. Pengembangan obat antivirus
3. Patogenesis penyakit
4. Pengembangan vaksin, dll
priyo_budi@fk.unair.ac.id 6
Tujuan Mengetahui Karakter Virologi SARS-
COV2

1.Akurasi diagnostik ***

2. Sifat replikasi virus
3. Tropism (target sel)
4. Patogenesis penyakit
5. Pengembangan obat antivirus
6. Pengembangan vaksin/imun therapy
7. Pengembangan terapi yang lain

priyo_budi@fk.unair.ac.id 7
 Jenis spesimen laboratorium untuk COVID19

pharyngeal swabs, nasal

eye conjunctival swab
swabs, nasopharyngeal
(acute conjunctivitis)
extracts

• sputum from deep coughs,

• respiratory tract extracts,
• bronchial lavage fluid,
pulmonary alveolus lavage
fluid, and
• pulmonary tissue biopsy
specimens
Blood Stool
Serum priyo_budi@fk.unair.ac.id 8
Laboratory Tests (WHO Recomendation)
Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans

Five diagnostic test protocols for polymerase chain reaction (PCR) of COVID-19
1. China (genetic primers and probes only)
2. Thailand
3. Hong Kong
4. Japan
5. Germany
6. USA (CDC)

Many more tests commercially available and in development

• Antibody detection (IgM/IgG)
• Automated
• Point of Care (POC) lateral flow or “dipstick”

https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance
priyo_budi@fk.unair.ac.id 9
Jenis Pemeriksaan laboratorium untuk deteksi virologi
A. Pemeriksaan langsung
1. Deteksi molekuler (RT-PCR à kualitatif, qRT-PCR à kuantitatif)
2. Identifikasi genotype dan clade (DNA sequencing, phylogenetic tree analysis)
3. Kultur virus (Cytophatic Effect / CPE pada sel) à Goal : ISOLAT VIRUS !!
4. Titer virus (Plaque assay: pfu/ml, TCID50)
5. Deteksi antigen virus à kurang sensitif ok. tergantung konsentrasi virus shedding

B. Pemeriksaan tidak langsung

1. Pemeriksaan respon imun humoral/antibody, IgM, IgG
à ELISA, Lateral Flow immuneassay (Rapid test), dll
à dipengaruhi berbagai faktor
2. Pemeriksaan respon immune selular (mis. Lymphocyte) à non spesifik
priyo_budi@fk.unair.ac.id 10
 Uji Reaksi silang antibody plasma berbagai strain
terhadap virus protein (N) SARS-COV2
• Tujuan :
Menguji ada tidak nya reaksi silang antibody
terhadap berbagai strain virus Corona
• Metode
1. Western blott
2. ELISA

• Terjadi reaksi silang antibodi terhadap protein N

antara virus SARS-COV dan SARS-COV2
• Pemeriksaan tidak spesifik infeksi COVID-19

Li Guo et al, 2020, Oxford University Press

for the Infectious Diseases Society of America priyo_budi@fk.unair.ac.id 11
 Dynamic profiling antibody dan
RNA virus SARSCOV2 pada pasien
COVID-19

• Pasien mild symptom dan kritis

Metode

• RNA virus : qRT PCR

• Antibody, IgM, IgG : ELISA

Hasil

• RNA virus positif saat fase awal

• Antibodi relatif fluktuatif pada

sebagian pasien (umumnya positif
pada minggu ke 2)

• Sebagian pasien COVID-19 TIDAK

terbentuk/terdeteksi antibodi
Li Guo et al, 2020, Oxford University Press
priyo_budi@fk.unair.ac.id 12
for the Infectious Diseases Society of America
 Lateral Flow Immunoassay (Rapid test)

• Test dilakukan pada hari ke 8 – 33 setelah onset

• Sensitivitas dan spesifitas rapid test : 88.6% dan 90,6%
• Sekitar 11.4 % pasien TIDAK terdeteksi antibodi
• Hasil negatif tidak menyingkirkan infeksi

