LANGKAH KERJA

Analisis Sampel
1.9.1 Serum Insulin
1. Siapkan reagen :
a. Kalibrator: merekonstitusi kalibrator 0 dengan 2,0 mL aquades dan
merekonstitusi kalibrator 1, 2, 3, 4, dan 5 dengan masing-masing 0,5 mL
aquades
b. Kontrol: merekonstitusi kontrol 1 dan kontrol 2 dengan masing-masing 1 mL
aquades
c. Larutan working wash: membuat larutan working wash dengan menambah 199
volume aquades dengan 1 volume larutan working wash (200x). Gunakan
magnetic stirrer untuk menghomogenkan.
d. Larutan anti-insulin-HRP conjugate, Chromogenic, dan Stop dapat langsung
digunakan tanpa proses penyiapan
2. Siapkan sampel dengan ketentuan berikut:
a. Serum harus disimpan pada suhu 2-8oC
b. Serum dibiarkan pada suhu ruang dan disarankan untuk mevortex sampel
sebelum digunakan
c. Jangan gunakan sampel yang sudah hemolysis
3. Analisis dengan cara:
a. Bawa seluruh komponen analisis (termasuk sampel) pada suhu ruang sebelum
digunakan
b. Hitung jumlah well yang digunakan untuk analisis. Well yang tidak digunakan
disimpan kembali dalam tempat yang sesuai pada suhu 2-8oC
c. Pipet sebanyak 50 μl dari masing-masing kalibrator, kontrol, dan sampel
sebanyak dua kali (duplo) ke dalam well yang sesuai
d. Pipet sebanyak 50 μl anti-insulin-HRP conjugate ke dalam masing-masing well
e. Inkubasi plate selama 30 menit pada suhu ruang
f. Buang cairan dari seluruh well
 g. Cuci plate sebanyak tiga kali dengan memasukkan 0,4 mL/well/cuci larutan
working wash ke semua well lalu buang isi well
h. Pipet sebanyak 100 μl Chromogenic Solution ke dalam masing-masing well
dalam waktu 15 menit setelah langkah pencucian
i. Inkubasi plate selama 15 menit pada suhu ruang
j. Pipet sebanyak 100 μl Stop Solution ke dalam masing-masing well
k. Baca absorbansi pada 450 nm (filter referensi 630 nm atau 650 nm) dalam 1
jam dan hitung hasilnya
4. Interpretasi data:
1. Baca plate pada 450 nm terhadap filter referensi pada 650 nm (atau 630 nm)
2. Setelah mendapatkan data absrobansi kalibrator, kontrol, dan sampel, buka
software MyAssays
3. Masukkan seluruh data absorbansi kalibrator, kontrol, dan sampel ke software
MyAssays
4. Atur pemetaan sampel saat analisis pada software MyAssays
5. Masukkan seluruh konsentrasi kalibrator yang digunakan pada software
MyAssays
a. Masukkan faktor pengenceran sampel (jika ada)
b. Masukkan ID/koding sampel pada software MyAssays
c. Masukkan keterangan analisis pada run notes
d. Klik calculate untuk mendapatkan hasil konsentrasi, %CV, dan SD tiap sampel

