2.

DNA Rekombinan Tanaman Hortikultura

EFISIENSI TRANSFORMASI TOMAT ((Lycopersicon esculentum)

DENGAN GEN SOSPS1 MENGGUNAKAN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Hasil akhir dari proses fotosintesis pada tanaman tomat adalah sukrosa dan pati.
Sukrosa di dalam sel tanaman mempunyai peran penting dalam proses metabolisme
(Castleden et al., 2004) sebagai sumber energi dan kerangka karbon serta merupakan
bentuk karbohidrat yang lebih mudah untuk ditranslokasi antar jaringan tanaman
(Cheng et al., 1996). Biosintesis sukrosa di dalam sel tanaman tomat (Lycopersicon
esculentum) dikatalisis oleh beberapa enzim. Sucrose phosphat synthase (SPS)
merupakan enzim yang berfungsi dalam mengkatalis fruktosa-6-phosphate dan UDP-
glucose menjadi sucrose-6-phosphate (Dickinson et al., 1991). Pada beberapa tanaman
diketahui SPS sebagai enzim utama dalam menentukan kandungan sukrosa, seperti
pada buah tomat, melon, batang tebu, dan umbi bit dan merupakan salah satu enzim
kunci dalam asimilasi karbon (Sugiharto et al., 2003).
Tomat (Lycopersicon esculentum) merupakan tanaman sayuran penting di
Indonesia. Salah satu upaya perakitan galur tomat adalah dengan rekayasa genetik
melalui metode DNA rekombinan. Penyisipan materi genetik pada tanaman tomat
menggunakan Agrobacterium tumefaciens telah dilakukan sejak tahun 1986
(McCormick et al., 1986), namun hasilnya masih bervariasi. Beberapa faktor
mempengaruhi keberhasilan penyisipan materi genetik, diantaranya adalah binary
vector (An, 1986), varietas (Ling et al., 1998; Ellul et al., 2003; Santoso et al., 2009),
tipe eksplan (Fillati et al., 1987), zat pengatur tumbuh (Pfitnzer et al., 1998; Cortina et
al., 2004), konsentrasi bakteri (Shanin et al., 1986), strain Agrobacterium (Roekel et
al., 1993), dan konsentrasi antibiotik (Hu dan Phillips, 2001; Qiu et al., 2007).
Transformasi gen SPS (Sucrose Phophat Synthase) telah dilakukan pada
beberapa tanaman seperti tembakau (Miswar et al., 2005), tomat (Laporte et al., 2001,
Worrel et al., 1991), bayam dan Arabidopsis thaliana (Signora et al., 1998), dan tebu
(Miswar et al., 2007). Hasil dari beberapa transformasi gen SPS tersebut menunjukkan
adanya peningkatan aktivitas SPS dan kandungan sukrosa. Hasil penelitian Dali et al.
(1992) menyatakan bahwa sukrosa yang dibentuk di daun tomat akan dihidrolisis
menjadi glukosa dan fruktosa oleh invertase setelah sampai di buah. Sukrosa kemudian
dibentuk kembali (resintesis) dari glukosa dan fruktosa yang dikatalisis oleh SPS buah
(Miron dan Schaffer, 1991). Disini terlihat bahwa SPS merupakan enzim penting dalam
pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
efisiensi transformasi dan mendapatkan tanaman tomat transgenik yang ditransformasi
dengan gen SoSPS1 menggunakan Agrobacterium tumefaciens.

