Detoksifikasi ROS dan Sitokin Proinflamasi Ditautkan oleh

Pensinyalan p38 MAPK dalam Model Aktivasi Astrosit Dewasa

Adrian Nahirnyj1, Izhar Livne-Bar1, Xiaoxin Guo1, Jeremy M. Sivak1,2,3* 
1 Departemen Ilmu Visi, Toronto Barat Lembaga Penelitian, Jaringan Kesehatan Universitas, Toronto, Ontario,
Kanada, 2 Departemen Oftalmologi dan Ilmu Visi, Universitas Toronto, Toronto, Ontario, Kanada, 3 Departemen
Laboratorium Kedokteran dan Patobiologi, Universitas Toronto, Toronto, Ontario, Kanada 

Abstrak

Astrosit adalah sel glial yang paling melimpah dalam Nerve Fiber Layer (NFL) dan Optic
Nerve Head (ONH), dan beperan penting dalam mempertahankan detoksifikasi Retinal Ganglion
Cell (RGC) dan homeostasis. Astrosit dewasa relatif diam, tetapi dengan cepat menjalani saklar
fenotipik sebagai respons terhadap penghinaan, ditandai dengan peningkatan regulasi protein
filamen menengah, hilangnya buffer glutamat, sekresi sitokin pro-inflamasi, dan peningkatan
produksi antioksidan. Perubahan ini menghasilkan pengaruh positif dan negatif pada RGC.
Namun, mekanisme yang mengatur respons ini masih belum jelas, dan strategi farmakologis
untuk memodulasi aspek-aspek tertentu dari saklar ini belum dieksplorasi secara menyeluruh. Di
sini kami menggambarkan suatu sistem untuk kultur cepat astrosit dewasa dari retina tikus
dewasa yang tetap relatif diam, tetapi merespons dengan kuat ketika ditantang dengan kerusakan
oksidatif, tekanan patogenik utama yang terkait dengan cedera retina dalam. Ketika astrosit
primer terpapar spesies oksigen reaktif (ROS), kami secara konsisten mengamati perubahan
karakteristik pada penanda aktivasi, bersama dengan peningkatan ekspresi gen detoksifikasi, dan
sekresi sitokin proinflamasi. Model in vitro ini kemudian digunakan untuk layar kimia pilot
untuk menargetkan aspek-aspek spesifik dari saklar ini. Peningkatan aktivitas p38a dan b
Mitogen Activated Protein Kinases (MAPKs) diidentifikasi sebagai sinyal yang diperlukan untuk
mengatur ekspresi MnSOD, dan heme oxygenase 1 (HO-1), dengan konsekuensi perubahan pada
cedera yang dimediasi ROS. Selain itu, profiling sitokin multipleks mendeteksi sekresi IL-6,
MCP-1, dan MIP-2a p38 MAPK yang tergantung, yang merupakan sinyal proinflamasi baru-
baru ini terlibat dalam kerusakan retina bagian dalam. Data ini menyediakan mekanisme untuk
menghubungkan peningkatan stres oksidatif dengan pensinyalan proinflamasi oleh astrosit, dan
menetapkan uji ini sebagai model yang berguna untuk lebih jauh membedah faktor-faktor yang
mengatur sakelar reaktif.

Pengantar

Astrosit memainkan peran penting dalam mempertahankan neuron homeostasis di sistem

saraf pusat (SSP) melalui sekresi faktor trofik, daur ulang neurotransmitter, nutrisi dan oksigen
menyeimbangkan, dan memulung radikal bebas [1-4]. Menanggapi cedera atau stres, astrosit
menjalani saklar fenotipik, ditandai dengan; upregulasi protein filamen menengah, seperti glial
protein asam fibrillary (GFAP) dan vimentin, hilangnya glutamate fungsi penyangga, sekresi
sitokin proinflamasi, danpeningkatan produksi antioksidan [2,4,5]. Baik positif danpengaruh
negatif dari aktivasi ulang astrosit telah terlibatdalam berbagai proses neurodegenerative. Namun
demikian mekanisme intraseluler yang mengatur sakelar ini masih buruk dipahami karena,
sebagian, untuk kebutuhan model yang matang sel [6]. Akibatnya, strategi farmakologis untuk
memodulasi aspek selektif dari proses ini belum dieksplorasi secara menyeluruh.

