PROSEDUR PEMERIKSAAN rRT-PCR COVID-19

-Praktek Laboratorium Molekular Yang Baik-

BADAN KEBIJAKAN DAN PEMBANGUNAN KESEHATAN

KEMENTERIAN KESEHATAN RI
 Kontaminan dan kontaminasi

Desain Laboratorium
SISTEMATIKA

Aspek Teknis lainnya

TUJUAN

• Memahami prinsip praktik Laboratorium Molekular yang baik

• Menerapkan cara terbaik untuk meminimalkan dan mendeteksi kontaminasi

sampel dalam pemeriksaan

• Menerapkan elemen dari desain lab yang penting untuk hasil amplifikasi
asam nukleat yang berkualitas

• Menerapkan praktik bekerja di laboratorium yang baik (Good Laboratory

Practices) untuk menghindari kontaminasi di dalam lingkungan lab

3
 Sejarah GLP:

Good 1. Pada awal tahun 1970, FDA melihat

adanya praktek bekerja dan aktifitas lab
yang buruk di seluruh US
Laboratory 2. Ditemukan adanya kecurangan dalam hasil
pemeriksaan lab diberbagai tempat
Practice 3. Kasus Industrial Bio Test à produk
deodoran merek terkenal yang
(GLP) menimbulkan kanker. Mencit lab yang diuji
terkena kanker dan mati à semua pegawai
lab, distributor, produsen dan sales
diperiksa
4. Hasil evaluasi dibanyak lab diantaranya
sbb:
1. Banyak Alat tidak dikalibrasi
2. Hasil yang tidak akurat dan tidak benar
3. Kecurangan hasil pemeriksaan lab
Good Laboratory Practice (GLP)

• GLP dilembagakan di AS setelah kasus penipuan yang dihasilkan oleh

laboratorium toksikologi dalam data yang diserahkan ke FDA oleh
perusahaan farmasi. Sebagai hasil dari temuan ini, FDA mengumumkan
Good Laboratory Practice (GLP) Regulations, 21 CFR part 58, on
December 22, 1978 (43 FR 59986). The regulations became effective
June 1979

• Pada tahun 1981 sebuah organisasi bernama OECD (organisasi untuk

kerjasama dan pembangunan ekonomi) menghasilkan prinsip-prinsip GLP
yang berstandar internasional. Dewan OECD, data yang dihasilkan dalam
pengujian bahan kimia di satu Negara Anggota OECD, sesuai dengan
Pedoman Tes OECD dan Prinsip GLP diterima di semua Negara Anggota
OECD lainnya.
GOOD LABORATORY PRACTICE (GLP)
Praktek Laboratorium Yang Baik

• GLP adalah untuk menyatakan bahwa setiap langkah analisis valid

atau Tidak
• GLP memastikan bahwa data yang dikirimkan adalah cerminan
sebenarnya dari hasil yang diperoleh selama penelitian
• GLP sangat menekankan pada perekaman data, pencatatan & retensi
spesimen
• Pastikan kualitas & integritas data yang dikirimkan ke FDA untuk
mendukung keamanan produk yang diatur
• GLP juga memastikan untuk tidak terlibat dalam aktivitas penipuan
apa pun oleh laboratorium.
• Mempromosikan penerimaan internasional atas tes

6
PENGERTIAN GLP

• Prinsip Good Laboratory Practice (GLP) berorientasi pada kualitas

dan validitas data yang dihasilkan dalam pengujian di
laboratorium(EOCD)

• Penerapan GLP dalam lab microbiology dikenal juga sebagai GMLP

• Praktik Laboratorium Mikrobiologi yang Baik (GMLP) fokus pada

pengembangan kemahiran untuk melindungi pekerja lab dari
kemungkinan infeksi yang sangat kecil, penyebaran mikroba yang
tidak terkendali, dan kontaminasi dari sumber eksternal. (Chauhan et al, 2020)

7
 Principles of Good Laboratory
Practice (GLP)
Organisasi dan Program Penjaminan Fasilitas lab Aparat, Bahan dan
Personil Lab Mutu (QAP) Reagen

Prosedur
Sistem pengujian Zat Uji dan Referensi Operasi Kinerja Studi
Standar (SOP)

Penyimpanan dan
Pelaporan Hasil Studi Retensi Catatan dan
bahan
Cakupan SOP
• Pemeriksaan rutin, pembersihan, pemeliharaan, pengujian
dan kalibrasi.
• Tindakan yang harus diambil dalam menanggapi kegagalan
peralatan.
• Menyimpan catatan, pelaporan, penyimpanan,
pencampuran, dan pengambilan data.
• Definisi data mentah.
• Metode analitis.
KONTAMINASI DI DALAM PEMERIKSAAN COVID-19

