Jurusan Biologi FMIPA UNP

Penuntun Praktikum Virtual Genetika II

Semester Juli-Desember 2021
Praktikum 6
Polymerase Chain Reaction (PCR)

6.1 Tujuan
1. Praktikan memahami prinsip kerja PCR
2. Praktikan mengetahui tujuan dan langkah kerja melakukan Gradient PCR

6.2 Prinsip Dasar

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode revolusioner yang dikembangkan oleh Kary Mullis
pada 1980-an untuk mengamplifikasi atau mengkopi segmen DNA. Prinsip kerja PCR didasarkan pada
kemampuan enzim DNA polimerase untuk mensintesis untai baru DNA yang merupakan
komplementer dari untai DNA cetakan. Enzim DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida
pada gugus 3'-OH yang sudah ada sebelumnya. Oleh karena itu, dalam proses PCR dibutuhkan primer
sebagai tempat bagi DNA polimerase untuk dapat menambahkan nukleotida pertama. Hal ini
memungkinkan kita untuk menentukan daerah spesifik (gen target) yang akan diamplifikasi atau
dikopi pada untai DNA cetakan. Daerah spesifik (gen target) yang dibatasi oleh primer ini akan
terakumulasi pada akhir reaksi PCR dalam jumlah jutaan kopi, yang disebut sebagai amplikon.

Gambar 6.1 Skema proses PCR

PCR terdiri atas tiga tahap yang berulang (Gambar 6.1), yaitu:

1. Denaturasi
Tujuan tahap ini adalah mengkonversi DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal.
2. Annealing
Pada tahap ini suhu diturunkan agar primer dapat menempel di daerah yang komplemen
pada DNA cetakan yang sudah menjadi untai tunggal. Setiap primer memiliki suhu
penempelan yang spesifik, bergantung pada urutan nukleotida yang menyusun primer
tersebut.
3. Elongasi atau ekstensi
Pada tahap ini enzim DNA polimerase akan mensintesis DNA untai baru atau pemanjangan
dari ujung 3’ primer yang telah menempel pada daerah komplemennya.

Tim Praktikum Genetika II Biologi FMIPA UNP 1

Komponen utama reaksi PCR terdiri dari DNA cetakan, enzim DNA polimerase, primer, dan
nukleotida.

1. DNA cetakan
DNA cetakan merupakan sampel DNA yang mengandung sekuen gen target. Sampel DNA
diperoleh dengan cara mengisolasi atau memurnikan DNA dari sampel biologis, seperti darah,
jaringan tumbuhan, jaringan hewan, feses, kultur sel, kultur mikroba, dan sebagainya.

2. Enzim DNA polimerase

DNA polimerase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk mensintesis untai DNA baru
yang berkomplemen dengan DNA cetakan. Enzim DNA polimerase yang pertama kali
ditemukan dan paling banyak digunakan adalah Taq DNA polymerase yang diisolasi dari
bakteri termofilik Thermis aquaticus. Selain itu, ada juga enzim Pfu DNA polymerase (dari
Pyrococcus furiosus) yang banyak digunakan karena memiliki tingkat akurasi yang tinggi
dalam mengkopi DNA. Meskipun kedua enzim ini agak berbeda, tetapi keduanya memilki
kemampuan yang menyebabkannya cocok untuk digunakan dalam PCR, yakni 1) dapat
mensintesis untai baru DNA menggunakan DNA cetakan dan primer, dan 2) tahan terhadap
suhu tinggi.

3. Primer
Primer merupakan potongan pendek DNA untai tunggal yang komplemen dengan urutan gen
target. Enzim DNA polimerase akan memulai sintesis DNA untai baru dari ujung 3’ primer.
Umumnya dalam reaksi PCR digunakan sepasang primer, yaitu primer forward dan primer
reverse. Desain primer yang baik akan memberikan hasil yang optimum pada reaksi PCR.
Oleh karena itu, saat mendesain primer perlu diperhatikan beberapa syarat berikut untuk
memperoleh primer yang ideal.

a. Panjang primer: 18-30 basa

b. Melting temperature (Tm): 52-58oC
c. % GC atau persentase kandungan basa G dan C dalam primer: 40-60%
d. Hindari pengulang basa G atau C ≥ 3 kali pada lima basa terakhir pada ujung 3’
e. Tidak ada struktur sekunder (hairpin, self dimer, pair dimer).