Sebagai outpocketing embrionik dari otak depan, retina adalah a model umum untuk
kerusakan SSP, sebagian karena metabolismenya sensitivitas, dan paparan lingkungan.
Akumulasi kerusakan oksidatif telah terlibat sebagai stres patogen sentral terkait dengan
penyakit umum retina yang menua, seperti retinopati diabetik dan glaukoma [7-10]. Di mata
orang dewasa, astrosit bermigrasi keluar dari kepala saraf optik (ONH) ke dalam lapisan serat
saraf retina (NFL) oleh P9, dan menganggap diam fenotip dengan menyapih [11]. Seiring dengan
Möller radial astrositik glia, mereka dengan cepat mengaktifkan kembali setelah stres oksidatif
[4,12] dan telah diusulkan untuk menjaga jaringan retina bagian dalam homeostasis, dan
menghasilkan para-inflamasi yang merugikan respon [13-16]. Efek-efek ini dicapai melalui
peningkatan aktivitas antioksidan, dan sekresi proinflamasi sitokin yang mengaktifkan mikroglia
penduduk, meningkatkan vascular permeabilitas, dan menginduksi kerusakan langsung atau
perlindungan ke retina sel ganglion (RGCs) [4,14,17,18]. Namun demikian, hubungan
molekulnya antara stres oksidatif dan pensinyalan proinflamasi dalam hal ini sel belum
terbentuk.
 Disini kami menggambarkan sistem untuk isolasi dan budaya cepat astrosit matang dari
retina tikus dewasa yang tetap relative diam, tetapi dapat didorong untuk merespons dengan kuat
ketika ditantang dengan tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) yang dititrasi. Layar bahan kimia
pilot mengidentifikasi p38a dan b mitogen diaktifkan aktivitas protein kinase (MAPK) sebagai
sinyal kunci yang mengatur spesifik komponen sakelar ini. P38 MAPK adalah serin-treonin
kinase memediasi respons terhadap tekanan lingkungan di SSP. Penghambatan pensinyalan p38
dinilai terhadap ekspresi gen antioksidan, kematian sel yang diperantarai ROS, dan multipleks
profil faktor pertumbuhan kunci dan sitokin proinflamasi terlibat dalam kerusakan retina bagian
dalam. Data ini menyediakan mekanisme untuk menghubungkan peningkatan stres oksidatif
dengan proinflamasipensinyalan oleh astrosit, dan menetapkan uji ini sebagai model yang
berguna untuk faktor pembedahan lebih lanjut yang mengatur sakelar reaktif.

Material dan metode

Isolasi dan Kultur Astrosit Retina Dewasa Utama
Astrosit Retina dewasa dari Tikus Wistar dewasa diisolasi dan dikultur dengan
mengadaptasi protokol yang sudah canggih untuk kultur otak astrosit neonatal [19-22], dengan
modifikasi menggabungkan media dan metode yang kami gunakan untuk budaya dewasa astrosit
ONH manusia [17]. Secara singkat, tikus berusia 21-28 hari disapih dikorbankan oleh napas CO2
sesuai dengan protocol disetujui oleh komite perawatan dan penggunaan hewan Universitas
Jaringan Kesehatan. Mata dengan cepat diinti dan segera ditempatkan dalam es dingin MEM-
H17 ditambah dengan 5% janin janin serum, serum kuda 5% dan penisilin 1% / streptomisin.
Retina dibedah dan dicerna pada pengocok orbital selama 20 menit MEM-H17 bebas serum
ditambah dengan 1,5 mg / ml tripsin (Sigma, St. Louis, MO) dan 5 mg / ml DNase 1 (Roche).
Setelah mencuci, sel dipisahkan secara mekanis dengan triturasi, dan disentrifugasi untuk
memisahkan sel-sel yang layak dari puing-puing, sebelum menjadi diunggulkan ke piring budaya
jaringan polystyrene. Untuk meningkatkan perlekatan dan pertumbuhan astrosit primer selama
yang pertama 24 jam, sel dikultur dalam media pertumbuhan astrosit khusus (Lonza, Basel, CH),
yang kemudian diganti dengan menyelesaikan media MEM-H17. Sel-sel ditanam untuk
pertemuan (8-9 d) pada titik mana mereka ditempatkan pada pengocok orbital untuk 6 jam pada
110 rpm. Untuk kultur otak neonatal, guncangan orbital adalah digunakan untuk menghapus
oligodendrocytes dan mikroglia [20] dan kami menggunakan teknik yang sama untuk
mengisolasi kultur retina dewasa. Sel-sel yang dihasilkan dicirikan oleh morfologi dan
pewarnaan imunofluoresensi, seperti yang dijelaskan dalam hasil. Dalam semua Eksperimen
yang disajikan mengacu pada jumlah independen budaya dianalisis.

Pernyataan etika
Semua pekerjaan hewan dilakukan di bawah protokol yang disetujui oleh Komite
Perawatan Hewan dari Jaringan Kesehatan Universitas, di Jakarta sesuai dengan semua pedoman
nasional dan internasional yang relevan

Model Stres Oksidatif

Sel terpapar H2O2 atau paraquat (Sigma) di konsentrasi yang ditunjukkan dan untuk
waktu yang ditunjukkan. SB203580 (Selleckchem, Houston, TX) dibubarkan di DMSO dan
ditambahkan ke media kultur pada konsentrasi akhir yang ditunjukkan 1 jam sebelumnya
penerapan stres. Untuk analisis ROS, sel dengan lembut terlepas dengan TrypLE dan
dikumpulkan dalam suspensi, kemudian diinkubasi dengan DCF (5- (dan-6) -chloromethyl-
29,79-dichlorodihydrofluorescein diasetat, Invitrogen), dilarutkan dalam DMSO, dan
ditambahkan ke media kultur pada konsentrasi akhir 4 mM selama 45 menit, diikuti oleh
pencucian dan inkubasi selama 10 menit dalam media segar. Sel kematian diukur dengan
propidium iodida (PI) (Sigma), dilarutkan dalam H2O dan diencerkan ke larutan yang bekerja
dalam PBS 10 mg / ml. Sel-sel yang dikumpulkan dianalisis dengan menggunakan sitokometer
aliran FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) pada 530 nm (DCF), dan 670 nm
(PI). Semua percobaan FACS dilakukan dalam rangkap tiga, dengan >10.000 sel per sumur, dari
setidaknya tiga kultur independen.

