Nama : Andi Fhatima Khairunnisa

NIM : PO713203191007

Prodi : D III Tingkat 2

Matkul : Imunoserologi

Tugas!

Menerjemahkan Video Prosedur Colona Cell-HY

Produk ColonaCell menyajikan metode yang efisien untuk memilih dan mengkloning
hibridoma setelah penggabungan/fusi antara sel B dan sel meiloma

Media semi-padat memungkinkan sel tunggal untuk tumbuh menjadi koloni terpisah yang
dapat diisolasi dengan mudah. Hal ini menjadikan kemungkinan monoklonalitas yang tinggi,
dengan meminimalkan kebutuhan untuk subklon. Koloni klonal terbentuk dan keduanya lambat,
koloni yang tumbuh cepat dapat diisolasi, kemungkinan untuk mendapatkan koloni langka,
berkualitas tinggi, dan unggul juga meningkat. Kit ClonaCell-HY mencakup semua komponen
dalam pembentukan antibodi monoklonal.

Bahan yang digunakan:

1. Media A untuk kultur sebelum fusi

2. Media B untuk fusi
3. Media C untuk pemulihan
4. Media D untuk seleksi dan kloning
5. Media E untuk setelah seleksi dan pertumbuhan kloning
6. Polyethylene Glycol (PEG) untuk tahap penggabungan/fusi

Prosedur detail bisa ditemukn di ClonalCell-HY (Kit Kloning Hibridoma teknik manual).

Langkah pertama yang dilakukan dalam video ini adalah persiapan sel mieloma, kedua
adalah persiapan Splenocytes, ketiga adalah fusi, keempat adalah seleksi dan kloning dan kelima
adalah harvesting.
1. Sel mieloma

Persiapan sel mieloma (kanker) dengan mencairkan sel mieloma dan kultur di Media A minimal
1 minggu sebelum melakukan penggabungan/fusi. Setidaknya harus ada paling sedikit 20 juta sel
mieloma untuk penggabungan. Memasukka ke dalam tabung 50 ml kemudian melakukan
sentrifugasi. Cuci sekitar 3 menit dengan Media B. Ambil supernatan dan masukkan dalam
tabung 25 ml pada Media B.

Melakukan perhitungan, dimana viabilitasnya harus lebih besar dari 95%. Hitunglah volume
yang dibutuhkan untuk 20 juta sel yang terus menerus tumbuh.

2. Sel limpa

Persiapan sel limpa: pisahkan limpa menjadi suspensi sel tunggal. Untuk memisahkan limpa,
tempatkan saringan di atas tabung dengan ukuran 50 ml. Terlebih dahulu, basahi saringan
dengan 5 ml media B dan letakkan limpa pada kasa. Melumatkan limpa menggunakan plunger
dari jarum suntik ukuran 3 ml. Bilas kasa dengan menyiram semua splenosit me>lalui jaringan
dan masukkan ke dalam tabung. Cuci splenosit sekitar 3 menit dengan Media B. Ambil
supernatan menggunakan pipet sambil menuangkannya dan masukkan dalam tabung 25 ml pada
media B.

Melakukan perhitungan, hitung volume yang dibutuhkan untuk 100 juta sel.

Sangatlah penting untuk mencuci sel mieloma dan sel limpa dengan serum Media B. Jika serum
tidak dihilangkan, Polietilena glikol (PEG) tidak akan menyatukan membran sel dan frekuensi
fusi akan turun drastis.

Persiapan mieoloma dan limpa dapat dilakukan dalam waktu yang bersamaan untuk memastikan
bahwa satu jenis sel tidak berada dalam waktu lama.

3. Fusion/penggabungan

PEG pada Media A, B, dan C dibutuhkan untuk penggabungan sel. Panaskan terlebih dahulu
pada suhu 37°C. Pastikan water bath dengan suhu 37°C siap untuk tahap penggabungan.