BAHAN DAN CARA KERJA

Bahan Tanam
Benih tomat varietas Zamrud dan Liontin berasal dari Balitsa (Balai Penelitian
Sayuran) Lembang. Benih direndam air hangat selama 5 menit, kemudian disterilisasi
dengan larutan Hipoklorit 5% selama 30 detik dan dibilas 3 kali dengan aquadest steril.
Benih ditanam pada media perkecambahan (MS + 30 g/l sukrosa + 3 g/l phytagel, pH
5,8). Inkubasi dilakukan selama 4 hari diruang gelap dan 10 hari diruang terang dengan
penyinaran 1600 lux dan pada suhu 25° C.
Infeksi dan Kokultivasi Eksplan
kotiledon dipotong bagian pangkal dan ujung sehingga membentuk persegi
panjang, sedangkan tunas aksilar dipotong ± 0,5 cm. Potongan kotiledon dan tunas
aksilar di tanam pada media prekultur (MS + 30 g/l sukrosa + 0,2 mgL–1 IAA + 2
mgL–1 BAP + 3 g/l phytagel, pH 5,8). Eksplan diprekultur selama 24 jam pada suhu
25° C. Bakteri Agrobacterium pada media 50 ml cair di sentrifuge dengan kecepatan
5.000 rpm selama 10 menit dan peletnya disuspensikan pada media MS cair sebanyak
50 ml. Eksplant tomat hasil prekultur dimasukkan ke dalam suspensi Agrobacterium,
kemudian digojok dengan shaker selama 30 menit pada suhu 28° C dan kecepatan 50
rpm. Eksplan ditanam pada media kokultivasi (MS + 30 g/l sukrosa + 0,2 mgL–1 IAA
+ 2 mgL–1 BAP + 3 g/l phytagel + 50 mgL– 1 acetosyringone, pH 5,8.) dan diinkubasi
di tempat gelap selama 2 hari.
 Eliminasi Agrobacterium
Eksplant dari media kokultivasi dicuci dengan menggunaan MS cair 50 ml
yang mengandung cefotaxime 500 mgL–1 dan ditiriskan diatas kertas saring.
Eksplant ditanaman pada media eliminasi (MS + 30 g/l sukrosa + 0,2 mgL–1 IAA + 2
mgL–1 BAP + 3 g/l phytagel + 500 mgL–1 cefotaxim, pH 5,8) pada kondisi terang
selama 5 hari.
Seleksi Tomat Putative Transforman
Seleksi Tomat Putative TransformanEksplan ditanam pada media kanamisin 0,
25, 50, 75 dan 100 mgL–1 untuk mengetahui efektivitas kanamisin sebagai agen
seleksi. Optimasi eksplan umur 14, 15 dan 16 hari setelah perkecambahan juga
dilakukan untuk mengetahui efektivitas umur eksplant dalam membentuk tunas. Hasil
uji kanamisin dan umur eksplant digunakan sebagai dasar untuk transformasi. Eksplant
dari media eliminasi disubkultur pada media seleksi (MS + 30 g/l sukrosa + 0,2 mgL–
1 IAA + 2 mgL–1 BAP + 3 g/l phytagel + 500 mgL–1 ceffotaxim + 50 mgL–1
kanamisin, pH 5,8). Planlet yang mampu tumbuh disubkultur pada media seleksi baru
dengan 5 kali media seleksi. Dengan masa seleksi masing-masing 14 hari. Apabila
eksplan sudah bertunas disubkultur ke media perpanjangan MS + 30 g/l sukrosa +
0,25 mgL–1 BAP+0,25 mgL–1 GA3 + 3 g/l phytagel + 500 mgL–1 ceffotaxim + 50
mgL–1 kanamisin, pH 5,8), kemudian media perakaran (MS + 30 g/l sukrosa + 0,15
mgL–1 NAA + 3 g/l phytagel + 500 mgL–1 ceffotaxim + 50 mgL–1 kanamisin, pH
5,8).
Parameter Pengamatan
Pengamatan dilakukan pada persentase eksplant berkalus, persentase eksplant
bertunas dan jumlah tunas per eksplant.
Analisis PCR (Polymerase Chain Reactions)
solasi DNA genomik berasal dari daun tomat. Untuk mengetahui keberadaan
gen SoSP1 pada plasmid pKYS yang diisolasi dari Agrobacteriumtumefaciens
transforman dilakukan PCR menggunakan forward primer nptII (5’-
GTCATCTCACCTTGCTCCTGCC-3), dan reverse primer nptII (5’-
GTCGCTTGGTCGGTCATTTC-3) dengan ukuran ± 650 bp.
 ISOLASI DNA TANAMAN BAYAM (Amaranthus sp.) DAN
IKAN LELE (Clarias sp.) SEBAGAI KAJIAN DALAM
BIOLOGI MOLEKULER

