ESTRADIOL

EIA/ELISA (Untuk Penelitian)

A. Tujuan
DRG Estradiol ELISA adalah enzim immunoassay untuk pengukuran diagnostik in
vitro kuantitatif Estradiol dalam serum dan plasma.

B. Metode
Metode yang digunakan ialah Competitive Elisa.

C. Prinsip
Kit ELISA DRG Estradiol adalah uji imunosorben terkait enzim fase padat
(ELISA), berdasarkan prinsip pengikatan kompetitif. Sumur mikrotiter dilapisi dengan
antibodi poliklonal [kelinci] yang diarahkan ke situs antigenik pada molekul Estradiol.
Estradiol endogen dari sampel pasien bersaing dengan konjugat peroksidase Estradiol-
horseradish untuk mengikat antibodi yang dilapisi. Setelah inkubasi, konjugat yang tidak
terikat dicuci. Jumlah konjugat peroksidase terikat berbanding terbalik dengan
konsentrasi Estradiol dalam sampel. Setelah penambahan larutan substrat, intensitas
warna yang dikembangkan berbanding terbalik dengan konsentrasi Estradiol dalam
sampel pasien.

D. Prosedur
1. Pra Analitik
a. Persiapan sampel
Jangan gunakan spesimen hemolitik, ikterik atau lipaemik. Harap dicatat:
Sampel yang mengandung natrium azida tidak boleh digunakan dalam pengujian.
1) Jenis sampel : Serum atau plasma EDTA, Heparin atau Sitrat
2) Pengolahan :
Spesimen: Kumpulkan darah dengan venipuncture, biarkan menggumpal, dan
pisahkan serum dengan sentrifugasi pada suhu kamar. Jangan melakukan
sentrifugasi sebelum pembekuan total terjadi. Pasien yang menerima terapi
antikoagulan mungkin memerlukan peningkatan waktu pembekuan.
 Plasma: Seluruh darah harus dikumpulkan ke dalam tabung centrifuge yang
mengandung anti koagulan EDTA, Heparin, atau Sitrat dan disentrifugasi
segera setelah pengumpulan.
3) Penyimpanan : Spesimen harus ditutup dan dapat disimpan hingga 5 hari pada
2°C - 8°C sebelum pengujian. Spesimen yang disimpan untuk waktu yang
lebih lama harus dibekukan hanya sekali pada -20°C sebelum pengujian.
Sampel yang dicairkan harus dibalik beberapa kali sebelum pengujian.
4) Pengenceran Spesimen : Jika dalam pengujian awal, spesimen ditemukan
mengandung lebih dari standar tertinggi, spesimen dapat diencerkan dengan
Standar 0 dan diuji kembali seperti yang dijelaskan dalam Prosedur Pengujian.
Untuk penghitungan konsentrasi, faktor pengenceran ini harus diperhitungkan.
Contoh:
a) Pengenceran 1:10 = 10 µL Serum + 90 µL Standar 0 (aduk rata)
b) Pengenceran 1:100 = (10 µL pengenceran a) 1:10) + 90 µL Standar 0 (aduk
rata)

b. Alat dan Bahan

1) Reagen yang disediakan
a) Microtiterwells, strip 12x8 (pecah terpisah), 96 sumur; Sumur dilapisi
dengan antibodi anti-Estradiol (poliklonal).
b) Standar (Standar 0-6), 7 botol, 1 mL, siap digunakan; Konsentrasi: 0,25;
100; 250; 500; 1000; 2000 pg/mL Konversi: 1 pg/mL = 3,67 pmol/L
mengandung 0,03% Proclin 300 + 0,005% gentamisin sulfat sebagai
pengawet.
c) Enzim Konjugasi, 1 vial, 25 mL, siap digunakan; Estradiol terkonjugasi
dengan horseradish peroxidase; * mengandung 0,03% Proclin 300, 0,015%
BND dan 0,010% MIT sebagai pengawet.
d) Larutan Substrat, 1 vial, 14 mL, siap digunakan; Tetramethylbenzidine
(TMB).
e) Stop Solution, 1 vial, 14 mL, siap digunakan; mengandung 0,5M H2 SO4.
Hindari kontak dengan larutan penghenti. Ini dapat menyebabkan iritasi
kulit dan luka bakar.
f) Larutan Pencuci, 1 botol, 30 mL (40X pekat).
2) Kondisi Penyimpanan
 a) Ketika disimpan pada suhu 2°C - 8°C reagen yang belum dibuka akan
mempertahankan reaktivitas hingga tanggal kedaluwarsa. Jangan gunakan
reagen melebihi tanggal ini.
b) Reagen yang dibuka harus disimpan pada 2°C - 8°C.
c) Sumur mikrotiter harus disimpan pada 2°C - 8°C. Setelah kantong foil
dibuka, harus berhati-hati untuk menutupnya kembali dengan rapat
3) Persiapan Reagen
a) Larutan Pencuci : Tambahkan air deionisasi ke Larutan Pencuci pekat
40X. Encerkan 30 mL Larutan Pencuci pekat dengan 1170 mL air
deionisasi hingga volume akhir 1200 mL.
b) stabilitas penyimpanan : Larutan Pencuci yang diencerkan stabil selama 2
minggu pada suhu kamar.
4) Alat : DRG Estradiol ELISA (EIA-2693).