Tambahkan 20 juta sel mieloma dan 100 juta sel limpa ke dalam tabung berukuran 50 ml.
Melakukan sentrifugasi dan keluarkan supernatan, hal tersebut penting untuk menghilangkan
supernatan sepenuhnya untuk menghindari pengenceran PEG yang akan ditambahkan nanti.
Ketuk bagian bawah tabung untuk memecah pelet. Tambahkan 1 ml PEG tetes demi tetes
menggunakan 1 ml pipet serologis. PEG harus ditambahkan selama 1 menit tanpa diaduk.
Setelah itu aduk dengan pipet tip selama 1 menit. Tambahkan 4 ml media B selama 4 menit
sementara terus mengaduk. Perlahan tambahkan 10 ml Media B tambahan. Inkubasi selama 15
menit pada suhu 37°C dalam water bath. Perlahan tambahkan 30 ml Media A dan lakukan
sentrifugasi. Buang supernatan dan cuci dengan Media A untuk memastikan semua PEG telah
hilang. Perlahan ambil kembali pelet di Media C. Pindahkan ke labu T-75 yang berisi Media C.
Inkubasi selama 16-24 jam pada suhu 37°C dengan 5% karbon dioksida.

4. Seleksi dan Kloning

Seleksi dan kloning pada Media D yang setegah padat bisa dilakukan setelah menginkubasi
semalaman pada proses fusi. Siapkan media D dengan mencairkan lemari es semalaman. Hal
tersebut akan diperlukan setelah fusi. Kocok dengan kuat kurang lebih 15 menit untuk
pemanasan dan biarkan gelembungnya naik kemudian diamkan pada suhu kamar.

Pindahkan hasil penggabungan tersebut dari labu T-75 ke tabung, lakukan sentrifugasi,
mengangkat supernatan dan mengembalikan sebanyak 10 ml pada Media C (jangan melebihi 10
ml). Menggunakan media cair yang terlalu banyak atau terlalu sedikit akan mempengaruhi
viskositas pada Media D yang setengah padat dan pertumbuhan koloninya. Pindahkan 10 ml sel
dalam Medium C ke botol 90 ml pada Media D.

Homogenkan terlebih dahulu dan letakkan untuk mendiamkan botol sekitar 15 menit agar
gelembungnya naik ke atas. Secara aseptik, pindahkan 9,5 ml sel dalam Media D ke cawan petri
100 mm. Direkomendasikan menggunakan jarum suntik dengan ujung jarum yang tumpul
(jangan menggunakan pipet serologis untuk mengindari kehilangan media dan sel karena media
yang kental bisa saja tertinggal di dalam pipet).

Miringkan dan putar cawan petri untuk memastikan medianya tersebar rata. Taruh cawan petri
100 mm tadi di dalam cawan/piring ukuran besar dan tambakan cawan lain yang mengandung air
steril tanpa penutup untuk mencegah dehidrasi pada kultur dan tutup cawannya.

Inkubasi cawan petri tersebut selama 10-14 hari pada suhu 37°C dan 5% karbon dioksida.
5. Harvesting

Karena Media D ini setengah padat, maka setiap sel hibridoma tunggal yang bisa melalui seleksi
HAT dan terus tumbuh menjadi koloni diskrit yang bisa diisolasi secara terpisah.

Menyiapkan wadah 96 lubang dengan menambahkan 200 uL Media E ke dalam setiap lubang.

Memeriksa cawan petri 100 mm untuk melihat koloni yang terlihat dengan mata secara langsung.
Jangan memindahkan cawan secara tiba-tiba agar tidak mengganggu dan mengolesi koloni yang
cenderung mudah longgar.

Atur pipet menjadi 10 uL. Gunakan tip pipet steril untuk mengambil setiap koloni dan pindahkan
ke dalam wadah 96 lubang, gunakan tip pipet baru setiap mengambil koloni. Pipet isi wadah
tersebut beberapa kali untuk meresuspensi kembali koloni. Suspensi untuk sel tunggal tidak
diperlukan, tetapi menyebarkan koloni dengan pelan akan mendorong proses proliferasi sel.
Koloni dengan ukuran yang berbeda harus diseleksi. Koloni yang tumbuhnya lebih lambat
seringkali sangat bagus dalam memproduksi antibodi.

Menumbuhkan sel sekirar 4 hari dan skrining antibodi spesifik menggunakan tes skrining yang
sesuai.

