Deteksi Taura Syndrome Virus (TSV) pada

Udang Vannamei dengan Metode

Reverse Transcription (RT-PCR)

Nama :
Yoby Muchtam

Pembimbing :
1. Indri
2. Dwi

Program Studi Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Pendahuluan
Latar Belakang Masalah
Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan jenis udang
yang menjadi komoditas unggulan dalam sektor perikanan. Udang
vaname memiliki potensi yang besar untuk dibudidayakan di
Indonesia karena pertumbuhannya cepat dan lebih toleran dan tahan
terhadap perubahan lingkungan. Akan tetapi, salah satu kendala
dalam budidaya udang vaname adalah penyakit yang disebabkan oleh
infeksi Taura Syndrome Virus (TSV). Menurut OlE (2009), udang
vaname merupakan salah satu host dari Taura Syndrome Virus. Infeksi
virus tersebut dapat menyebabkan kematian 80-85% dari populasinya
(Rufiati, 2008) sehingga dapat menimbulkan kerugian dalam
pembudidayaan.
Gambar 1. Udang Vannamei yang berasal dari LAB Bioassay LP2IL Serang
(Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2018)

Gambar 2. Udang Vannamei yang terinfeksi penyakit TSV

(Sumber : Google, 2018)
Pendahuluan
Sejarah
 Tahun 1992, di Ekuador menyerang udang Penaeus vannamei (OIE,
2009).
 Tahun 1993, kembali mewabah di Ekuador menyebar ke seluruh wilayah
utama Amerika pada udang Litopenaeus vannamei yang dikultur
menyebabkan dampak ekonomi lebih dari US $ 2 miliar.

Definsi
 Sindrom Taura (TS) adalah penyakit virus udang penaeid yang disebabkan
oleh infeksi Sindrom Taura Virus (TSV).
 Termasuk dalam family Dicistroviridae, genus Aparavirus (Afrianto,
2010). TSV mempunyai bentuk icosahedrons, dengan ukuran partikel
32 nm, dan tidak diselimuti selaput (envelope) (OIE, 2009).
(Sumber : Google, 2018)
Pendahuluan
Tujuan
Mendeteksi keberadaan TSV secara molekuler dengan
teknik Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-
PCR)

Manfaat
Mampu memahami teknik Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) untuk mendeteksi
keberadaan TSV secara molekuler sehingga dapat melakukan
tindakan pencegahan dan penanganan penaggulangan.
Metodologi
Waktu danTempat
Kegiatan praktik kerja lapangan dilakukan pada tanggal
1 Februari – 1 Maret 2018 di Loka Pemeriksaan Penyakit Ikan
dan Lingkungan (LP2IL) Serang, Banten.

Jl. Raya Carita, Umbul Tanjung, Cinangka, Umbul

Tanjung, Serang, Banten 42167

(Sumber : Google.com 2018)

Metodologi
Alat dan Bahan
• Alat
Fume hood, microcentrifuge, minimixer, mikropipet berbagai
ukuran, LAF horizontal, DNA/RNA UV cleaner box, UV
sterilization cabinet, thermalcycler, magnetic stirer, oven microwave,
autoclaf, elektroforesis horizontal, uv transilluminator, kamera
digital, dan personal computer.

 Bahan
RNA extraction buffer, chloroform, isopropanol, ethanol 75%,
DEPC water, 1 x RT premix, 1 x PCR premix, RT enzyme, taq
enzyme, tris aminomethane, boric acid, EDTA, agarose, GelRed 3x
in water, Loading dye 6x, larutan TBE 1x, DNA marker, akuades,
mikrotube (0,2 dan 1,5 ml) dan mikrotip berbagai ukuran.
Metodologi
Preparasi sampel
Alat disterilisasi dengan
Siapkan alat dan bahan Udang dicuci dengan
alkohol 70 % dan api
preparasi akuades
bunsen
 Metodologi
Preparasi sampel
Organ udang seperti kaki Organ sampel yang telah
Organ sampel ditampung
renang, insang, dan homogen diambil
pada 1,5 mL mikrotube
hepatopankreas diambil sebanyak 2,5 mg dan
dan dihomogenkan
menggunakan pinset dan dipindahkan ke 1,5 mL
menggunakan gunting
gunting mikrotube yang baru
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 1 Pelisisan Sel

Homogenkan, Pindahkan
400 µl 4 µl
diamkan 3 menit sampel

Pindahkan filtrat ke 1000 x g selama

1,5 mikrotube baru 30 detik
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 2 Pengikatan RNA

Buang cairan pada

400 µl 16.000 x g collection tube
selama 1 menit

Letakkan RB column
16.000 x g 400 µl kembali pada
selama 30 detik collection tube
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 2 Pengikatan RNA