Pesatnya perkembangan ilmu biologi yang didukung dengan teknologi saat ini
menjadikan abad 21 ini disebut sebagai abad biologi (Yulaikah, 2015). Hampir semua
masalah-masalah biologi yang telah, sedang dan akan terus dijawab mengarah pada
tingkat molekuler. Hasil penelitian Ekasari et al., (2012), analisis keanekaragaman
genetik menggunakan penanda molekuler yaitu deoxyribonucleic acid (DNA) sebagai
penanda dari spesies tertentu untuk tujuan pengembangan sistem pemuliaan berbasis
molekular.
DNA menjadi salah satu kajian materi dalam biologi molekuler. DNA
mengandung materi genetik yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. Suatu molekul DNA tersusun atas
basa nitrogen, gula, dan fosfat (Yuwono, 2006).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk memelajari DNA. Ekstraksi
DNA daun tanaman Grevillea (Proteaceae) dengan memodifikasi metode Doyle dan
Doyle (1990), telah berhasil diperoleh DNA dengan kualitas yang baik (Pharmawati,
2009) dalam (Restu et al., 2012). DNA dapat diisolasi baik dari sel tanaman, hewan,
manusia maupun bakteri (Faatih, 2009). Salah satu rangkaian teknik rekayasa genetika
adalah isolasi DNA, yang melibatkan suatu proses memindahkan DNA dari suatu
organisme ke organisme lain dengan tujuan tertentu. Melalui isolasi DNA kita dapat
memeroleh DNA murni, yaitu tanpa protein maupun RNA dari suatu sel dalam
jaringan. DNA murni yang sudah diperoleh dapat digunakan sebagai bahan pengayaan
pokok bahasan sel yaitu DNA berada di sel tumbuhan maupun hewan, sebagai kajian
genetika bahwa gen merupakan bagian dari DNA (terdapat sebagai lokus-lokus) yang
berfungsi untuk mengontrol perkembangan fisik maupun perilaku dari setiap mahluk
hidup, sebagai kajian bioteknologi yang jika kita kaji lebih lanjut salah satu
kemanfaatannya yaitu sebagai tanaman transgenik.
 Tahapan pada proses isolasi DNA ini, adalah ekstraksi dan pelisisan sel secara
mekanik maupun kimia melalui penggerusan serta penggunaan garam dan detergent,
pencernaan protein menggunakan enzim proteinase dari ekstrak buah pepaya,
presipitasi DNA dari bahan yang lain yang tidak diinginkan menggunakan ethanol atau
alkohol dingin (Yulianti, 2006).

METODE PENELITIAN
Tahapan dalam isolasi DNA ini yaitu ekstraksi dan pelisisan sel, pencernaan
protein, pengendapan atau presipitasi dan pemanenan DNA, modifikasi Yulianti
(2006); Mardiyyaningsih (2013); NLECT (2010). Isolasi yang dilakukan terdiri atas 2
sampel yaitu tanaman bayam dan ikan lele, sebagai berikut:
Isolasi DNA Tanaman Bayam
Sebanyak 2,5 gram daun bayam digerus menggunakan mortar dan pistil lalu
ditambah 2,5 ml aquadest. Ekstrak bayam disaring menggunakan kertas saring atau
kain bersih dan ditampung di beaker glass 250 ml. Larutan hasil saringan ditambahkan
2 ml larutan (1 sendok detergent + 1 sendok garam dalam 50 ml aquadest). Larutan
dipindah ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 2 ml ekstrak buah pepaya yang
telah digerus (20 gram tanpa ditambah aquadest). Ditambahkan 5 ml ethanol 96%
dingin perlahan-lahan melewati dinding tabung reaksi. Diamati DNA yang terbentuk.
Isolasi DNA Ikan Lele
Sebanyak 5 gram daging ikan lele dicuci lalu direndam dalam larutan NaCl
80% selama 2 menit. Daging lele ditiriskan lalu digerus menggunakan mortar dan pistel
dan ditambah 2,5 ml aquadest. Ekstrak daging ikan lele disaring menggunakan kertas
saring atau kain bersih dan ditampung di beaker glass 250 ml. Larutan hasil saringan
ditambahkan 2 ml larutan (1 sendok detergent + 1 sendok garam dalam 50 ml
aquadest). Larutan dipindah ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 2 ml ekstrak
buah pepaya yang telah digerus (20 gram tanpa ditambah aquadest). Ditambahkan 5 ml
ethanol 96% dingin perlahan-lahan melewati dinding tabung reaksi. Diamati DNA
yang terbentuk.
 Data yang dihasilkan berupa gumpalan DNA yang berwarna putih keruh yang
berada di atas permukaan larutan. Dimana akan terbentuk 3 lapisan yaitu lapisan bawah
filtrat, tengah ethanol dan lapisan paling atas adalah gumpalan DNA. Data akan di
analisis secara deskriptif baik isolasi DNA pada tanaman bayam dan maupun ikan lele.