Zhengtu Li et al, 2020, doi: 10.1002/jmv.25727 priyo_budi@fk.unair.ac.id 13

BAGAIMANA PERAN PCR DAN KULTUR VIRUS
UNTUK ANALISIS KARAKTER VIROLOGI PADA
PASIEN COVID-19 ??

priyo_budi@fk.unair.ac.id 14
 Prinsip pemeriksan PCR konvensional

• PCR merupakan uji konfirmasi COVID-19 (WHO, 2020)

• PCR menggandakan jumlah DNA/RNA (material
genetic) virus sehingga mudah terdeteksi à
sensitifitas tinggi
• PCR menggunakan “primer” (urutan DNA unik) untuk
mengenali virus yang spesifik à spesifisitas tinggi

https://www.neb.com/applications/dna-amplification-and-pcr
priyo_budi@fk.unair.ac.id 15
 Modifikasi metode molekuler
1. PCR konvensional à kualitatif (positif/negatif)
2. Reverse transcriptase (RT) PCR : deteksi RNA --> one step vs two step
3. qPCR : kuantitatif à viral load (copies/ml)
4. qRT-PCR
a. SYBR GREEN
b. LUX (hairpin loop primer)
c. TaqMAN
d. droplet digital PCR (ddPCR)

priyo_budi@fk.unair.ac.id 16
Reverse Transcript PCR = RNA àDNA
Real Time PCR (qPCR) = deteksi realtime

KEUNGGULAN qRT-PCR
• Sangat Sensitif and Reliable
• Deteksi sinyal fluorescence secara Real
Time
• Dapat mendeteksi DNA/RNA lebih awal
daripada PCR konvensional
• Data Kualitatif dan Kuantitatif
priyo_budi@fk.unair.ac.id 17
 Mengapa kultur virus ??
• PRINSIP :
- Virus hanya replikasi pada sel hidup
- Memerlukan sel yang suseptibel, media dan
kondisi yang sesuai
- Observasi Cytophatic Effect (CPE) : perubahan
morfologi sel (mikroskop)

• KEUNGGULAN :
- Membedakan sampel dengan RNA virus
positif à bersifat infeksius atau tidak
- Isolat virus à karakterisasi virus, Uji obat, Uji
vaksin, Uji kit diagnostik

• KESULITAN :
- Dikerjakan di Lab BSL-3 (ITD Unair)
- Perlu tehnik dan ketrampilan khusus
Jeong-Min Kim et al, Osong Public Health Res Perspect 2020
priyo_budi@fk.unair.ac.id 18
Laboratorium BSL-3 untuk Kultur Virus Highly Pathogenic

BSL-3, Mahidol University, Bangkok priyo_budi@fk.unair.ac.id 19

Jumlah positif RNA SARS-COV2 pada pasien COVID-19

Dynamic Profile of SARS-CoV-2

Detected by RT-PCR from 301
COVID-19 Patients (N=1113)

Xiao AT et al, Journal of Clinical Virology, 31th March 2020

priyo_budi@fk.unair.ac.id 20
 RNA virus terdeteksi pada swab
tenggorok, nasopharing, sputum,
feses

Roman Wölfel et al, 1 April 2020, RNA virus TIDAK terdeteksi pada
Nature, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x (2020) spesimen serum darah dan urin pasien
priyo_budi@fk.unair.ac.id 21
Uji plaque virus dan Plaque Reduction
Neutralization Test (PRNT)

Plaque assay (virus titer) PRNT (Uji netralisasi antibody terhadap virus)

priyo_budi@fk.unair.ac.id 22
Analisis kultur virus, RT-PCR dan serokonversi antibodi pada pasien
COVID-19 yang dirawat di RS
Metode:
- qRT-PCR
(viral load)
- Kultur virus
(CPE)
- ELISA
(antibody)

Titer antibody = kemampuan netralisasi antibodi

Metode :
- qRT-PCR
- ELISA
- PRNT (Plaque
Reduction
Neutralisation
Test)

priyo_budi@fk.unair.ac.id 23
 Aplikasi qRT-PCR pada diagnostik dan monitoring
pasien COVID19 dengan acute conjunctivitis (case report)
• A 30-year- old man with confirmed
COVID-19 and bilateral acute
conjunctivitis
• occurred 13 days after illness onset
acute viral conjunctivitis
• Since day 14 : Ribavirin eye-drops,
four times per day
• Day 17 : viral load decreased
significantly (qRT-PCR)
• Day 19 : undetected

