Ekstraksi RNA virus SARS-Cov-2 dari

RS Putri Hijau
Sampel Swab Nasofaring/Orofaring
Menggunakan
BADAN 21 Oktober 2020
PENGKAJIAN DAN Viral DNA/RNA Isolation Kit (Liferiver)
PENERAPAN
TEKNOLOGI

1. Tujuan
Melakukan ekstraksi RNA virus SARS-Cov-2 dari sampel swab menggunakan kit isolasi virus
berbasis lisis partikel virus dan pengikatan RNA virus pada membrane silica.

2. Prinsip Kerja
Partikel virus pada VTM dilisis menggunakan buffer lisis yang mengandung guanidium
isothiocyanate (GITC) untuk mengekstraksi RNA virus. Lisat yang dihasilkan dilewatkan pada
membrane silica dengan teknik sentrifugasi untuk mengikat RNA virus, dilakukan proses pencucian
untuk menghilangkan kontaminan, RNA dielusi dengan DNase/RNAse free water.

VTM + Lysis Buffer

Cell Lysis Binding Wash Elution RNA -800C

3. Fasilitas Laboratorium
Isolasi RNA virus SARS-Cov-2 dilakukan pada fasilitas mBSL 2+ didalam Bio-Safety Cabinet
class II (BSC-II).

4. Alat Pelindung Diri (APD)

Saat melakukan isolasi RNA virus SARS-Cov-2 WAJIB menggunakan APD lengkap (hazmat,
masker, goggles/face shield, gloves steril, hair cap, shoes cover).
 5. Alat Laboratorium yang Digunakan
 BSC-II
 Mikropipet
 Vortex
 Sentrifugasi

6. Bahan Habis Pakai (Disposable Consumable) dan Reagen yang Digunakan

o VTM sampel swab pasien
o Kit Ekstraksi RNA Virus (Viral DNA/RNA Isolation Kit (Liferiver))
 Lysis Buffer
 Proteinase K
 Washing Buffer A (tambahkan etanol sebelum digunakan)
 Washing Buffer B (tambahkan etanol sebelum digunakan)
 Binding Columns
 Elution Buffer
 2 ml Collection tubes
o Etanol Absolut
o Tabung mikro 1,5 ml
o Barrier Tips Filter
o Alkohol teknis 85%
o Bleach (Sodium hypochloride/ NaOCl ) konsentrasi 0,5%

7. Prosedur Kerja
Pembuatan lysis buffer :
Hitung jumlah lysis buffer yang diperlukan dengan mencampurkan Lysis Buffer dan Proteinase K
dengan rumus sebagai berikut:

Buffer AVL Proteinase K

1 rx 600 µl 20 µl
2 rx 1200 µl 40 µl
dst.
No Tahapan Prosedur
1. Dekontaminasi 1. Semprot seluruh permukaan tempat kerja,
permukaan kerja dan mikropipet, rak tabung, dan tangan menggunakan
Persiapan awal alkohol teknis 85% lalu lap menggunakan tissue atau
dapat menggunakan larutan pendekontaminasi RNAse
apabila tersedia
2. Siapkan wadah untuk limbah cair dan wadah untuk
3. limbah padat secara terpisah. Saat autoclave limbah
cair dan padat harus terpisah
2. Lisis 1. Transfer 300 µl VTM hasil swab pasien kedalam
tabung mikro 1,5 ml steril
2. Tambahkan 620 µl Lysis Buffer, vortex dan spin down
beberapa detik

3. Inkubasi suhu 560C selama 15 menit

4. Tambahkan 600 µl alkohol absolut
5. Vortex dan spin down

3. Nucleid Acid Binding 6. Pasang spin column pada 2 ml collection tube

7. Transfer 760 µl lisat kedalam spin column secara
perlahan
8. Tutup column, lalu sentrifugasi 12.000 rpm selama 1

menit (suhu 4-80C)

9. Buang supernatan, pasang kembali collection tube
yang sama
10. Ulang prosedur 7-8

4. Pencucian 11. Masukkan 500 µl Wash Buffer A kedalam Spin column

12. Sentrifus 12.000 rpm selama selama 1 menit (suhu 4-

80C)
13. Buang supernatan, pasang kembali collection tube
yang sama
14. Masukkan 500 µl Washing Buffer B
 15. Sentrifus 12.000 rpm selama selama 1 menit (suhu 4-

80C)

5. Elusi RNA Virus 16. Pindahkan Spin column ke tabung mikro 1,5 ml steril
17. Tambahkan 50 µl elution buffer pada bagian tengah
matrik matrik column
18. Diamkan dalam suhu ruang (RT) selama 5 menit
19. Sentrifus 12.000 rpm selama selama 1 menit (suhu 4-

80C)
20. RNA serahkan pada team PCR atau segera simpan
pada freezer

6. Desinfeksi selesai bekerja 1. Semprot semua permukaan tempat kerja menggunakan

etanol teknis 85%
2. Autoclave semua tabung dan limbah padat yang
terkontaminasi virus
3. Kumpulkan limbah cair dan desinfeksi
menggunakan cairan NaOCl

CATATAN :
1. JANGAN menyentuhkan ujung tips pada membrane silica
2. Selalu mengganti tips pada setiap tahapan
3. Jika ada cairan yang tumpah ke sarung tangan segera mengganti sarung tangan
4. WAJIB melakukan desinfeksi sebelum dan sesudah bekerja