1.9.2 Mutan p53 Jaringan

1. Siapkan sampel dengan ketentuan berikut:
a. Sampel jaringan dikumpulkan setelah proses pembedahan(sesegera mungkin).
b. Menyimpan sampel jaringan pada suhu kamar untuk waktu yang lama (>30
menit) harus dihindari.
c. Jika sampel tidak dapat dikumpulkan sesegera mungkin, maka spesimen bedah
harus disimpan pada suhu 4oC, dan harus dikumpulkan dalam waktu maksimal 3
jam (Kanai et al., 2018).
 Jumlah sampel yang diperbolehkan untuk dikumpulkan yaitu pada ukuran 1 x
0.5 x 0.3 cm atau 50–100 mg. Jika sampel jaringan yang diperoleh berukuran lebih
kecil, jaringan tetap dikumpulkan karena tetap dapat berguna untuk proses
analisis.
d. Berikut merupakan hal yang perlu dilakukan pada spesimen bedah:
1. Sampel jaringan dipotong menjadi ukuran 2-3 mm2
2. Setiap potongan sampel jaringan dimasukkan ke dalam 1 microtube ukuran
1,5 mL. Gunakan tube dan label ultralow-temperature-resistant.
Jika lebih dari satu potongan harus ditaruh pada 1 microtube, pastikan potongan
melekat pada dinding dan terpisah satu sama lain, serta tidak melebihi 60%
kapasitas microtube.
2. Snap Freezing
Sampel jaringan yang sudah dimasukkan ke dalam microtube disimpan
menggunakan metode snap freezing dengan langkah sebagai berikut:
a.Microtube yang sudah berisikan sampel jaringan disimpan dalam kontainer yang
berisikan nitrogen cair. Penempatan microtube sampel ke dalam wadah nitrogen
cair harus sesegera mungkin dilakukan agar sampel dapat disimpan jangka
panjang sampai proses analisis dilakukan.
b.Simpan dalam sample box dengan suhu -80oC
c.Penyimpanan jangka panjang dilakukan dengan menggunakan ultra deep freezer
(-80oC)
3. Homogenisasi Sampel
Tujuan utama dari homogenisasi sampel adalah untuk melarutkan protein
sebanyak mungkin dari jaringan (Adamczyk et al., 2018). Sebelum proses
homogenisasi, terlebih dahulu dilakukan pencairan terhadap sampel jaringan beku
dengan mengaliri air pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan homogenisasi terhadap
sampel dengan langkah sebagai berikut:
a. Timbang sampel jaringan dengan cepat dan masukkan ke homogenizer
b. Tambahkan 4-5 mL phosphate-buffered saline (PBS) dan 40-50 µL protease
cocktail inhibitor.
c. Homogenisasi dilakukan dengan menggerakkan pestle ke atas dan ke bawah
pada homogenizer di atas dry ice.
d. Sentrifugasi pada 10.000 rpm, 4oC selama 10 menit.
e. Ambil supernatan dan pindahkan ke microtube bersih.
f. Simpan dalam suhu -80oC.

4. Prosedur Pengerjaan
3.9.2.1 Penyiapan Reagen
Berikut adalah langkah-langkah penyiapan dan pembuatan reagen sebelum
pengukuran kadar mutan p53 jaringan dilakukan:
1. Letakkan semua komponen kit dan sampel pada suhu ruang (20-25ºC) sebelum
digunakan.
2. Jika konsentrasi sampel tidak diketahui memenuhi rentang deteksi dari kurva
standar atau tidak, maka lakukan orientasi terlebih dahulu. Orientasi dilakukan
untuk menentukan pengenceran yang optimum dengan cara membandingkan
sampel yang tidak diencerkan, pengenceran 1:2, dan pengenceran 1:4. Pengenceran
dilakukan dengan sapar (buffer) berupa PBS (pH 7.0-7.2).
3. Larutan pencuci: larutkan 10 ml larutan pencuci terkonsentrasi (100x) dengan
990 mL aqua terdeionisasi atau aquades untuk mendapatkan 1000 mL larutan
pencuci (1x). Jika terdapat kristal pada larutan terkonsentrasi (100x), maka
hangatkan pada suhu ruang dan aduk secara perlahan hingga kristal terlarut.
Larutan pencuci (1x) stabil selama 2 minggu pada suhu 2-8 ºC.

Semua standar dan sampel diujikan secara triplo. Berikut cara kerja pengukuran
serum mutan p53 menggunakan ELISA kit:
1. Letakkan sumur yang akan digunakan pada penyangga. Kocok botol
tiap standar secara perlahan dan pipet larutan standar dengan gerakan naik
turun sebanyak tiga kali sebelum digunakan. Tambahkan 100 µL standar
atau sampel pada sumur. Tambahkan 100 µL PBS (pH 7.0-7.2) pada sumur
blanko kontrol.
c.Tambahkan 50 µL konjugat ke dalam masing-masing sumur, kecuali sumur
 blanko kontrol. Pencampuran dengan baik adalah hal yang penting pada langkah
ini. Tutup dan inkubasi plat selama 1 jam pada suhu 37ºC.
d. Pencucian microtiter plate: buang campuran pada sumur ke dalam wastafel
atau wadah lainnya. Isi tiap sumur dengan larutan pencuci (1x), lalu buang.
Ulangi prosedur ini sebanyak lima kali untuk total proses pencucian sebanyak 5
kali. Setelah dicuci, balikkan plat dan keringkan dengan kertas absorben atau
kertas handuk hingga tidak terdapat cairan.
e. Tambahkan 50 µL substrat A dan 50 µL substrat B ke dalam tiap sumur,
termasuk sumur blanko kontrol. Tutup dan inkubasi selama 15-20 menit pada
suhu 37ºC. Hindari sinar matahari. Jika warna yang muncul tidak gelap, maka
lakukan inkubasi dalam waktu yang lebih lama. Waktu inkubasi maksimum
adalah 30 menit.
f. Tambahkan 50 µL larutan penghenti ke dalam tiap sumur, termasuk sumur
blanko kontrol. Campurkan dengan baik.
g. Ukur Optical Density (O.D.) pada 450 nm menggunakan microplate reader
dengan segera.
4. Interpretasi Data
Kadar protein mutan p53 didapatkan dari kurva kalibrasi. Interpretasi data hasil
pengukuran dilakukan dengan cara:
1. Rata-ratakan hasil pembacaan triplo untuk setiap standar dan sampel. Semua nilai
O.D. yang didapatkan dikurangi dengan hasil rata-rata blanko kontrol.
2. Buat kurva standar dengan cara menetapkan nilai rata-rata O.D. untuk setiap
standar pada sumbu X terhadap konsentrasi pada sumbu Y. Data juga dapat
dilinearkan dengan menetapkan log konsentrasi terhadap log O.D.
3. Hitung konsentrasi sampel yang sesuai dengan rata-rata absorbansi dari kurva
standar. Jika sampel telah diencerkan, maka hasil konsentrasi dari kurva standar harus
dikalikan dengan faktor pengenceran.