ClonaCell juga tersedia untuk sel CHO yang ditransfeksi dan jalur sel lain.

Produk ColonaCell menyajikan metode yang efisien untuk memilih dan mengkloning hibridoma
setelah penggabungan/fusi antara sel B dan sel meiloma

Media semi-padat memungkinkan sel tunggal untuk tumbuh menjadi koloni terpisah yang dapat
diisolasi dengan mudah. Hal ini menjadikan kemungkinan monoklonalitas yang tinggi, dengan
meminimalkan kebutuhan untuk subklon. Koloni klonal terbentuk dan keduanya lambat, koloni
yang tumbuh cepat dapat diisolasi, kemungkinan untuk mendapatkan koloni langka, berkualitas
tinggi, dan unggul juga meningkat. Kit ClonaCell-HY mencakup semua komponen dalam
pembentukan antibodi monoklonal.
Bahan yang digunakan:

1. Media A untuk kultur sebelum fusi

2. Media B untuk fusi
3. Media C untuk pemulihan
4. Media D untuk seleksi dan kloning
5. Media E untuk setelah seleksi dan pertumbuhan kloning
6. Polyethylene Glycol (PEG) untuk tahap penggabungan/fusi

Prosedur detail bisa ditemukn di ClonalCell-HY (Kit Kloning Hibridoma teknik manual).

Langkah pertama yang dilakukan dalam video ini adalah persiapan sel mieloma, kedua adalah
persiapan Splenocytes, ketiga adalah fusi, keempat adalah seleksi dan kloning dan kelima adalah
harvesting.

1. Sel mieloma

Persiapan sel mieloma (kanker) dengan mencairkan sel mieloma dan kultur di Media A minimal
1 minggu sebelum melakukan penggabungan/fusi. Setidaknya harus ada paling sedikit 20 juta sel
mieloma untuk penggabungan. Memasukka ke dalam tabung 50 ml kemudian melakukan
sentrifugasi. Cuci sekitar 3 menit dengan Media B. Ambil supernatan dan masukkan dalam
tabung 25 ml pada Media B.

Melakukan perhitungan, dimana viabilitasnya harus lebih besar dari 95%. Hitunglah volume
yang dibutuhkan untuk 20 juta sel yang terus menerus tumbuh.

2. Sel limpa

Persiapan sel limpa: pisahkan limpa menjadi suspensi sel tunggal. Untuk memisahkan limpa,
tempatkan saringan di atas tabung dengan ukuran 50 ml. Terlebih dahulu, basahi saringan
dengan 5 ml media B dan letakkan limpa pada kasa. Melumatkan limpa menggunakan plunger
dari jarum suntik ukuran 3 ml. Bilas kasa dengan menyiram semua splenosit me>lalui jaringan
dan masukkan ke dalam tabung. Cuci splenosit sekitar 3 menit dengan Media B. Ambil
supernatan menggunakan pipet sambil menuangkannya dan masukkan dalam tabung 25 ml pada
media B.
Melakukan perhitungan, hitung volume yang dibutuhkan untuk 100 juta sel.

Sangatlah penting untuk mencuci sel mieloma dan sel limpa dengan serum Media B. Jika serum
tidak dihilangkan, Polietilena glikol (PEG) tidak akan menyatukan membran sel dan frekuensi
fusi akan turun drastis.

Persiapan mieoloma dan limpa dapat dilakukan dalam waktu yang bersamaan untuk memastikan
bahwa satu jenis sel tidak berada dalam waktu lama.

3. Fusion/penggabungan

PEG pada Media A, B, dan C dibutuhkan untuk penggabungan sel. Panaskan terlebih dahulu
pada suhu 37°C. Pastikan water bath dengan suhu 37°C siap untuk tahap penggabungan.

Tambahkan 20 juta sel mieloma dan 100 juta sel limpa ke dalam tabung berukuran 50 ml.