Transformasi Genetik Pisang Ambon dengan Gen Kitinase dari Padi

Pisang berkembang biak secara vegetatif sehingga persilangan untuk

mendapatkan varietas baru tidak dapat dilakukan. Metode transformasi genetik telah
banyak dilakukan pada berbagai sifat tanaman dan telah menghasilkan berbagai
varietas tanaman dengan sifat-sifat tertentu. Ada tiga faktor yang harus dipenuhi dalam
rekayasa genetik, yaitu ketersediaan gen yang diintroduksikan, sistem transformasi gen
ke dalam genom tanaman target dan sistem regenerasi sel-sel transforman menjadi
planlet atau tanaman.
Transformasi genetik pisang telah dilakukan oleh Sreeramanan et al. (2006b)
menggunakan A. tumefaciens strain EHA 101 dan LBA 4404. Hasil yang diperoleh
menunjukkan Agrobacterium tumefaciens dapat mentransfer T-DNA ke dalam sel
pisang dengan efisiensi tinggi. Hasil penelitian Sreeramanan et al. (2009) menunjukkan
bahwa efisiensi transformasi tertinggi pada transformasi genetik pisang diperoleh
dengan menggunakan higromisin 20 mg/l, sedangkan waktu kokultivasi terbaik adalah
3 hari (Subramanyam et al., 2011).
Dengan ditemukannya gen-gen yang berperan di dalam mekanisme pertahanan
tanaman terhadap cendawan dan telah berkembangnya teknik rekayasa genetika, maka
terbuka peluang untuk merakit kultivar pisang yang tahan terhadap patogen ini. Salah
satu gen yang menghasilkan protein antifungal, yaitu gen kitinase (chi gene) yang
mengekspresikan enzim kitinase (Poly1,4-(N-acetyl-ß-D-glucosaminidase)
glycanohydrolase). Enzim kitinase pada tanaman merupakan bagian dari sistem
pertahanan alami, diproduksi secara konstitutif dalam jumlah sedikit dan akan
meningkat secara simultan sebagai respon terhadap stres lingkungan, serangan
patogen, luka maupun penuaan (Graham dan Sticlen, 1994). Gen kitinase yang
mengekspresikan enzim kitinase dapat menghidrolisis kitin (Poly-ß-1,4-N-
acetylglucosamine), yaitu suatu polimer penyusun dinding hifa yang utama dari
cendawan (Cohen-Kupiec dan Chet, 1998; Datta el al., 2000). Kitin terutama terdapat
pada ujung dan septum dari hifa dan bila terhidrolisis akan menyebabkan terjadinya
lisis.