Mikroskopi Imunofluoresensi
Sel dicuci, difiksasi dalam PFA 4% selama 15 menit, permeabilisasi dalam 0,1% Triton-
X 100 selama 20 menit, dan diblokir dengan 5% BSA untuk1 jam Sel diperiksa dengan antibodi
primer untuk: GFAP-cy3 (Sigma), Vimentin (Sigma), S100A (Cedarlane), Glutamine Synthetase
(GS) (Abcam), Pax-2 (Covance), CD68 (Biolegend), Brn-3 (Santa Cruz Biotechnology Inc.),
CD31 (BD Pharmingen).Antibodi primer diinkubasi O / N pada 4uC, diikuti olehantibodi Alexa
Fluor 488 nm atau 568 nm yang sesuai (Life Technologies, Burlington, ON), dan dipasang
dengan media anti-fade VectaShield dengan DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA). Pencitraan
dilakukan dengan TIE2 Nikon terbalik mikroskop. Untuk bagian jaringan, mata dibedah dari
orang dewasa Tikus Wistar dan difiksasi dalam 4% paraformaldehyde (PFA), dan
disetimbangkan dalam sukrosa 30% semalam, tertanam dalam OCT, dan disimpan pada 280uC
sampai sectioning. Cryosections dipasang Slide SuperfrostPlus (VWR, Radnor, PA), dan
disimpan pada 280uC. Untuk bagian pewarnaan imunofluoresensi dikeringkan di kamar suhu
(RT) dan diperbaiki dalam PFA 4% selama 10 menit, dan dibilas PBS-T. Pemblokiran dilakukan
dengan serum 5% dari antibodi 2u tuan rumah, dalam ruang yang dilembabkan selama 1 jam di
RT, diikuti oleh primer antibodi selama 0,1 jam di RT atau pada 4u semalam, dicuci, dan
diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam, RT, dipasang dan dicitrakan seperti di atas

Analisis RNA
Total RNA diisolasi dari sampel sel menggunakan TRIZOL reagen (Life Technologies), dan
diperlakukan dengan RQ1 DNase (Promega), sesuai instruksi pabrikan. cDNA adalah disintesis
menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase sesuai untuk instruksi pabrik (Life
Technologies). Meneruskan dan reverse primer dirancang menggunakan Primer3 0.4.0 (http: //
primer3.wi.mit.edu). Urutan primer disajikan pada Tabel 1.Satu ml dari setiap sampel cDNA
ditambahkan ke master mixmengandung air bebas RNase, Power SYBR Green (Diterapkan
Biosystems, Carlsbad, CA) dan campuran primer (final 200 nM, Sigma) dalam volume reaksi 10
ml. PCR waktu nyata dilakukan menggunakan sebuah Eppendorf Realplex2. Kurva leleh
dibangun di untuk memastikan pengikatan primer yang optimal dan efisiensi cDNA amplifikasi.
Kelimpahan relatif dari target mRNA ditentukan dari nilai Ct dan dinormalisasi dengan rata-rata
geometri gen housekeeping, TATA binding protein (TBP). Hasil dianalisis dengan ANOVA satu
arah menggunakan beberapa uji perbandingan Tukey.
Gambar 1. Budaya dan karakterisasi astrosit retina primer dewasa. A) Penampang kartun
menunjukkan lokasi terbatas astrosit di mata orang dewasa (garis merah). Gambar neon inset
sesuai dengan wilayah ONH yang diwarnai untuk GFAP (merah, panah), dengan garis putus-
putus menunjukkan situs detasemen. B) Disosiasi cepat dan kondisi kultur astrosit dewasa
selektif menghasilkan sel stellat, multi-diproses yang secara bertahap beralih ke morfologi
poligon. Sebagian kecil sel menampilkan karakteristik penampilan bipolar yang berbeda dari
Mu¨ller glia (panah). C) Sel-sel diwarnai secara positif untuk penanda astrosit GFAP, vimentin,
GS, Pax-2, dan S100A. D) Sel tidak ternoda untuk CD68, BRN3, atau CD31 (saluran hijau),
tetapi tetap positif untuk GFAP (gabungan saluran merah yang sesuai di bawah setiap panel). Inti
diwarnai dengan DAPI (biru). (Skala bar = 50 mM, NFL; lapisan serat saraf, GCL; lapisan sel
ganglion, INL; lapisan inti nuklir, ONL; lapisan nuklir luar). doi: 10.1371 /
journal.pone.0083049.g001
Gambar 2. Paparan ROS pada astrosit dewasa primer menginduksi dosis kuat dan kematian sel
tergantung waktu dan detoksifikasi tanggapan. A) Paparan astrosit primer terhadap peningkatan
konsentrasi mM hasil PQ dalam dosis dan waktu tergantung ROS (fluoresensi DCF) lebih dari
24 dan 48 jam, yang diukur dengan flow cytometry. Hasil ini dapat dibandingkan dengan
paparan akut 0,5 mM H2O2, yang menghasilkan lonjakan tajam dalam pembentukan peroksida
sebanyak satu jam (n = 3, batang mewakili S.E., * p, 0,05). B) Dosis dan peningkatan tergantung
waktu dalam kematian sel (sinyal PI), pada 24 dan 48 jam, setelah paparan peningkatan
konsentrasi mM PQ. ETOH digunakan sebagai kontrol positif untuk kematian sel setelah 1 jam
(n = 3, bar mewakili S.E.). C – F) Waktu proses hasil RT-qPCR dari sel yang terpapar 1 mM PQ
menunjukkan peningkatan signifikan dalam ekspresi MnSOD, katalase, HO-1, dan GPX1 oleh
delapan jam (n = 4, * p, 0,05 pada puncak / palung, bar mewakili S.E.). doi: 10.1371 /
journal.pone.0083049.g002