• Tes asam nukleat (DNA/RNA) dilakukan berbasis amplifikasi berulang pada

sebuah segmen pendek sekuen DNA

• Setiap kali melakukan PCR akan menghasilkan milyaran copy DNA/RNA

(amplikon)

• Amplikon ini akan memberikan hasil positif atau negatif palsu dalam
pemeriksaan PCR

10
SUMBER KONTAMINASI

1. Penanganan spesimen, kontrol positif, atau amplikon yang tidak memadai

2. Aerosol
3. Kontaminan dari berbagai permukaan alat-alat lab
4. Reagensia dan bahan habis pakai
5. Personal lab
6. Kecelakaan kerja di lab

Jika terjadi kontaminasi, maka harus dilakukan dikontaminasi lab molekuler yang
berbiaya mahal, sulit dan memakan waktu. à menghambat pemeriksaan di lab
dan menimbulkan back log

11
PENCEGAHAN KONTAMINASI DI LABORATORIUM
MOLEKULER

1. Desain dan organisasi lab yang sesuai

2. Praktik kerja laboratorium yang baik

3. Mengikuti SOP kerja yang baik à manajemen kualitas lab yang baik

12
DESAIN LABORATORIUM MOLEKULER

Prinsip:
• Bahan habis pakai (consumables) dan area kerja di dalam
lab harus digunakan secara terpisah, terbagi atas:
1. Ruang preparasi reagen/clean room (preparasi
master mix PCR) – tekanan positif
2. Ruang ekstraksi dan penambahan sampel –
tekanan negatif
3. Ruang amplifikasi/post amplifikasi – tekanan
negatif

• Dipisahkan dengan
• Pembatas ruang/tembok
• Pemisahan sisi ruang
• Alur kerja searah (bersih (less contaminant/amplicon)
– kotor (high contaminant/amplicon))

13
ALUR PEMERIKSAAN LAB MOLEKULER

Pre-PCR

Alur kerja
searah

PCR

14
AREA PCR 1 : CLEAN ROOM

1. Merupakan area penyimpanan dan persiapan reagensia

RT-PCR master mix
2. Idealnya merupakan ruangan bertekanan positif
3. Laminar Air Flow (LAF) untuk menghindari reagensia
dari kontaminan lingkungan sekitar.
4. APD yang khusus disimpan dan dipakai di ruangan
bersih/clean room.
5. Semua peralatan dan reagen TIDAK dipidahkan ke
ruangan lain.
6. Spesimen, RNA/DNA, kontrol positif TIDAK
diperbolehkan masuk.
7. Area penambahan kontrol negatif

15
AREA PCR 2 : EKSTRAKSI DAN PENAMBAHAN RNA

1. Area persiapan spesimen berupa proses ekstraksi RNA

2. Area penambahan spesimen RNA yang sudah diektraksi (dilakukan di
BSC kelas II yang berbeda dengan BSC kelas II yang digunakan untuk
ekstraksi RNA)
3. Idealnya ruangan bertekanan negative
4. Alat keamanan yang diperlukan di dalam ruangan ini berprinsip
untuk melindungi pekerja dari kontaminasi spesimen, yaitu :
• BSC Kelas II
• Closed rotor centrifuge (jika ada)
• Vortex
• Safety station: Safety shower dan eye wash station
• Spill kit tools
5. APD khusus disimpan dan dipakai di ruangan ini
6. Semua peralatan dan reagen TIDAK dipindahkan ke ruangan
lain.
16
AREA PCR 3 :PCR

1. Area perbanyakan DNA di dalam mesin Thermal Cycler, serta

analisa hasil rRT PCR.
2. Area Penambahan kontrol positif (di meja lab terbuka atau di dalam
BSC Kelas II).
3. Ruangan ini idealnya bertekanan negatif supaya tidak terjadi
aliran kontaminasi DNA hasil PCR (amplikon) ke ruangan lain.
4. Dianggap sebagai ruangan yang sangat terkontaminasi oleh
produk PCR/amplicon.
5. Semua APD dipakai dan disimpan khusus di ruangan ini.

17
HAL PENTING UNTUK DIPERHATIKAN
Laboratorium PCR dengan dua area kerja tidak direkomendasikan)

• Area 1
• Ruang preparasi reagen (laminar flow dengan lampu UV)
• Ruang preparasi spesimen/ ekstraksi (BSC kelas II)
• PCR set up untuk preparasi sampel

• Area 2
• ruang amplifikasi dan analisis PCR

18
ASPEK TEKNIS YANG PERLU DIPERHATIKAN

1. Pasang tanda Informasi Darurat di pintu masuk laboratorium. Cantumkan nama

dan informasi kontak supervisor laboratorium atau penanggung jawab lainnya.

