Indentifikasi 16sRNA Bakteri

A. ISOLASI DNA Bakteri

Nama Kit: Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)

1. Pellet Cells
➢ Sentrifugasi 1 mL-5 mL overnight kultur bakteri pada 13-16000 x g, 2 menit
➢ Buang supernatan

2. Cell Lysis
➢ Tambahkan 600 uL Nuclei Lysis Solution
➢ Campurkan dan aduk larutan dengan sampel perlahan
➢ Note: pastikan sampel terlarut sempurna!
➢ Inkubasi 5 menit pada 80 oC
➢ Dinginkan pada suhu ruang
➢ Tambahkan 3 uL RNAse solution
➢ Campurkan, inkubasi pada 37 oC 15-60 menit
➢ Dinginkan pada suhu ruang

3. Protein Precipitation
➢ Tambahkan 200 uL Protein Precipitation Solution
➢ Vortex
➢ Inkubasi pada es selama 5 menit
➢ Sentrifugasi pada 13-16000 x g, 3 menit
➢ Pindahkan supernatant ke microtube baru

4. DNA Precipitation and Rehydration

➢ Tambahkan 600 uL isopropanol dan campurkan
➢ Sentrifugasi 13-16000 x g, 3 menit
➢ Tuang/buang supernatant
➢ Tambahkan 600 uL 70 % etanol dan campurkan
➢ Sentrifugasi pada 13-16000 x g, 2 menit
➢ Buang ethanol, dan keringkan pellet 10-15 menit
➢ Tambahkan 75-100 uL Rehydration solution pada 65 oC, selama 1 jam sebelum di
proses PCR
B. PCR
1. Siapkan PCR mix
2. Komposisi PCR mix

Komposisi Volume uL
My Taq Red Mix 2x 25
Primer 16SrRNAForward 1
Primer 16SRNA Reverse 1
ddH2O 21
DNA sampel 2
 3. Note: Buat terlebih dahulu PCR mix sebelum menambahkan DNA template sejumlah
sampel yang di miliki !

4. Program Running PCR

34
cycles

Temp 95.0 94.0 50.0 72.0 72.0 4.0

Time 2:00 0:30 0:30 1:00 5:00 5:0

C. ELEKTROFORESIS
➢ Gel agarose 2 % (80 mg agarose powder dilarutkan dalam 40 mL TBE buffer)
➢ Program running elektroforesis:
50 V, ~ 1 Jam
➢ Note: Jangan lupa menggunakan marker DNA lader!