Gambar 3. Stres oksidatif memediasi induksi kuat aktivasi dan penanda stres pada astrosit retina
dewasa. A) Perwakilanbercak barat dari sel yang terpapar 0,3 dan 1,0 mM PQ, dan kontrol,
selama 24 jam. Peningkatan ketergantungan dosis diamati untuk GFAP, HSP70, PGC1a, dan ada
penurunan dramatis dalam GS, dibandingkan dengan kontrol pemuatan GAPDH. B) Sesuai
kuantifikasi percobaan berulang seperti pada (A) menunjukkan respons konsisten untuk setiap
protein yang diperiksa dari kultur segar (n $ 6 kultur independen, * p, 0,05, batang mewakili
S.E.). doi: 10.1371 / journal.pone.0083049.g003

Analisis Protein
Untuk bercak barat, sel dipanen dalam TrypLE (Invitrogen) dan dicuci di PBS, sebelum
dilisiskan dalam buffer RIPA (Cell Signaling), ditambah dengan Protease Mini Lengkap Bebas
EDTA inhibitor (Roche), dan PhosSTOP phosphatase inhibitor (Roche). Total protein diukur dan
konsentrasi yang sama diserahkan ke SDS-PAGE dengan metode standar. Protein adalah
dipindahkan ke membran PVDF dan diperiksa dengan peningkatan antibody terhadap GFAP
(Sigma), HSP70 (Santa Cruz), PGC-1a (Novus), GS (Abcam), ph-p38 dan pan p38 MAPK (Cell
Signaling), dan GAPDH (Calbiochem), dan terdeteksi dengan IRDye yang sesuai antibodi
sekunder (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Bercak itu dicitrakan dan dianalisis intensitasnya
dengan inframerah Odyssey sistem pencitraan (Li-Cor Biosciences), dengan masing-masing
band sedang dinormalisasi ke kontrol pemuatan GAPDH. Hasil dianalisis oleh ANOVA satu
arah menggunakan uji perbandingan berganda Dunnet. Analisis sitokin multipleks dari media
kultur dilakukan oleh teknologi manik, yang membandingkan nilai yang diukur untuk masing-
masing sampel ke kurva standar untuk setiap analayte (Teknologi EVE, Calgary, AB). Kit
ELISA untuk BDNF dipasok oleh Millipore.Secara singkat; media yang dikondisikan
ditambahkan ke 96 pelat dengan baik pra-dilapisi dengan antibodi monoklonal BDNF tikus anti-
manusia / tikus. Terikat BDNF kemudian diinkubasi dalam konjugasi biotin spesifik BDNF
antibodi, diikuti oleh enzim streptavidin, substrat, dan stop larutan. Piring dibaca pada 450 nm.
Kurva standar adalah dihasilkan, membangun hubungan antara kepadatan optik danKonsentrasi
BDNF, yang memungkinkan untuk kuantifikasi akurat sampel konsentrasi BDNF. Hasil
dianalisis dengan satu arah ANOVA menggunakan beberapa uji perbandingan Tukey.
Hasil

