EKSTRAKSI RNA VIRUS

REFRESHMENT PEMERIKSAAN PCR COVID-19

Kindi Adam
2 Maret 2021
 Sistematika
Sejarah, Tujuan, Manfaat

Prinsip ekstraksi asam nukleat

Metode ekstraksi RNA

Proses ekstraksi RNA

Troubleshooting
 Sejarah
Friedrich Miescher (1869) : ekstraksi asam nukleat dari sel darah
putih. Dinamakan DNA oleh Albrecht Kossel (1881).
James Watson, and Francis Crick (1953) : struktur DNA dan
perannya dalam meneruskan informasi genetik. Dengan
Menginterpretasikan gambar X ray milik Roslind Franklin
Proses ekstraksi merupakan awal bagi penemuan besar di sejarah
kehidupan manusia. memungkinkan manusia untuk mempelajari
proses fisiologis dalam kehidupan

Siun Chee Tan ,and Beow Chin Yiap, 2009

 Tujuan
• Melepaskan asam nukleat dari sel
• Memperoleh asam nukleat yang
murni (bebas kontaminasi protein,
karbohidrat maupun lemak)
• Untuk mempelajari penyakit genetik,
kanker, infeksi pathogen (parasite,
bakteri maupun virus)
 Manfaat
Ekstraksi merupakan tahap awal bagi
berbagai macam studi molekuler
• Riset eksperimental
• Penyelidikan forensik
• Mutagenesis
• DNA rekombinan
• Produksi vaksin
• Terapi gen
• Aplikasi diagnostik
 Prinsip Dasar Ekstraksi
Lisis: Memecah/ melisiskan jaringan atau sel (enzimatik,
kimia, mekanik)

Presipitasi-pencucian: Memisahkan asam nukleat dari

kontaminan seperti protein, lemak dan kontaminan lain

Elusi: Transfer asam nukleat ke dalam air atau larutan

buffer tertentu yang dapat mengawetkannya

Modifikasi dapat dilakukan berdasarkan jenis spesimen yang akan diekstraksi

 Prinsip Dasar Ekstraksi
• Memecah/ melisiskan jaringan atau sel
Tris, MgCl2, EDTA, NaCl, SDS, CTAB, Triton X100
• Digestion of protein
CTAB, SDS, phenol, chloroform, Nonidet P40, different chaotropic,
urea, guanidium isothiocyanate, guanidium thiocyanate, N-Lauroyl,
sarcosine
• Presipitasi
Isopropanol, ethanol, methanol, NaCl, sodium acetate
• Washing
Any alcohol
• Eluen
TE buffer, distil water
 Metode Ekstraksi
Berdasarkan bahan ekstraksi:
1. Solution based RNA
RNA

• Guanidin tiosianat-fenol-
kloroform
• CTAB
• Alkaline
• EtBr – CsCl
RNA

manual, kompleks, time consuming

 Metode Ekstraksi
2. Solid-phase based
• Silica kolom
• Partikel kaca
• Diatomaceous earth
• Magnetic bead
• Anion exchange
RNA

Kit komersial, waktu yang relatif lebih cepat dan sederhana

 Metode Ekstraksi
Berdasarkan teknologi yang digunakan:

1. Manual
• Mengikuti manual kit.
• Memerlukan tenaga
Laboratorium yang telah
terlatih.
• Lebih efisien jika sampel RNA

yang akan diperiksa sedikit

 Metode Ekstraksi
2. Otomatis
A. Cartridge based
 Metode Ekstraksi
2. Otomatis
B. Robotic based: open system dan closed system
 Metode Ekstraksi

Ali, etal, 2017

Metode yang digunakan di Lab masing masing?