2. Batasi akses laboratorium; menjaga pintu terkunci ketika laboratorium tidak dijaga.

3. Pastikan bahwa setiap orang yang memasuki laboratorium memahami bahaya

yang terkait dengan laboratorium.

4. Jaga kebersihan lab dan bebas dari kekacauan/berantakan

5. Pastikan bahwa peralatan keselamatan darurat (misalnya, alat pemadam

kebakaran, pencuci mata, pancuran) dapat diakses dan dalam urutan kerja.

6. Sebelum memulai pekerjaan apa pun, tinjau SOP dan PSDS (Pathogen safety
Data Sheet) yang relevan terkait dengan yang dimaksud dan simpan referensi dan
SOP tersebut berdekatan dengan tempat beraktifitas

19
ASPEK TEKNIS YANG PERLU DIPERHATIKAN

7. Kenakan pakaian laboratorium yang sesuai:

a. Jas laboratorium yang rapat dan tidak pernah dipakai di luar laboratorium (masing-masing jas lab di
PCR, Ekstraksi, Mix)
b. Sebelum mengenakan jas lab, periksa dengan cermat jas lab apakah ada lubang, sobek, bukti
kontaminasi, dan bagian dalam kantong untuk mencari puing-puing. Hanya gunakan jas lab yang
bebas dari kekurangan di atas;
c. Sarung tangan: bila dianggap perlu dan selalu saat menangani bahan infeksius atau saat bekerja di
lemari pengaman biologis; keluarkan dan buang sebelum meninggalkan laboratorium. Sebelum
mengenakan sarung tangan, periksa area yang menipis, lubang, sobekan, dan ketidaksempurnaan
lain yang dapat menghambat kualitas pelindungnya.
d. Pelindung mata dan wajah bila diperlukan;
e. Alas kaki dengan jari kaki dan tumit tertutup;
f. Kaki tertutup: jangan menggunakan celana pendek, celana Capri, rok pendek, dll.

20
ASPEK TEKNIS YANG PERLU DIPERHATIKAN

8. Jangan pernah melakukan eksperimen menggunakan sel/swab Anda sendiri.

9. Jangan pernah makan, minum, menyimpan makanan atau minuman dan peralatan
terkait, memakai kosmetik atau lip balm, memegang lensa kontak atau minum
obat di laboratorium.
10. Lakukan semua prosedur untuk meminimalkan percikan, tumpahan, dan pembentukan
aerosol.
11. Jangan sekali-kali memasukkan zat apa pun melalui mulut.
12. Hindari menyentuh mulut atau mata.
13. Ikat rambut panjang ke belakang.
14. Batasi penggunaan jarum dan benda tajam lainnya pada prosedur yang tidak ada
alternatifnya. Jangan membengkokkan, mematahkan, mencukur atau menutup
kembali jarum bekas atau melepaskannya dari pembuangan.
15. Buang semua benda tajam ke dalam wadah benda tajam berlabel, anti bocor dan
tahan tusukan.

21
ASPEK TEKNIS YANG PERLU DIPERHATIKAN

16. Ganti barang plastik dengan barang pecah belah bila memungkinkan. Hindari
penanganan barang pecah secara langsung; Gunakan sikat dan pengki, penjepit, atau
tang.
17. Hindari membawa barang-barang (misalnya buku, ponsel) yang tidak dapat dengan
mudah didekontaminasi ke dalam lab.
18. Simpan barang-barang pribadi seperti dompet, ransel, dan pakaian jalanan secara
terpisah dari APD dan jauh dari daerah penanganan bahan biologis
19. Tutup semua luka terbuka, terpotong, tergores atau tergores dengan pelindung tahan
air dan sarung tangan sekali pakai.
20. Gunakan perangkap disinfektan dan filter in-line untuk melindungi saluran vakum dari
kontaminasi.
21. Cuci tangan setelah melepas sarung tangan dan alat pelindung diri lainnya,
setelah menangani bahan infeksius sebelum meninggalkan laboratorium.

22
ASPEK TEKNIS YANG PERLU DIPERHATIKAN

21. Ikuti prosedur pembersihan dan pembuangan yang sesuai:

a. Dekontaminasi permukaan kerja dengan bahan yang sesuai di akhir setiap kegiatan
dan setelah tumpahan apa pun;
b. Pastikan bahwa semua kultur dan stok didekontaminasi sebelum dibuang;
c. Dekontaminasi barang pecah belah, instrumen dan jas lab sebelum digunakan
kembali, didaur ulang atau dibuang;
d. Buang barang pecah belah dalam wadah tahan tusukan;
e. Pastikan bahwa pakaian yang terkontaminasi telah didekontaminasi sebelum dicuci.
23. Segera Lapokan semua kejadian dan insiden tumpahan kepada penanggungjawab lab

23
TERIMA KASIH