Kultur dan Karakterisasi Astrosit Retina Dewasa

Astrosit dewasa diisolasi dan dikultur seperti dijelaskan dari menyapih retina tikus, dan
ditandai oleh morfologi dan pewarnaan imunofluoresensi untuk panel penanda astrositik dan tipe
sel yang berpotensi mencemari. Dalam kondisi yang dioptimalkan, kultur secara konsisten $ 98%
positif untuk astrosit protein GFAP, Vimentin, GS, Pax-2, dan S100A, seperti yang kita miliki
sebelumnya dilaporkan sebagai penanda astrosit ONH manusia [17] (Gambar 1C). Kultur negatif
untuk penanda microglial CD68, pembuat RGC BRN3, dan penanda sel endotel vascular CD-31
(Gambar 1D). Sel-sel menunjukkan proses stellate yang secara bertahap beralih untuk morfologi
poligonal khas budaya astrosit monolayer (Gambar 1B). Namun, dalam setiap budaya kami
mengamati sejumlah kecil sel-sel bipolar yang berbeda dengan penampilan Mu¨ller glia (Gambar
1B). Sel muller adalah glia khusus dengan astrositik sifat yang merentang lapisan neuroretinal
dan mempertahankan radial morfologi [23]. Sel Mu¨ller dewasa biasanya negatif untuk banyak
penanda astrosit, tetapi dapat menginduksi ekspresi mereka ketika diaktifkan, dan sebaliknya
visa [23-27]. Namun, sepengetahuan kami,
Gambar 4. Stres oksidatif menginduksi respons astrosit dependen p38 MAPK. A) Western
blotting menunjukkan peningkatan fosforilasi p38 MAPK diinduksi oleh peningkatan
konsentrasi PQ pada 6 dan 24 jam. B) Aplikasi 15 mM SB selama 24 jam diblokir stres oksidatif
diinduksi kehilangan GS, tetapi memiliki sedikit efek pada induksi GFAP. (C – D) Paparan
terhadap peningkatan konsentrasi SB di hadapan tantangan oksidatif secara signifikan
meningkatkan (C) kematian sel, dan (D) ROS, dalam dosis yang tergantung (n = 3 kultur, * p,
0,05 dibandingkan dengan PQ saja, bar mewakili S.E.). doi: 10.1371 /
journal.pone.0083049.g004

Pax-2 hanya terdeteksi pada astrosit dan bukan Mu¨ller glia mata tikus [11,28,29]. Kami
mengkonfirmasi bahwa Pax-2 nuklir immunoreactivity hadir di NFL yang co-localized dengan
GFAP mengandung sel, tetapi tidak ada dalam nuklir bagian dalam lapisan, atau kompartemen
retina lainnya (Gambar S1). Saat ternoda dengan antibodi yang sama kultur utama kami sangat
Pax-2 positif di hampir semua sel, terlepas dari morfologi (Gambar 1C). Hasil ini meningkatkan
kepercayaan diri kita bahwa budaya dewasa kita sangat diperkaya dalam astrosit NFL. Namun,
karena hati-hati persentase sel yang menunjukkan morfologi mirip Muckler di budaya primer
dinilai oleh dua pengamat dari ulangan gambar tiga budaya independen. Rata-rata 5% (62.1)
miliki Morfologi seperti mu¨ller, 87% (63,9) adalah astrositik, dan 8% (65,9) dinilai tidak jelas.
Karena itu, populasi ini tampaknya menjadi budaya astrositik matang yang sangat diperkaya
Astrosit NFL dan ONH.

Stres Oksidatif Menginduksi Sensitif dan Kuat Reaktif Respon dalam Astrosit yang Baru
Dibudidayakan
Untuk menghasilkan stres oksidatif, astrosit terpapar akut kerusakan oleh H2O2, atau
senyawa bersepeda redoks, paraquat (PQ). PQ adalah herbisida umum yang meregenerasi dirinya
sendiri produksi radikal superoksida, menghasilkan neurotoksik kronis kerusakan. PQ telah
menjadi alat yang mapan untuk menghasilkan a tingkat stres oksidatif yang konsisten secara in
vitro [30,31]. Keuntungan darimetode ini adalah penerapan stres yang lebih lambat dan lebih
sensitive. Dari H2O2 untuk percobaan awal meningkatkan konsentrasiPQ diuji menggunakan
flow cytometry untuk mengidentifikasi paparan itu menghasilkan peningkatan ROS dan
kematian sel selanjutnya yang terukur, tetapi tidak segera sitotoksik. Konsentrasi 0,3, 1,0, dan
3,0 mM PQ menghasilkan peningkatan ROS tergantung dosis lebih dari 24 jam yang diperburuk
pada 48 jam. Sebaliknya, 500 mM H2O2 menghasilkan peningkatan tajam dalam ROS selama 1
jam (Gambar 2A). Konsentrasi PQ yang sama menginduksi peningkatan ketergantungan dosis
yang sesuai pada kematian sel (Gambar 2B). Pada kasus ini 70% ETOH digunakan sebagai
kontrol positif untuk kematian sel. Berdasarkan data ini, konsentrasi PQ 0,3 dan 1,0 mM
digunakan untuk percobaan lebih lanjut.
Untuk mengatasi respons molekuler kultur sel terhadap ROS, a serangkaian gen stres dan
detoksifikasi dinilai secara kuantitatif RT-PCR real-time (RT-qPCR) selama kursus 24 jam
berikut paparan 1,0 mM PQ. Peningkatan yang signifikan adalah diamati untuk gen detoksifikasi
heme oksigenase (HO-1), katalase, dan mangan superoksida dismutase (MnSOD) (Gambar 2C –
E), dan penurunan untuk glutathione peroksidase (GPX1) (Gambar 2F). Berdasarkan hasil ini,
waktu delapan jam titik dipilih untuk penilaian dalam percobaan RT-qPCR lebih lanjut.
Untuk menilai respon biokimia sel di bawah inikondisi, serangkaian noda barat diperiksa
untuk didirikan tanda reaktivitas glial dan stres oksidatif dan metabolisme. Di sel yang baru
dikultur (tiga bagian atau kurang), konsentrasi GFAP, protein heat shock HSP70, dan
metabolisme dan
Gambar 5. p38 MAPK memodulasi ekspresi stres spesifik dan gen detoksifikasi. RT-qPCR
cDNAs dari sel yang terpapar stres oksidatif (1 mM PQ), ada atau tidaknya SB. Inhibisi aktivitas
p38 MAPK dengan 15 mM SB (A) memblokir peningkatan ekspresi MnSOD dan (B) ekspresi
HO-1 jengkel. Tidak ada p38 yang signifikan perubahan dependen diamati untuk Gpx1 atau
katalase (* p, 0,05 dibandingkan dengan kontrol, ** p, 0,05 dibandingkan dengan PQ, n = 4,
mewakili bar S.E.). doi: 10.1371 / journal.pone.0083049.g005