Lu Chen et al, Br J Ophthalmol 2020;0:1–4. doi:10.1136/bjophthalmol-2020-316304

priyo_budi@fk.unair.ac.id 24
Perbandingan efektifitas berbagai primer RT-PCR
• Tersedia nya berbagai primer untuk reaksi
RT-PCR virus SARS-COV2
• Membandingkan desain primer 4 institusi :
CDC USA, CDC China, Charite Institute
Germany, Hongkong University

Chantal B.F. Vogels et al, 2020,

priyo_budi@fk.unair.ac.id https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108
25
Mengetahui sensitifitas berbagai primer
RT-PCR pada titer RNA virus yang rendah

Chantal B.F. Vogels et al, 2020, priyo_budi@fk.unair.ac.id 26

https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108
Faktor yang mempengaruhi fungsi primer pada PCR SARS-COV2

Chantal B.F. Vogels et al, 2020,

priyo_budi@fk.unair.ac.id https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108
27
 Analisis karakter virology SARS-COV2 pada
Vero E6 cells dan Human Airway Epithelial (HAE) cells

• Infeksi virus mencapai puncak pada hari ke 3 (72 jam)

pada Vero E6 cell line (MOI of 0.1 and 0.01)
• Infeksi virus SARSCOV2 menyebabkan kerusakan
integritas sel HAE (48-72 jam)

Andrés Pizzorno et al, 2020, https://doi.org/10.1101/2020.03.31.017889

priyo_budi@fk.unair.ac.id 28
Rangkuman
Aplikasi analisis karakter virology untuk akurasi diagnostic COVID19:
1. Spesimen yang dapat terdeteksi RNA virus :
à Swab nasal, nasopharing, throat, saliva, sputum, cairan paru,
feses, swab konjungtiva
2. qRT-PCR à diagnosis dan pemantauan hasil terapi
3. Pemilihan primer PCR menentukan sensitifitas dan akurasi
4. RNA virus terdeteksi positif sejak awal onset (hari ke 2)
5. Puncak viral load hari ke 4-8, dan bisa terdeteksi hingga hari ke 28
6. Pembentukan antibody pada pasien TIDAK selalu mampu segera
menurunkan titer virus à kemampuan netralisasi antibodi
7. Kultur virus baik dilakukan pada hari ke 4-8 (saat puncak viral load)
priyo_budi@fk.unair.ac.id 29
Usulan
1. Minggu ke 1 gejala onset merupakan golden period COVID-19
2. Diagnostik konfirmasi dilakukan dengan metode PCR pada minggu
ke 1 gejala onset (sedini mungkin)
3. Tatalaksana optimal perlu dilakukan sejak awal minggu ke 1 gejala
onset, untuk mencegah tingkat keparahan pasien COVID-19 dan
pencegahan penularan
4. Evaluasi terapi pasien dapat dimonitor dengan pemeriksaan
konsentrasi RNA virus (metode qRT-PCR)
5. Bila lokasi perawatan pasien dekat dengan fasilitas Laboratorium
BSL-3, dapat dilakukan pengambilan/ pengiriman spesimen untuk
tujuan kultur virus

priyo_budi@fk.unair.ac.id 30
Terimakasih
• Prof. Dr. Soetojo, dr, Sp.U(K), Dekan FK Unair
• Prof. Dr. Budi Santoso, dr, Sp.OG(K), Wakil Dekan 2 FK Unair
• Dr. Eko Budi Koendhori, dr, M.Si, Sp.MK, Ketua Departemen MK
• Prof. Maria Inge Lusida, dr, M.Kes, PhD, Sp.MK, Ketua ITD Unair
• Senior dan rekan Sejawat Departemen Mikrobiologi Klinik FK
Unair/RSUD Dr. Soetomo
• Guru-guru FK Unair dan Mahidol University
• Tim Upeddi FK Unair
• Panitia Medtrain 2020 FK Unair

31
priyo_budi@fk.unair.ac.id