4. Nukleotida (dNTP atau deoxynucleoside triphosphate)

dNTP merupakan unit tunggal basa A, T, G, and C, yang menjadi “bahan baku” dalam
pembentukan DNA untai baru.

5. Buffer PCR
PCR dilakukan dalam buffer yang menyediakan lingkungan kimia yang sesuai untuk aktivitas
DNA polimerase. pH buffer biasanya antara 8,0 dan 9,5 dan sering distabilkan oleh Tris-HCl.
Untuk Taq DNA polimerase, komponen umum dalam buffer adalah ion kalium (K +) dari KCl,
yang mendorong penempelan primer. Selain itu, dalam buffer PCR terkadang juga
mengandung MgCl2.

Ada berbagai jenis teknik PCR yang telah dikembangkan hingga saat ini. Beberapa diantaranya adalah
PCR-RFLP, Real-time PCR, Quantitative real-time PCR, Reverse Transcriptase PCR, Multiplex PCR,
Nested PCR, Asymmetric PCR, Touch down PCR, Methylation-specific PCR, Allele-specific PCR,
Tetraprimer-ARMS PCR, dan lain-lain.

Berikut ini adalah beberapa aplikasi teknik PCR dalam dunia kedokteran:
1. PCR digunakan dalam menganalisis spesimen klinis untuk mendeteksi adanya agen infeksi,
termasuk virus corona, HIV, hepatitis, malaria, anthrax , dan sebagainya.
2. PCR dapat memberikan informasi tentang prognosis pasien dan memprediksi respon atau
resistensi terhadap terapi . Misalnya suatu kanker yang ditandai dengan mutasi kecil di gen
tertentu.
 3. PCR digunakan dalam analisis mutasi yang terjadi pada penyakit genetik (misalnya cystic
fibrosis, anemia sel sabit, fenilketonuria, distrofi otot).
4. PCR juga digunakan dalam laboratorium forensik karena PCR hanya membutuhkan materi
DNA dalam jumlah sedikit. Misalnya, DNA yang cukup dapat diperoleh dari tetesan darah
atau sehelai rambut.

6.3 Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Thermal Cycler (mesin PCR) 1. Sampel DNA
2. Mikropipet berbagai ukuran 2. PCR master mix (DNA polimerase, dNTPs,
3. Spin downer buffer PCR)
4. Vortex 3. Primer forward
5. Wadah limbah 4. Primer reverse
5. Nuclease-free water
6. Tabung PCR
7. Tips berbagai ukuran
8. Es/ Iced-block

6.4 Prosedur Kerja

 Untuk lebih memahami prinsip kerja PCR, silahkan disimak video PCR dengan Aplikasi Virtual
Lab pada link https://youtu.be/QWKphyZNjD0?list=PLge2ou1FIv08viPJSl_nEeQRfbH7BmDbj
(aplikasi virtual lab untuk PCR pada situs https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
untuk sementara tidak dapat digunakan).
 Dosen/asisten praktikum menjelaskan dan memperagakan prosedur kerja secara umum kepada
praktikan melalui video tutorial yang sudah diunggah ke elearning2.unp.ac.id atau di kanal
youtube “Praktikum Virtual Genetika II Biologi FMIPA UNP” dengan link videonya adalah sebagai
berikut: https://youtu.be/zjNIQSbDGjQ?list=PLge2ou1FIv08viPJSl_nEeQRfbH7BmDbj
 Praktikan membaca penuntun praktikum virtual dan menonton video tutorial agar dapat
memahami prosedur kerjanya.

6.5 Gradient PCR

Gradient PCR pada dasarnya dilakukan untuk mengetahui suhu annealing yang optimum saat
menggunakan pasangan primer yang baru. Jika kita mendesain primer baru untuk suatu eksperimen,
maka kita harus melakukan optimasi sebelum melakukan eksperimen yang sebenarnya, karena suhu
annealing setiap primer bersifat spesifik bergantung pada urutan nukleotida pimer dan gen target
yang akan diamplifikasi.