BAHAN DAN METODE

Persiapan Eksplan
Bahan tanaman yang digunakan sebagai sumber eksplan adalah berupa bonggol
anakan dari tanaman pisang Ambon Kuning. Untuk mendapatkan eksplan yang steril,
bonggol dari anakan pisang dikupas seludangnya hingga ukuran diameter batang 1-2
cm, kemudian disterilisasi dengan teknik baku yang biasa dilakukan di Laboratorium
Kultur Jaringan. Larutan sterilisasi yang digunakan antara lain fungisida, bakterisida,
bayclin, alkohol, dan akuades steril. Eksplan bonggol yang mempunyai titik tumbuh
dipotong hingga berukuran diameter +1 cm dan panjang +3-5 cm ditanam pada media
inisiasi tunas, yaitu MS + BA 3 mg/l + thidiazuron 0,4 mg/l. Nodul yang terbentuk
digunakan sebagai bahan tanaman (eksplan) kegiatan selanjutnya.
Penentuan Higromisin sebagai Penyeleksi Transforman
Plasmid pembawa gen chi yang digunakan dalam penelitian ini adalah pCambia
1302 (Gambar 1). Plasmid ini mengandung higromisin sebagai marka seleksi dan telah
diinsersikan ke dalam vektor A. tumefaciens strain LBA 4404. Untuk mengetahui
efektivitas higromisin sebagai agen penyeleksi dalam menghambat pertumbuhan
eksplan setelah dilakukan transformasi genetik, maka dilakukan percobaan untuk
mengetahui konsentrasi higromisin yang terendah yang dapat menghambat
pertumbuhan eksplan. Bahan tanaman yang digunakan adalah nodul yang diperoleh
dari kegiatan 1. Percobaan dilakukan dengan menumbuhkan nodul pada media MS
mengandung BA 3 mg/l, thidiazuron 0,4 mg/l, dan PVP 100 mg/l dengan beberapa
taraf konsentrasi higromisin (0, 15, 25, 35, dan 45 mg/l). Jumlah eksplan yang
digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 20 nodul. Kultur diinkubasi selama
6 minggu pada suhu 25o C. Pengamatan dilakukan terhadap persentase nodul yang
hidup, serta visual eksplan. Konsentrasi higromisin terendah yang menyebabkan
kematian nodul digunakan pada percobaan selanjutnya.
Persiapan Suspensi Bakteri A. tumefaciens Strain LBA4404
Bakteri Agrobacterium yang membawa konstruksi gen chi ditumbuhkan pada
media LB padat yang mengandung 100 mg/l kanamisin selama 2 hari sebelum
digunakan. Koloni tunggal bakteri diambil dari cawan petri dan ditumbuhkan pada 5
ml media LB cair + 100 mg/l kanamisin. Bakteri diinkubasi pada 28o C dalam keadaan
gelap selama satu malam dengan penggoyangan 150 rpm. Kultur bakteri diencerkan
dengan media LB cair dengan pengenceran 1 : 3 dan kultur diinkubasi kembali pada
kondisi yang sama selama tiga jam hingga konsentrasi 0,6 pada OD 600.
Seleksi dan regenerasi eksplan setelah transformasi
Setelah kokultivasi, nodul yang telah diinfeksi dicuci dengan akuades steril
yang mengandung cefotaxim 300 mg/l. Higromisin digunakan untuk menyeleksi nodul
transforman dengan non transforman. Nodul diletakkan pada kertas steril dan
dipindahkan pada media seleksi (MS + BA 3 g/l + thidiazuron 0,4 mg/l + PVP 100
mg/l + sukrosa 30 g/l + phytagel 2,5 g/l dengan penambahan higromisin 25 mg/l
(berdasarkan hasil pada kegiatan sebelumnya) dan cefotaxim 300 mg/l. Sebagai kontrol
negatif digunakan juga nodul yang tidak ditransformasi. Kultur pada media seleksi
diinkubasi pada ruang kultur dengan suhu 27o C dengan fotoperiodisitas cahaya 16 jam
terang/8 jam gelap. Peubah yang diamati adalah persentase nodul yang hidup serta
visual nodul. Berdasarkan hasil yang diperoleh, maka dilakukan kembali transformasi
gen dengan menggunakan waktu perendaman eksplan terbaik, dikombinasikan dengan
penggunaan asetosiringon pada konsentrasi 0 dan 100 mg/l dengan menggunakan
metode yang sama. Nodul yang tumbuh di media seleksi diasumsikan sebagai putatif
transforman dan setiap 2 bulan disubkultur pada media regenerasi sampai muncul
tunas. Peubah yang diamati adalah persentase nodul hidup,warna nodul, pertumbuhan
nodul, jumlah tunas, dan panjang tunas.
 ISOLASI DNA TANAMAN DAUN SAWI PUTIH (Brassica rapa
subsp.Pekinensis) , DAUN SAWI HIJAU (Brassica rapa Var.Parachinensis) , DAN
DAUN PAKCOY (Brassica rapa subsp.Chinensis) MENGGUNAKAN METODE
EKSTRAKSI DNA SECARA SEDERHANA DENGAN UJI KUALITATIF
DAN UJI KUANTITATIF