1.9.3 Pengukuran Kadar Protein Total

1. Persiapan Standar dan Reagen Kerja
• Persiapan Standar Albumin yang Dilarutkan (BSA)
 Encerkan satu ampul Standard Albumin (BSA) ke dalam beberapa botol bersih,
gunakan pengencer yang sama dengan sampel. Setiap ampul 1mL dari 2mg /
mL Standard Albumin untuk menyiapkan satu set standar encer. Standar encer
dibuat menjadi triplo.
• Persiapan Reagen Kerja BCA
1. Tentukan volume total WR yang dibutuhkan ±50 mL
2,0mL dari WR diperlukan untuk setiap sampel dalam prosedur tabung
reaksi, sementara hanya 200 μl reagen WR diperlukan untuk setiap sampel
dalam prosedur lempeng mikro.
2. Siapkan reagen dengan mencampur 50 bagian Reagen BCA dengan 1
bagian Reagen BCA B (50: 1, Reagen A: B). Siapkan volume reagen yang
cukup berdasarkan jumlah sampel yang akan diuji. Simpan reagen dalam suhu
kamar.

Gambar 3.4 Prosedur uji tube menggunakan protokol standar

2. Prosedur Microplate (Sampel dengan reagen kerja = 1:8)

a. Pipet 25μL dari setiap sampel standar atau unknown, replikasikan ke dalam lempeng
mikro (rentang kerja = 20-2000μg / mL)
b. Tambahkan 200 μL dari reagen kerja ke masing-masing sumur dan campur pelat
dengan seksama pada pengocok piring selama 30 detik.
c. Tutup plate dan inkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit.
d. Dinginkan plate ke reagen kerja. Ukur absorbansi pada 562nm pada pembaca plate.
e. Kurangi rata-rata pengukuran absorbansi 562nm dari standar Blank yang direplikasi
dari pengukuran 562nm dari semua standar individu dan replikat sampel tidak diketahui
lainnya.
f. Siapkan kurva standar dengan memplot pengukuran pada 562nm. Gunakan kurva
standar untuk menentukan konsentrasi protein dari setiap sampel yang tidak diketahui.

3.10 Analisis Data

Analisis data menggunakan software IBM SPSS Statistics 24. Data yang
diperoleh dibagi menjadi dua kategori, yaitu data karakteristik dasar dan data
karakteristik klinis. Data karakteristik dasar meliputi jenis kelamin, usia, Indeks Massa
Tubuh, durasi diabetes melitus tipe 2, terapi diabetes melitus tipe 2, terapi tumor otak
primer, rutinitas olahraga, konsumsi alkohol, dan kebiasaan merokok. Data
karakteristik klinis berupa kadar insulin dan kadar mutan p53 jaringan otak.
Kemudian dilakukan uji normalitas data menggunakan uji Kolmogrov-
Smirnov. Selanjutnya dilakukan uji korelasi menggunakan uji Pearson untuk data
normal atau uji Spearman untuk data tidak normal sehingga dapat dilihat ada tidaknya
serta seberapa kuat hubungan antara kadar mutan p53 dengan kadar insulin pada
sampel. Hasil uji dianggap mempunyai hubungan signifikan apabila nilai p<0,05. Two
tail..?