Gambar 6.2 Contoh variasi suhu annealing pada gradient PCR

Untuk melakukan gradient PCR, thermalcycler yang digunakan harus memiliki spesifikasi gradient PCR.
Thermal cycler dengan spesifikasi gradient PCR memiliki pengaturan suhu annealing yang bertingkat,
baik dalam satu baris ataupun satu kolom (bergantung pada merek thermal cycler). Jumlah variasi
suhu annealing tiap thermal cycler pun belum tentu sama, berkisar antara 6-12 variasi suhu. Seperti
contoh pada Gambar 6.2 terdapat 6 variasi suhu.

Berikut adalah prosedur kerja dalam melakukan gradient PCR.

1. Nyalakan thermocycler.
2. Dalam meracik sampel untuk PCR harus dilakukan pada kondisi suhu 4oC (bahan-bahan
disimpan di dalam es) dan memakai gloves.
3. Siapkan tabung PCR, lalu beri label.
4. Campurkan bahan-bahan PCR sesuai komposisi dan urutan di bawah ini:
No. Komponen PCR Konsentrasi Konsentrasi Volume x Jumlah Mix
Awal Akhir (μL)* Reaksi** PCR
1. PCR Master Mix 2x 1x 5 x9 45
(mengandung enzim DNA
polimerase, dNTPs dan
buffer PCR)
2. Primer Forward 10 µM 0,4 µM 0,4 x9 3,6
3. Primer Reverse 10 µM 0,4 µM 0,4 x9 3,6
4. Nuclease-free water - - 3,2 x9 28,8
(untuk mencukupkan
reaksi menjadi 10 μL)
5. Sampel DNA 100 ng/μL ≤ 250 ng 1 x9 9
Volume Akhir 10 Total mix: 90
* Volume dihitung menggunakan rumus pengenceran V1.M1 = V2.M2 dengan V2 = 10 μL.
**Jumlah reaksi adalah jumlah variasi suhu annealing, lalu ditambah 10% dari variasi suhu.
Contoh: jika variasi suhu ada 8 maka jumlah reaksi = 8 + 0,8 = 8,8 ≈ 9
5. Vortex mix PCR selama 3 detik untuk mencampurkan semua komponen, lalu spin down.
6. Bagi mix PCR ke dalam 8 buah tabung PCR dengan volume @ 10 μL.
7. Pastikan tidak ada gelembung udara di dalam tabung PCR dengan cara spin down.
8. Atur kondisi suhu dan siklus PCR (program PCR) pada thermal cycler sesuai tabel di bawah ini:
No. Tahap PCR Suhu (oC) Durasi Siklus
1. Denaturasi awal 95 3 menit
2. Denaturasi lanjut 95 15 detik
3. Annealing ***Gradient 62-52 atau 57 ± 5oC 15 detik 35 kali
4. Elongasi 72 10 detik
5. Elongasi Akhir 72 5 menit
***Diketahui bahwa Tm (melting temperature) primer forward = 57,2OC dan Tm primer reverse
57,8oC. Nilai Tm primer ini digunakan sebagai dasar untuk menentukan suhu gradien annealing.
9. Masukkan tabung PCR berisi sampel ke sumur-sumur thermal cycler (mesin PCR)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H

10. RUN
11. Hasil PCR dapat dianalisis langsung dengan elektroforesis pada gel agarose 1,5% atau simpan
pada freezer suhu -20oC .
6.6 Studi Kasus
Kalian baru saja memesan beberapa pasang primer untuk PCR. Kalian diminta untuk menentukan
suhu annealing yang optimum untuk setiap pasangan primer. Berdasarkan data sheet primer berikut
ini, buatlah rencana kerja gradient PCR mulai dari komposisi setiap komponen reaksi PCR hingga
pengaturan suhu dan siklus pada thermal cycler!

Petunjuk: thermal cycler yang digunakan memiliki fitur untuk variasi 8 suhu.

No. Gen Target Primer Forward Primer Reverse

1 Gen

yhbV Shigella
sp.

2 Gen

InvA
Salmonella sp.

3 Gen

ND5 Rattus
rattus