Saat ini perkembangan ilmu biologi yang didukung dengan teknologi cukup
pesat. Hampir semua masalah biologi yang telah, sedang dan akan terus dijawab
mengarah pada tingkat molekuler. Hasil penelitian oleh Ekasari et al (2012), analisis
keanekaragaman genetik menggunakan penanda molekuler yaitu deoxyribonucleic
acid (DNA) sebagai penanda dari spesies tertentu untuk tujuan pengembangan sistem
pemulian berbasis molekuler.
DNA menjadi salah satu kajian materi dalam biologi molekuler. DNA
mengandung materi genetik yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk
proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas basa nitrogen, gula,
dan fosfat (Yuwono, 2006). Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk
mempelajari DNA. DNA dapat diisolasi dari sel tanaman, hewan, manusia, maupun
bakteri (Fatih, 2009). Isolasi DNA digunakan untuk berbagai macam keperluan seperti
amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis maupun spektrofotometri. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Melalui isolasi DNA kita dapat memperoleh DNA murni, yaitu
tanpa protein maupun RNA dari suatu sel dalam jaringan. Prinsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Dolphin, 2008).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam uji kualitatif dan kuantitatif DNA tanaman adalah
neraca analitik, refrigerated centrifuge, mikropipet P1000, mikropipet P200,
mikropipet P20, vortex, waterbath, refrigerator, sentrifuge, spektrofotometer,
elektroforesis horizontal, transiluminator uv, hot plate-magnetic stirer, lemari asam
(fume hood), pH meter lab, gelas beaker 100 mL, erlenmeyer 100 mL, gelas ukur 100
mL, labu ukur 50 mL, labu ukur 100 mL, tabung mikro1,5 mL, kuvet yang kompatibel,
tanki elektroforesis, blue tips, yellow tips, white tips, pencetak gel, microwave, dan
sisir pencetak sumuran gel.
Bahan yang digunakan pada praktikum biologi molekuler isolasi DNA tanaman
adalah larutan berwarna, etanol absolut dingin, buffer TE, daun sawi dan pakcoy
(Brassica sp.), buffer ekstraksi (200 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 25 mM
EDTA, 0,5% CTAB), kloroform, isoamilalkohol, etanol 70%, agarose, peq green,
penanda ukuran fragmen DNA (DNA ladder), sampel DNA amplikon, sampel DNA
terdigesti, brom phenol blue atau loading dye, running buffer 0,5x TBE: 5,4 g Tris base,
2,75 g asam borak, 2 mL 0,5 M EDTA dalam 1 liter aquabides (pH=8,0) atau 1x TAE:
4,84 g Tris base, 1,14 mL asam asetat glassial, 2 ml 0,5 M EDTA dalam aquabides
(pH=8,0), pelarut agarosa sebaiknya sama dengan running buffer.
Isolasi DNA
Perlakuan pada isolasi DNA tanaman, isolat diambil dengan memotong sawi
menjadi 6 bagian berbentuk bulatan dari 4 jenis sawi-sawian yaitu, Brassica rapa
Var.Parachinensis (Daun Sawi Hijau), Brassica rapa subsp.Pekinesis (Daun Sawi
Putih), Brassica rapa Var. Parachinensis (Daun Sawi Hijau), dan Brassica rapa
Subsp. Chinensis (Daun Pakcoy). Sampel dihaluskan dengan menggunakan mortar dan
alu hingga halus tanpa penambahan pasir steril. 500 μL buffer ekstraksi ditambahkan
kedalam tube sampel. Sampel daun telah menjadi halus dan untuk meratakan
digunakan vorteks selama 5 detik. Tube sampel diinkubasi dalam water bath pada suhu
60°C selama 30 menit dan pada setiap 10 menit divortex. Kloroform : isoamilalkohol
(24:1) ditambahkan sebanyak 1x volume sampel kedalam tube sampel. Tube sampel
dikocok selama 10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000x g selama
5 menit dalam suhu 4°C. Supernatan diambil dari tube sampel, kemudian dipindahkan
kedalam tube mikro 1,5 mL yang baru. Etanol absolute ditambahkan sebanyak 2x
volume sampel kedalam tube sampel, kemudian tube sampel dikocok dan diinkubasi
pada suhu -20°C (freezer) selama 30 meni. Tube sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 15.000x g selama 5 menit. Supernatan dibuang dari tube sampel kemudian
ditambahkan 100 µl etanol 70% dan tube sampel disentrifuge dengan kecepatan
15.000x g selama 5 menit dalam suhu 4°C. Tube sampel dikeringkan dan setelah kering
ditambahkan buffer TE sebanyak 30µl dan disimpan pasa suhu -20°C (freezer).
Uji Kualitatif DNA
Sampel yang sudah siap dilanjutkan dengan perlakuan uji kualitatif
menggunakan elektroforesis horizontal gel agarose. Pertama disiapkan gel agarose
dengan konsentrasi 1 % sebanyak 0,25 gr. Buffer TAE ditambahkan sebanyak 25 mL
dan dicampurkan keduanya di dalam erlenmeyer. Erlenmeyer diletakkan di dalam
microwave dan dilakukan pemanasan selama 1 menit. Peq green dimasukkan ke dalam
erlenmeyer sebanyak 1 µl. Alat berupa elektroforesis horizontal dipersiapkan dan
dipasangkan sisir pembentuk sumuran dalam wadah pencetak. Gel agarose dituang ke
dalam wadah pencetak hingga gel membeku.
Sisir yang ada pada sumuran dilepaskan secara perlahan-lahan. Gel dimasukkan
pada tanki elektroforesis dan sumuran harus terletak pada kutub bagian sisi negatif.
Buffer TAE dimasukkan ke dalam tangki hingga batas maksimal sertamenutupi
permukaan gel agarose. Loading dye disiapkan sebanyak 1 µl dalam 1 sumuran.
Petanda ukuran DNA atau DNA ladder (marker) dimasukan pada sumuran 1 sebagai
pembanding untuk pembacaan sampel yang akan diuji. 3 µl sampel dan 1 µl loading
dye dicampurkan dengan cara pipetting pada mikropipet, apabila warna sampel sudah
terbentuk warna biru maka sampel sudah tercampur. Sampel tersebut dimasukkan ke
dalam tiap-tiap sumuran sesuai dengan urutan yang telah dibuat. Tangki elektroforesis
dihubungkan dengan power supply dan diatur pada 100V selama 30 menit. Setelah
selesai, wadah pencetak diangkat dan dikeluarkan gel agarose tersebut dari wadah
pencetak. Gel agarose dibaca pada transiluminator UV untuk mendeteksi ketebalan
pita-pita DNA sampel.
Uji Kuantitatif DNA
Sisa dari sampel setelah uji kualitatif, dilanjutkan ke pada uji kuantitatif dengan
menggunakan spektofotometer dengan panjang gelombang 260 nm. Diambil sampel
DNA sebanyak 1 µl dan diencerkan menggunakan buffer TE dengan pengenceran
bertingkat hingga 1000x. Total buffer TE yang diencerkan sejumlah 1000 µl.
Dipersiapkan blanko untuk mengkalibrasi alat sebelum pengujian sampel. Setelah
sampel siap, dimasukkan ke dalam kuvet sampai batas yang sudah tertera. Kuvet
dimasukkan ke dalam spektrofotometer dan dibaca nilai kemurnian DNA dan nilai
konsentrasi DNA pada tiap-tiap sampel yang digunakan.