Kirim jawaban di chat box

Otomatis/manual _ [MEREK KIT]

 Proses Ekstraksi RNA
1. Tahap Persiapan
• Penggunaan APD
• penyiapan reagensia,
bahan habis pakai
• penyiapan tempat/BSC 
berhubungan dengan
hazard spesimen
• meminimalisir resiko
kontaminasi dan
keselamatan kerja
 Proses Ekstraksi RNA
2. Protokol ekstraksi RNA
• Dipilih sesuai dengan kit yang digunakan,jenis spesimen dan juga
teknologi ekstraksi yang dilakukan (manual atau otomatis)

• Semua tahapan prosedur ekstraksi harus diikuti dengan baik

RNA
 Proses Ekstraksi RNA
3. Uji kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi
a. Uji kuantitas konsentrasi DNA/RNA  spektrofotometer
dengan beberapa panjang gelombang :
• Asam nukelat (DNA, RNA, nukleotida): 260 nm
• Protein: 280 nm
• Kontaminan lain: 230 nm

b. Penentuan konsentrasi asam nukelat

• DNA: 50 µg/ml
• RNA: 40 µg/ml
 Proses Ekstraksi RNA
3. Uji kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi
c. Uji kualitas  kemurnian asam nukleat.
• DNA: A260/A280≥1,8
• RNA: A260/A280≥2
• DNA/RNA: A260/A230≥2
 Proses Ekstraksi RNA
4. Penyimpanan RNA
a. Jangka panjang: dried or lyophilized (+Stabilizing agent)
• Trehalose
• Commercially available stabilizers
• DNAstable (Biomatrica)
• QIAsafe DNA (Qiagen)
• GenTegra DNA (integenX)

b. Jangka pendek/dilution needed: in solution

• Nuclease free water
• TE-Buffer
 Proses Ekstraksi RNA
4. Penyimpanan RNA
c. Suhu penyimpanan
• Hasil esktraksi RNA tidak disimpan di suhu ruang
untuk menghindari kerusakan RNA.
• suhu 4℃  jika langsung digunakan untuk PCR
• suhu -20℃  jika akan digunakan dalam waktu
24 jam
• suhu -80℃  jika akan disimpan dalam jangka
waktu 1-6 bulan
• suhu liquid nitrogen  jika akan disimpan lebih
dari 6 bulan
 Perlu Diperhatikan
• Hazard level spesimen: pemilihan BSC sesuai
dengan level biosafety dari patogen yang
diperiksa
• Aliran udara BSC harus tetap terjaga dengan
baik dan tidak ada penahan aliran udara saat
bekerja 
• Menggunakan sarung tangan
• area kerja bebas RNase
• Menerapkan GLP agar terhindar dari
kontaminasi.
• Memperhatikan keselamatan dan keamanan
kerja (Biosafety dan Biosecurity)
Troubleshooting
 Best practices 1
1. Gunakan APD secara memadai dan tidak boleh digunakan berpindah ruangan
a. Jas lab disposable
b. Penutup kepala
c. Shoe cover
d. Sarung tangan disposabel sesuai ukuran
e. Kaca mata pengaman
2. Gunakan sarung tangan disposable dan ganti sesering mungkin
3. Ganti jas lab jika berpindah area kerja
4. Bekerja secara uni-directional atau petugas yang berbeda-beda tiap ruang
5. Semua reagensia harus dilabel dengan baik
6. Gunakan alas lantai yang sticky pada tiap pintu masuk ruang lab untuk
menyaring partikular pada bagian bawah alas kaki yang digunakan
 Best practices 2
7. Gunakan mikropipet yang terkalibrasi dan tip aerosol barrier
8. Dekontaminasi area kerja pada saat memulai dan selesai bekerja dengan
menggunakan larutan 10% sodium hipoklorit dan etanol 70%.
9. Jika BSC sudah tidak digunakan, lakukan penyinaran UV setelah
dekontaminasi selesai.
10.Sebagai tambahan larutan deaktivasi enzim seperti urasil-N-glycosilase
dapat digunakan untuk menghilangkan amplikon yang tidak di inginkan
11.Lakukan dekontaminasi pipet, permukaan berbagai alat2 kerja, gagang
pintu dan alat-alat lain setelah digunakan pada hari tersebut
12.Lakukan uji swab pada berbagai alat di lingkungan lab untuk mendeteksi
kemungkinan kontaminan, secara berkala
Semua personal yang masuk atau bekerja di dalam
laboratorium molekuler harus dilatih, termasuk petugas
kebersihan dan petugas maintenance
Referensi

http://downloads.hindawi.com/journals/bmri/2017/9306564.pdf

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4614-3970-7_11

https://www.cytometry.be/-
/media/Files/BSAC/Events/Mol_2011/DNAExtraction.pdf?
la=en&hash
=7D500AC062A9C4EF5DD81D95D266A84ED3623DA8

17
Terima Kasih