regulator stres oksidatif PGC-1α (proliferasi peroksisom diaktifkan reseptor γ co-aktivator-1α),

meningkat secara progresif di Menanggapi 0,3 dan 1,0 mM PQ selama 24 jam. Sebaliknya,
tingkat enzim daur ulang glutamat kunci, glutamin sintetase (GS), secara dramatis menurun
(Gambar 3A-B). Peningkatan GFAP dan penurunan GS dianggap sebagai ciri khas reaktivitas
astrosit [32,33], tetapi seringkali sulit untuk bereproduksi secara in vitro. Meningkat di HSP70
dan PGC-1α sebelumnya telah dicatat dalam astrosit di respon terhadap stres oksidatif [21,34].
Sebagai perbandingan, disubkultur Sel-sel (lewat ≥ empat kali) sering menunjukkan berkurang,
atau tidak ada tanggapan; tidak ada peningkatan GFAP, atau PGC-1α terdeteksi, GS tidak hadir
dalam sel yang tidak diobati, dan konsentrasi basal HSP70 meningkat (Gambar S2). Karena
alasan ini, semua berikutnya Eksperimen menggunakan sel secara konservatif yang dilewati ≤ 3

Aktivasi Astrosit Dipicu oleh Stres Oksidatif

Tergantung p38 Pensinyalan MAPK Karena stres oksidatif menginduksi respons kuat seperti itu,
kami menggunakan model ini untuk mulai membedah kaskade regulasi yang terlibat. Di dalam
hal ini, PQ yang diinduksi stres oksidatif membentuk pengujian yang menarik untuk penyaringan
farmakologis, karena cepat, kuantitatif, dan terukur. Juga, baik tingkat stres (ROS), dan hasil (sel
kematian), dapat diukur secara bersamaan. Dengan cara ini, kita melakukan layar pilot dengan
panel penghambat molekul kecil mengukur perubahan pada kematian sel dan ROS. Senyawa
SB203580 (SB) adalah inhibitor kuat dan spesifik p38 α dan β
Isoform MAPK [35]. P38 MAPK fosforilasi meningkat pesat dikonfirmasi setelah paparan ROS
setelah 6 dan 24 jam (Gambar 4A). Penambahan 15 µM SB memblokir hilangnya GS yang
diinduksi PQ, tetapi memiliki efek kecil pada induksi GFAP (Gambar 4B). Peningkatan
konsentrasi SB dalam kombinasi dengan stres oksidatif menghasilkan peningkatan dosis
tergantung pada ROS dan kematian sel (Gambar 4C-D). Aplikasi SB sendiri tidak memiliki efek
(Gambar 4C – D).

Untuk menentukan mekanisme yang mendasari efek ini pada ROS, pengaruh
penghambatan p38 α dan β MAPK pada ekspresi ekspresi gen antioksidan dievaluasi oleh RT-
qPCR. Berdasarkan program waktu sebelumnya (Gambar 2), titik delapan jam dipilih untuk
analisis cDNA dari sel yang terpapar PQ, SB, PQ + SB, atau kontrol. Penerapan 15 µM SB
secara signifikan memblokir peningkatan stres oksidatif MnSOD, dan meningkatkan peningkatan
HO-1 (Gambar 5A-B). Tidak ada perubahan yang diamati antara kontrol dan pengobatan SB
saja, menunjukkan efek yang diamati adalah reaksi spesifik terhadap penerapan stres oksidatif.
Ada sedikit atau tidak ada efek SB pada GPX1 atau ekspresi katalase (Gambar 5C-D)..