2. Analitik
a. Amankan jumlah sumur Microtiter yang diinginkan di tempat bingkai.
b. Keluarkan 25 µL dari setiap Standar, Kontrol dan sampel dengan tip sekali pakai
baru ke dalam sumur yang sesuai.
c. Keluarkan 200 µL Enzim Konjugat ke dalam setiap sumur. Campur secara
menyeluruh selama 10 detik. Penting untuk memiliki pencampuran yang lengkap
pada langkah ini.
d. Inkubasi selama 120 menit pada suhu kamar (tanpa menutup piring).
e. Kocok cepat isi sumur. Bilas sumur 3 kali dengan Larutan Pencuci yang
diencerkan (400 µL per sumur). Pukul sumur dengan tajam di atas kertas penyerap
untuk menghilangkan sisa tetesan. Catatan penting: Sensitivitas dan presisi
pengujian ini sangat dipengaruhi oleh kinerja prosedur pencucian yang benar!
f. Tambahkan 100 µL Larutan Substrat ke setiap sumur.
g. Inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
h. Hentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 50 µL Stop Solution ke setiap
sumur.
i. Tentukan absorbansi (OD) setiap sumur pada 450 ± 10 nm dengan pembaca pelat
mikrotiter. Dianjurkan agar sumur dibaca dalam waktu 10 menit setelah
menambahkan Stop Solution
 3. Pasca Analitik
a. Hitung nilai absorbansi rata-rata untuk setiap set standar, kontrol dan sampel
pasien.
b. Buat kurva standar dengan memplotkan absorbansi rata-rata yang diperoleh dari
setiap standar terhadap konsentrasinya dengan nilai absorbansi pada sumbu
vertikal (Y) dan konsentrasi pada sumbu horizontal (X).
c. Dengan menggunakan nilai absorbansi rata-rata untuk setiap sampel, tentukan
konsentrasi yang sesuai dari kurva standar.
d. Metode otomatis: Hasil dalam IFU telah dihitung secara otomatis menggunakan 4
PL (4 Parameter Logistics) curve fit. 4 Parameter Logistics adalah metode yang
lebih disukai. Fungsi reduksi data lainnya mungkin memberikan hasil yang sedikit
berbeda.
e. Konsentrasi sampel dapat dibaca langsung dari kurva standar ini. Sampel dengan
konsentrasi yang lebih tinggi dari standar tertinggi harus diencerkan lebih lanjut.
Untuk perhitungan konsentrasi, faktor pengenceran ini harus diperhitungkan.

E. Nilai Normal
Sangat disarankan bahwa setiap laboratorium harus menentukan nilai normal dan
abnormal sendiri. Dalam sebuah penelitian yang dilakukan dengan orang dewasa yang
tampaknya normal dan sehat, menggunakan DRG Estradiol ELISA, nilai berikut diamati
dari populasi 5 - 95% Persentil
Laki-laki : 10 - 36 pg/mL
Perempuan : pra-menopause 13 - 191 pg/mL
pascamenopause 11 - 65 pg/mL

EIA/ELISA (Untuk Analisis Rutin)

A. Tujuan
untuk penentuan kuantitatif konsentrasi 17β-Estradiol dalam serum atau plasma
manusia.
B. Metode
Metode yang digunakan ialah kolorimetrik imunoenzimatik kompetitif.

C. Prinsip
 Dalam Estradiol ELISA Assay Kit, 17β-Estradiol (antigen) dalam sampel
bersaing dengan 17βEstradiol antigenik yang terkonjugasi dengan horseradish
peroxidase (HRP) untuk mengikat sejumlah antibodi anti 17β-Estradiol yang dilapisi
pada microplate (fase padat). Setelah inkubasi, pemisahan terikat/bebas dilakukan
dengan pencucian fase padat sederhana. Kemudian enzim HRP dalam fraksi terikat
bereaksi dengan Substrat (H2O2 ) dan Substrat TMB dan mengembangkan warna biru
yang berubah menjadi kuning ketika Stop Solution (H 2SO4) ditambahkan. Intensitas
warna berbanding terbalik dengan konsentrasi 17β-Estradiol dalam sampel. Konsentrasi
17β-Estradiol dalam sampel dihitung melalui kurva kalibrasi.