Transformasi Gen Antisens ACC Oksidase pada Pepaya dengan Teknik

Penembakan Partikel

Salah satu masalah utama yang mempengaruhi produksi dan kualitas buah
pepaya adalah cepatnya buah pepaya menjadi masak sehingga menyulitkan transportasi
pada waktu pengiriman buah ke pasar domestik maupun internasional sebagai ekspor
buah segar. Perakitan varietas unggul untuk mempertahan- kan kualitas buah dapat
dilakukan dengan pendekatan bioteknologi atau rekayasa genetik melalui teknik kul-
tur jaringan dan transformasi gen.
Teknik rekayasa genetik dapat digunakan sebagai mitra pelengkap teknik
pemuliaan yang sudah mantap dan digunakan dengan sukses selama bertahun-tahun
(Herman 1996). Produk rekayasa genetik yang berupa tanaman transgenik sudah
banyak ditanam dan dipa- sarkan di berbagai negara (James 2003). Tanaman transgenik
yang memiliki sifat baru seperti ketahanan terhadap hama, penyakit maupun
meningkatkan kua- litas sudah banyak ditanam dan dipasarkan di beber- apa negara.
Menurut hasil survei James (2004) sejak tahun 1996-2004 telah terjadi peningkatan
lebih dari 47 kali lipat areal penanaman tanaman transgenik, yaitu 1,7 juta hektar pada
tahun 1996 menjadi 81 juta hektar pada tahun 2004.