Gambar 6. p38 MAPK mengatur sekresi sitokin proinflamasi spesifik. Media terkondisikan
dikumpulkan dari kontrol utama astrosit, dan dari sel yang diobati dengan 1 mM PQ, 15 mM SB,
dan PQ + SB selama 24 jam. Peningkatan signifikan diamati untuk A) IL-6, B) MCP-1, dan C)
MIP-2, yang diblokir oleh penghambatan MAPK p38 (n = 6, * p< 0,05 dibandingkan dengan
kontrol, ** p<0,05 dibandingkan untuk PQ saja, bar mewakili SE). doi: 10.1371 /
journal.pone.0083049.g006
Identifikasi Sitokin Mengidentifikasi p38 MAPK Mediated Sekresi IL-6, MIP-2, dan
MCP-1
Media terkondisi astrosit dianalisis dengan profil sitokin multipleks untuk menentukan
efek stres oksidatif dan pensinyalan MAPK p38 pada faktor-faktor kunci yang disekresikan yang
mungkin memberi sinyal ke sel-sel neuron, mikroglia, vaskular, dan sel inflamasi di sekitarnya.
Astrosit yang baru saja diisolasi mengalami PQ, SB, PQ + SB, dan kondisi kontrol, selama 24
jam, seperti dijelaskan di atas. Media terkondisikan dikumpulkan dan diserahkan ke analisis
multipleks dan ELISA untuk panel 29 sitokin kunci dan faktor pertumbuhan (Tabel 2). Dari
analit, 12 berada di bawah level kuantisasi (umumnya 1 pg / ml), dan 8 lainnya menunjukkan
tidak ada perubahan signifikan dalam respons terhadap stres oksidatif, termasuk IL-1b, TNFa,
dan TGFb. Konsentrasi GRO / KC, IL-18, MIP-1a, VEGF, dan IL-10 secara signifikan
meningkat oleh stres oksidatif, tetapi perubahan ini tidak tergantung pAP MAPK (Tabel 2).
Hanya sitokin proinflamasi IL-6, MIP-2, dan MCP-1, yang menunjukkan peningkatan
ketergantungan MAPK p38 yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol dan stres
oksidatif (Gambar 6).

Diskusi
Respon glial sensitif telah dikaitkan dengan efek positif dan negatif pada SSP, terutama
retina dalam dan ONH. Namun, mekanisme yang mengatur tanggapan ini masih belum jelas, dan
metode farmakologis untuk menargetkan secara selektif relatif belum diselidiki. Perubahan
dalam ekspresi GFAP baru-baru ini dikaitkan dengan NFkB dan pensinyalan STAT [36], serta
aktivasi faktor transkripsi homeodomain LIM, Lhx2 [37]. Di sini kami menggambarkan suatu
sistem untuk isolasi cepat dan konsisten dari astrosit dewasa dari retina tikus dewasa, yang dapat
diinduksi untuk merespon dengan kuat terhadap stres oksidatif dengan p38 yang bergantung pada
MAPK.

Model Reaktivitas Astrosit Dewasa

Secara kritis, sel-sel ini tampaknya mempertahankan fenotip diam untuk tiga minggu
pertama kultur, tetapi selama periode ini mampu respon kuat terhadap tingkat tekanan oksidatif
yang dititrasi, termasuk perubahan karakteristik pada penanda yang terkait dengan aktivasi,
seperti peningkatan GFAP, HSP70 , dan PGC-1a, dan kehilangan dramatis dari GS, serta
peningkatan ekspresi gen detoksifikasi ROS, dan sekresi sitokin. Hilangnya GS adalah penanda
umum reaktivitas astrosit, dan menghasilkan kapasitas buffer glutamat berkurang yang
menghasilkan stres neurotoksik [33,38-40], tetapi sulit untuk mereproduksi in vitro. Menariknya,
GS telah dilaporkan meningkat dalam sel Muller teraktivasi [25,26]. Hilangnya spesifik GS
dalam astrosit NFL dan ONH bisa memiliki efek toksik lokal pada RGC tetangga yang dapat
menjelaskan laporan yang bertentangan mengenai kadar total glutamat di mata glaukoma [7,41].
Peningkatan HSP70 sebelumnya telah dilaporkan dalam astrosit sebagai respons terhadap stres
oksidatif, dan PGC-1a diinduksi dalam retina sebagai respons terhadap stres metabolik, dan kami
telah melaporkan peningkatan dalam astrosit setelah stres oksidatif [21,34,42]. Yang
mengejutkan, sel-sel yang disubkultur selama beberapa minggu benar-benar kehilangan
tanggapan sel-sel ini. Sistem ini sekarang dapat diperluas untuk mempelajari respon astrosit
terhadap tekanan tambahan yang relevan secara patologis, seperti hipoksia, dan strain
biomekanik [43,44]

