Nama : Andi Fhatima Khairunnisa

NIM : PO713203191007

Prodi : D III Tingkat 2

Mata Kuliah : Biologi Sel dan Molekuler

1) Jelaskan perbandingan antara Reverse Transciptase PCR, Real Time PCR, Nested PCR
dan Multiplex PCR dengan PCR konvensional atau PCR standar!

2) Jelaskan beberapa faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan pemeriksaan PCR!

Jawaban

1) Perbandingannya yaitu antara lain:

 Reverse Transciptase PCR

RT-PCR digunakan untuk mendapatkan kembali dan menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA,
menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT
PCR dapat dengan mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi, polimorfisme dan
mengukur kekuatan ekspresi gen.

 Real Time PCR

Maksud dari kata real time pada metode ini adalah data fuoresensi yang dihasilkan dari
proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada saat proses amplifikasi masih
berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus amplifikasi selesai.

 Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen

 Multiplex PCR

Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon (hasil amplifikasi PCR) dari berbagai ukuran yang spesifik untuk
sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat
 diperoleh dari running-tes tunggal yang tidak membutuhkan beberapa kali reagen dan
lebih banyak waktu untuk melakukan.

 PCR konvensional

PCR konvensional adalah PCR di mana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap
deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila
tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional biasanya
menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi bagian tertentu
dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu tabung.

2) Faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan pemeriksaan PCR!

1. Deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP)

Konsentrasi masing-masing dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara 20-200
µM dan keempat dNTP yang digunakan sebaiknya mempunyai konsentrasi yang sama
untuk memperkecil kemungkinan kesalahan penggabungan nukleotida selama proses
polimerisasi.

2. Oligonukleotida Primer

Konsentrasi primer yang optimal berkisar antara 0,1-0,5 µM. Panjang oligonukleotida
yang digunakan sebagai primer umumnya 18-28 nukleotida dan mempunyai kandungan G
+ C sebesar 50-60%. Sekuen oligonukleotida primer sebaiknya dicek apakah mempunyai
kemungkinan membentuk hibrid antara primer yang satu dengan primer yang lainnya.

3. Cetakan DNA

Cetakan DNA yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 -106molekul. Pada waktu
suhu inkubasi PCR mencapai 95oC, yang dimaksudkan untuk mendenaturasi DNA, sudah
cukup untuk merusak sel yang memungkinkan oligonukleotida primer menempel pada
cetakan DNA yang ada di dalam sel. DNA yang digunakan sebagai cetakan dapat berupa
rantai tunggal maupun rantai ganda.

4. Larutan Bufer

Bufer yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 10-50 mM Tris-HCl, pH 8,3-8,8
(pada suhu 20oC). Untuk membantu proses penempelan primer (primer annealing), dapat
juga ditambahkan KCl sampai konsentrasi 50 mM. Di atas konsentrasi ini, KCl justru
akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, perlu juga
ditambahkan 1,5 mM MgCl2. Komponen lain yang perlu ditambahkan adalah gelatin atau
BSA (Bovine serum albumin) sebanyak 0,1% (berat/ volume) dan deterjen non ionic
seperti misalnya Tween 20 sebanyak 0,05-0,1% untuk mempertahankan kestabilan enzim
Taq DNA polimerase.

5. Siklus Reaksi

Pada umumnya PCR dilakukan dengan mengulangi siklus reaksi pelipatgandaan

sebanyak 20-30 siklus. Akan tetapi, banyaknya siklus yang diperlukan tergantung
terutama pada konsentrasi awal molekul DNA target yang akan dilipatgandakan. Siklus
yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang tidak spesifik,
sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.

6. Enzim yang digunakan

Secara umum semua konsentrasi enzim yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah
2,5 unit/ reaksi. Seringkali penggunaan 1 unit enzim Taq DNA polymerase sudah
optimum untuk melakukan PCR dengan jumlah siklus reaksi 20-25 kali. Untuk siklus
yang lebih banyak, maka sebaiknya digunakan unit yang lebih besar pula, tetapi
sebaiknya tidak melebihi 2,5 unit karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan
menurunkan spesifisitasnya.

7. Pemisahan ruangan pada proses PCR

a. Ruang preparasi Reagen
Ruangan ini dikhususkan untuk pencampuran bahan-bahan untuk melakukan
reaksi PCR yaitu master mix, Primer dan kontrol
b. Ruang preparasi spesimen
Ruangan ini digunakan untuk persiapan spesimen dan pencampuran spesimen
dengan matser mix pada tabung PCR.
c. Ruang PCR dan Deteksi
Langkah terakhir dalam prosedur PCR berlangsung di Area 3. Di area ini ,
spesimen siap diamplifikasi dalam mesin PCR untuk menghasilkan produk
PCR (amplikon) , yang kemudian produk PCR tersebut akan PCR dideteksi.