Buang RB
45 µl 5 µl Pada bagian tengah
column
DNA 1 solution RB column

Inkubasi pada
suhu ruang, 15
menit.
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 3 Pencucian

16.000 x g Buang cairan pada Letakkan RB column

400 µl selama 30 detik collection tube kembali pada
collection tube

Letakkan RB column
kembali pada Buang cairan pada 16.000 x g
collection tube collection tube selama 30 detik 600 µl
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 3 Pencucian

Buang cairan pada

16.000 x g collection tube
600 µl selama 30 detik

Letakkan RB column
16.000 x g kembali pada
selama 3 menit collection tube
Metodologi
Ekstraksi RNA Sampel : Step 4 Elusi RNA

50 µl 16.000 x g
selama 1 menit

Siap diamplifikasi Dibuang

Metodologi
Komponen dalam Amplifikasi (Resep PCR)

No. Komponen Konsentrasi 1 X Konsentrasi 3,2 X

1 x RT PCR Premix 6,7 21,44

RT enzyme 0,8 2,56
Step1
Taq enzyme 0,5 1,6
DNA template 2 -
Total 10
1 x PCR Premix 14 44,8
N
Taq enzyme 1 3,2
Total 15
Metodologi
Pembuatan Master Mix
Dan Amplifikasi
Step 1
1 x RT PCR
21,44 µl
Premix

RT enzyme 2,56 µl

Setiap
Taq enzyme 1,6 µl tabung 8 µl - +

Siap 2 µl
ditambahkan
nested DNA
template
Metodologi
Pembuatan Master Mix
Dan Amplifikasi
Nested

1 x PCR
44,8 µl
Premix

Taq enzyme 3,2 µl Transfer ke

Setiap tabung
step 1
15 µl

Siap di
elektroforesis
Metodologi
Pembuatan 1,5 Gel Agarose

5 menit,
1,5 g 100 ml temperatur 3 µl Florosafe
medium high DNA Stain

Simpan pada TAE Potong gel Tuang pada

0,5 X menjadi 2 bagian cetakan
 Metodologi
Running Elektroforesis

Buat 3 tetesan 1 µl Loading dye

Nugen, masing masing
Pastikan gel ditambahkan 5 µl kontrol negatif,
Letakka gel pada terendam buffer sampel dan kontrol positif ,
mesin elektroforesis TAE 0,5 X masukkan dalam sumuran

Running Atur posisi agar dan

elektroforesis selama tutup tangki Masukkan 3 µl DNA
30 menit elektrofresis Ladder ke sumuran
 Metodologi
Visualisasi denganTransilluminator

Masukkan agar yang Atur kamera dan

Tutup dan nyalakan foto agar
telah dibilas akuades sinar UV
ke dalam T-UV

Matikan sinar UV, buka

Hasil foto disimpan
transilluminator, buang
ke komputer
agar dan bersihkan
 Hasil
M - + S

222 bp

Gambar 1. Hasil visualisasi TSV udang vannamei pada elektroforesis gel agarose

(Sumber : Dokumentasi Pribadi (LP2IL), 2018)

Pembahasan
Berdasarkan hasil yang didapatkan dari hasil visualisasi
menggunakan transilluminator UV dapat diketahui bahwa
sampel udang yang didapat dari LP2IL bebas dari TSV. Hal ini
dapat dilihat berdasarkan tidak adanya band pada panjang
fragmen 222 bp.
Hasil uji secara molekuler ini juga didukung oleh gejala
klinis pada udang yang tidak menunjukkan adanya gejala
terserang TSV seperti wama tubuh yang menjadi kemerahan,
terutama pada ekor udang yang mati serta bercak hitam
(melanisasi) yang tidak beraturan di bawah lapisan kutikula.
Kesimpulan
Gejala klinis pada udag serta hasil uji secara molekuler
menunjukkan bahwa sampel udang yang didapat dari Loka
Pemeriksaan Penyakit Ikan dan Lingkungan bebas dari TSV.
Daftar Pustaka
Afrianto, E & Liviawati, E. 2010. Pengendalian Hama dan
Penyakit Ikan.Yogyakarta: Kanisius.

OIE. 2009. Taura Syndrome. Manual of Diagnostic Tests for

Aquatic Animals.

Rufiati, L. 2008. Taura SyndromeVirus (TSV) dan Channel Catfish

DiseaseVirus (CCDV). Panduan Mata Kuliah Parasit dan
Penyakit Ikan, Jurusan Perikanan Fakultas Pertanian
UGM,Yogyakarta.