D. Prosedur
1. Pra Analitik
a. Persiapan sampel
1) Jenis sampel : Penentuan 17β-Estradiol dapat dilakukan dalam serum atau
plasma manusia.
2) Penyimpanan : Simpan sampel pada -20°C jika penentuan tidak dilakukan
pada hari yang sama dengan pengumpulan sampel. Hindari pembekuan dan
pencairan sampel yang berulang. Sebelum menggunakan, aduk perlahan,
selama 5 menit, dengan mixer berputar. Kontrol siap digunakan.

c. Persiapan Kalibrator (C0…C5)

Kalibrator siap digunakan dan memiliki konsentrasi 17βEstradiol sebagai berikut:
C0 C1 C2 C3 C4 C5
Pg/mL 0 20 120 300 600 2000

Kalibrator stabil hingga tanggal kedaluwarsa yang tercetak pada label. Setelah
dibuka, standar stabil enam bulan pada suhu 2-8°C.

d. Persiapan Konjugat
Konjugat siap digunakan. Aduk perlahan, selama 5 menit, dengan mixer yang
berputar. Setelah dibuka, stabil enam bulan pada 2÷8°C.

e. Persiapan Larutan Pencuci

 Encerkan isi botol "Conc. Wash Solution 10X" dengan air suling hingga volume
akhir 500 mL sebelum digunakan. Untuk volume yang lebih kecil, hormati rasio
pengenceran 1:10. Larutan pencuci yang diencerkan stabil selama 30 hari pada
suhu 2-8 ° C. Dalam larutan pencuci pekat dimungkinkan untuk mengamati
adanya kristal, dalam hal ini campurkan pada suhu kamar sampai kristal larut
sepenuhnya, untuk akurasi yang lebih besar encerkan seluruh botol larutan
pencuci pekat hingga 500 mL dengan hati-hati juga untuk mentransfer kristal,
kemudian campurkan sampai kristal benar-benar larut.
f. Alat
Alat yang digunakan ialah Estradiol Elisa.

4. Analitik
a. Yang Perlu Diperhatikan
1) Biarkan semua reagen mencapai suhu kamar (22-28°C).
2) Strip microwell berlapis yang tidak digunakan harus dilepaskan dengan aman
di kantong foil yang mengandung pengering dan disimpan pada 2-8 ° C
3) Untuk menghindari potensi kontaminasi mikroba dan/atau bahan kimia,
reagen yang tidak terpakai tidak boleh dipindahkan ke dalam botol aslinya.
4) Karena perlu melakukan penentuan dalam rangkap dua untuk meningkatkan
akurasi hasil pengujian, siapkan dua sumur untuk setiap titik kurva kalibrasi
(C0 - C5 ), dua untuk setiap Kontrol, dua untuk setiap sampel, satu untuk
Blank.
b. Prosedur
Karena perlu melakukan penentuan dalam rangkap dua untuk meningkatkan
akurasi hasil pengujian, siapkan dua sumur untuk setiap titik kurva kalibrasi (C 0 -
C5), dua untuk setiap Kontrol, dua untuk setiap sampel, satu untuk Blank.
Reagen Kalibrator Contoh/Kontrol Kosong
Kalibrator C0 – C5 25 L
Sampel/Kontrol 25 L
Konjugasi 200 L 200 L
Inkubasi 2 jam pada suhu ± 37C.
Keluarkan isi dari setiap sumur, cuci sumur tiga kali dengan 300 L larutan
pencuci yang diencerkan.
TMB Substrat 100 L 100 L 100 L
 Inkubasi pada suhu kamar (2228C) selama 30 m3nit dalam gelap
Stop Solution 100 L 100 L 100 L
Kocok perlahan plate mikro.
Baca absorbansi (E) pada 450 nm terhadap Blanko.

5. Pasca Analitik
a. Absorbansi Rata-rata : Hitung rata-rata absorbansi (Em) dari kalibrator (C 0 – C5)
dan setiap sampel.
b. Kurva Kalibrasi : Plot nilai rata-rata absorbansi (Em) dari kalibrator (C0 -C5 )
terhadap konsentrasi. Gambarkan kurva yang paling cocok melalui titik-titik yang
diplot (es: Logistik Empat Parameter).
c. Perhitungan Hasil : Interpolasi nilai sampel pada kurva kalibrasi untuk
mendapatkan nilai yang sesuai dari konsentrasi yang dinyatakan dalam pg/mL.

6. Nilai Normal
Nilai referensi 17β-Estradiol serum adalah:
pg/mL
Fase folikuler 30 – 100
Perempuan Puncak ovulasi 130 – 350
Fase luteinik 50 - 180
Menopause < 60
Anak – Anak < 40
Pria < 60

RIA
A. Tujuan

B. Metode

C. Prinsip
D. Prosedur
1. Pra Analitik
a. Persiapan sampel
1) jenis sampel

2) pengolahan

3) stabilitas

4) penyimpanan

b. Persiapan Alat dan Bahan

1) Bahan
a) sebutkan bahan komposisi klu ada

b) stabilitas penyimpanan

2) Alat (sebutkan nama alat yg digunakan)

2. Analitik

3. Pasca Analitik

E. Nilai Normal

NON ISOTOPIC IMMUNOASSAY

TIME RESOLVED FLUORESCENT IMMUNOASSAY

Kelebihan dan Kekurangan Setiap Metode