Melakukan sentrifugasi dan keluarkan supernatan, hal tersebut penting untuk menghilangkan
supernatan sepenuhnya untuk menghindari pengenceran PEG yang akan ditambahkan nanti.
Ketuk bagian bawah tabung untuk memecah pelet. Tambahkan 1 ml PEG tetes demi tetes
menggunakan 1 ml pipet serologis. PEG harus ditambahkan selama 1 menit tanpa diaduk.
Setelah itu aduk dengan pipet tip selama 1 menit. Tambahkan 4 ml media B selama 4 menit
sementara terus mengaduk. Perlahan tambahkan 10 ml Media B tambahan. Inkubasi selama 15
menit pada suhu 37°C dalam water bath. Perlahan tambahkan 30 ml Media A dan lakukan
sentrifugasi. Buang supernatan dan cuci dengan Media A untuk memastikan semua PEG telah
hilang. Perlahan ambil kembali pelet di Media C. Pindahkan ke labu T-75 yang berisi Media C.
Inkubasi selama 16-24 jam pada suhu 37°C dengan 5% karbon dioksida.

4. Seleksi dan Kloning

Seleksi dan kloning pada Media D yang setegah padat bisa dilakukan setelah menginkubasi
semalaman pada proses fusi. Siapkan media D dengan mencairkan lemari es semalaman. Hal
tersebut akan diperlukan setelah fusi. Kocok dengan kuat kurang lebih 15 menit untuk
pemanasan dan biarkan gelembungnya naik kemudian diamkan pada suhu kamar.

Pindahkan hasil penggabungan tersebut dari labu T-75 ke tabung, lakukan sentrifugasi,
mengangkat supernatan dan mengembalikan sebanyak 10 ml pada Media C (jangan melebihi 10
ml). Menggunakan media cair yang terlalu banyak atau terlalu sedikit akan mempengaruhi
viskositas pada Media D yang setengah padat dan pertumbuhan koloninya. Pindahkan 10 ml sel
dalam Medium C ke botol 90 ml pada Media D.

Homogenkan terlebih dahulu dan letakkan untuk mendiamkan botol sekitar 15 menit agar
gelembungnya naik ke atas. Secara aseptik, pindahkan 9,5 ml sel dalam Media D ke cawan petri
100 mm. Direkomendasikan menggunakan jarum suntik dengan ujung jarum yang tumpul
(jangan menggunakan pipet serologis untuk mengindari kehilangan media dan sel karena media
yang kental bisa saja tertinggal di dalam pipet).

Miringkan dan putar cawan petri untuk memastikan medianya tersebar rata. Taruh cawan petri
100 mm tadi di dalam cawan/piring ukuran besar dan tambakan cawan lain yang mengandung air
steril tanpa penutup untuk mencegah dehidrasi pada kultur dan tutup cawannya.

Inkubasi cawan petri tersebut selama 10-14 hari pada suhu 37°C dan 5% karbon dioksida.

5. Harvesting

Karena Media D ini setengah padat, maka setiap sel hibridoma tunggal yang bisa melalui seleksi
HAT dan terus tumbuh menjadi koloni diskrit yang bisa diisolasi secara terpisah.

Menyiapkan wadah 96 lubang dengan menambahkan 200 uL Media E ke dalam setiap lubang.

Memeriksa cawan petri 100 mm untuk melihat koloni yang terlihat dengan mata secara langsung.
Jangan memindahkan cawan secara tiba-tiba agar tidak mengganggu dan mengolesi koloni yang
cenderung mudah longgar.

Atur pipet menjadi 10 uL. Gunakan tip pipet steril untuk mengambil setiap koloni dan pindahkan
ke dalam wadah 96 lubang, gunakan tip pipet baru setiap mengambil koloni. Pipet isi wadah
tersebut beberapa kali untuk meresuspensi kembali koloni. Suspensi untuk sel tunggal tidak
diperlukan, tetapi menyebarkan koloni dengan pelan akan mendorong proses proliferasi sel.
Koloni dengan ukuran yang berbeda harus diseleksi. Koloni yang tumbuhnya lebih lambat
seringkali sangat bagus dalam memproduksi antibodi.

Menumbuhkan sel sekirar 4 hari dan skrining antibodi spesifik menggunakan tes skrining yang
sesuai.

ClonaCell juga tersedia untuk sel CHO yang ditransfeksi dan jalur sel lain.