Detoksifikasi Tanggungan p38α dan β MAPK dan Respons Proinflamasi

Model kultur primer ini digunakan untuk mengidentifikasi aktivitas p38α dan β MAPK
sebagai komponen pemediasi sinyal utama dari sakelar ini. P38 MAPK adalah keluarga serin
treonin kinase yang merupakan perantara pensinyalan kunci dalam respons SSP terhadap tekanan
lingkungan. Ketika diaktifkan, mereka memfosforilasi jaringan tumpang tindih efektor hilir
untuk mengatur diferensiasi sel, kematian sel, dan sekresi sitokin [45-47]. Keluarga p38 MAPK
mencakup empat isoform utama, yang ditunjuk; α, β, γ, dan d. Dari semua ini, isoform p38a dan
b homolog telah dikaitkan dengan degenerasi SSP setelah iskemia [46,48], cedera RGC [49], dan
pada apoptosis astrosit otak neonatal dan stres oksidatif [50-52].
Kami menemukan bahwa pensinyalan melalui p38 MAPK pada astrosit retina matang
mengatur hilangnya GS, mengkoordinasikan ekspresi gen yang menjaga keseimbangan oksidatif
lokal, dan mengarahkan sekresi sitokin proinflamasi terpilih yang terlibat dalam respons
parainflamasi retina. Penghambatan p38a dan b secara signifikan meningkatkan ROS dan
kematian sel yang sesuai, mengurangi ekspresi MnSOD, dan meningkatkan ekspresi HO-1.
MnSOD adalah enzim kunci yang melindungi komponen mitokondria dari kerusakan oksidatif
dengan mengkatalisasi detoksifikasi anion superoksida. Oleh karena itu, penurunan MnSOD
dapat menjelaskan peningkatan ROS yang diamati dengan inhibisi p38. Sebaliknya, HO-1 adalah
enzim yang diperlukan untuk katabolisme heme, dengan hasil pelepasan radikal besi bebas [53].
Oleh karena itu peningkatan MnSOD, dan pengurangan HO-1 mungkin memiliki efek
antioksidan yang serupa secara in vivo.
Dari panel 29 sitokin umum, hanya IL-6, MCP-1, dan MIP-2 yang menunjukkan
peningkatan tergantung p38. IL-6 adalah sitokin pengaktif gp130 yang dapat melewati sawar
darah otak untuk memiliki pengaruh positif dan negatif dalam SSP [54]. Di retina, IL-6 cepat
diinduksi dalam berbagai model cedera, dan memiliki efek regeneratif pada RGCs [55,56].
Konsisten dengan hasil kami, Chidlow et al juga melaporkan induksi kuat IL-6, tetapi tidak IL-
1b atau TNF-α dalam model eksperimental glaukoma in vivo [55]. Kami tidak mengamati
sekresi TGF-β yang dimediasi p38 yang kuat, seperti yang dilaporkan oleh Yu et al [57],
meskipun ada kecenderungan ke arah ini. Namun, kami mengidentifikasi MCP-1 dan MIP-2
sebagai dua chemokine tergantung p38 tambahan. Protein proinflamasi ini terutama terkait
dengan perekrutan makrofag dan neutrofil. Di otak, MCP-1 dan MIP2 juga telah dikaitkan
dengan kemotaksis mikroglial dan reaktivitas dan kontrol permeabilitas sawar darah otak
[58,59]. Kadar kedua chemokine yang meningkat secara dramatis telah dilaporkan dalam
berbagai penyakit dan model retina dalam [60-64], walaupun peran mereka yang tepat masih
belum jelas.
Sebagai kesimpulan, kami telah mengembangkan sistem untuk mempelajari mekanisme
yang mengatur aktivasi astrosit retina matang, dan menggunakannya untuk mengidentifikasi
hubungan ketergantungan MAPK p38 antara peningkatan stres oksidatif dan pensinyalan
proinflamasi, dengan potensi pengaruh neuroprotektif dan neurotoksik. Peningkatan
kelangsungan hidup RGC didukung melalui detoksifikasi ROS dan sekresi IL-6, tetapi stimulasi
autokrin dan parakrin yang merusak dari aktivitas astrosit dan mikroglial dapat diinduksi oleh
MCP-1 dan MIP-2, serta peningkatan kadar glutamat secara lokal akibat hilangnya GS. Model
ini sekarang dapat digunakan untuk membedah pensinyalan p38 untuk lebih mengisolasi respons
ini melalui penghambatan spesifik target kinase hilir, seperti MK2 dan MSK1 / 2, atau
transkripsi regulator seperti PGC-1a [45,65]. Pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme ini
akan memungkinkan pengembangan strategi terapi baru untuk secara khusus memodulasi saklar
reaktif.
Informasi Pendukung
Gambar S1 Pax-2 pewarnaan astrosit NFL retina. Mikroskopi imunofluoresensi retina tikus
yang diwarnai dengan antibodi terhadap A) Pax-2 (hijau), dan B) GFAP (merah), hanya melabeli
nukleus astrosit dan bukan Müller glia. Panel C) menunjukkan gambar yang digabungkan. Inti
diwarnai dengan DAPI (biru). (TIF)
Gambar S2 Astrosit subkultur menjadi kurang responsif terhadap stres oksidatif. A)
Western blotting seluruh sel lisat dari kultur segar (dilewati hingga tiga kali) memiliki
peningkatan yang konsisten dalam GFAP, PGC-1a dan HSP70, dan penurunan GS, dalam
menanggapi peningkatan konsentrasi PQ (seperti yang dijelaskan pada Gambar 3) . B) Sel-sel
yang telah disubkultur (dilewati lebih dari tiga kali) cenderung kehilangan respons mereka
terhadap PQ, sehingga ada sedikit perubahan pada panel penanda yang sama. Oleh karena itu
kultur segar digunakan untuk percobaan selanjutnya dalam laporan ini.
(TIF)

Ucapan Terima Kasih

Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada J. G. Flanagan untuk komentar dan
sarannya yang bermanfaat, D. Chan dan R. Bendayan atas bantuan dengan budaya astrosit.
Kartun mata itu diadaptasi dari yang digambar oleh M. McLaughlin.