BAHAN DAN METODE

Transformasi tanaman pepaya dilakukan secara ko-transformasi dengan
menggunakan DNA plasmid pGA643-SM4 (mengandung gen antisens ACC oksidase
yang dikendalikan oleh promotor 35S, terminator nos dan marka seleksi kanamisin)
dan plasmid pRQ6 (mengandung gen seleksi hptII dan gen pelapor gus) pada kalus
pepaya umur 1 bulan. Peta konstruk pGA643-SM4 dan pRQ6 dapat dilihat pada
GEmbrio zigotik muda diisolasi dengan membelah biji pepaya muda dalam laminar
air flow dan ditanam pada media induksi kalus, yaitu media dasar MS + 2,4D 10 mg/l
+ sukrosa 6% + adenin sulfat 143 mg/l + myo inositol 50 mg/l + glutamin 400 mg/l.
Pada setiap botol media ditanam 10 embrio zigotik muda. Kultur disimpan di tempat
gelap. Kalus embriogenik yang ter- bentuk disubkultur setiap 2 minggu sebanyak 2
kali.
Pengujian Ekspresi Gen Pelapor Gus
Pengujian ekspresi gen gus dilakukan berdasar- kan metode Jefferson et al.
(1987) dan pengamatan di- lakukan pada kalus umur 3, 6, dan 9 hari setelah pe-
nembakan. Sejumlah 30 kalus dimasukkan ke dalam tabung eppendorf sesuai dengan
masing-masing perla- kuan dan ditambahkan larutan X-gluc (5-Bromo-4- chloro-3-
indolyl-β-D-glucoronide). Kalus diinkubasi pa- da temperatur 37oC selama 24 jam.
Setelah masa inku- basi, pengamatan dilakukan dengan menghitung jum- lah kalus
yang mengandung gen gus yang ditandai de- ngan bintik warna biru yang terbentuk
pada kalus menggunakan mikroskop.
Regenerasi dan Seleksi Kalus Hasil Penembakan
Pada tahap penelitian ini dilakukan beberapa perlakuan untuk mengetahui
media yang terbaik un- tuk regenerasi kalus yang telah ditembak Di samping itu,
digunakan beberapa variasi konsentrasi antibiotik untuk mengetahui konsentrasi yang
terbaik. Media regenerasi yang digunakan diberi perlakuan dengan variasi beberapa
vitamin, yaitu P1 (MS + GA3 0,5 mg/l + kinetin 0,1 mg/l + B5 + tanpa vitamin MS),
P2 (MS + GA3 0,5 mg/l + kinetin 0,1 mg/l + vitamin MS), dan P3 (MS + GA3 0,5 mg/l
+ kinetin 0,1 mg/l + vitamin Morel dan Wetmore). Konsentrasi antibiotik yang digu-
nakan terdiri atas 50, 100, dan 150 mg/l. Setiap botol di- tanami 5 kalus yang telah
ditransformasi dan setiap perlakuan diulang sebanyak 20 kali. Konsentrasi anti- biotik
0 mg/l digunakan sebagai kontrol pada kalus yang tidak ditembak. Pengamatan
dilakukan terhadap jumlah eksplan yang mampu membentuk kalus embriogenik dan
kalus yang berwarna hijau, pada 4-5 bulan setelah tanam.
Kalus yang terseleksi ditumbuhkan pada kondisi terang dengan intensitas
cahaya 800 lux per 16 jam dan temperatur 24oC. Kalus disubkultur setiap 1 bulan
sampai kalus berkembang menjadi planlet. Planlet yang terbentuk kemudian
dipindahkan ke media per- akaran, yaitu media 1/2 MS + paclobutrazol 0,5 mg/l.
Aklimatisasi planlet yang tumbuh normal dilakukan pada media campuran antara arang
sekam dan kom- pos. Peubah yang diamati adalah kemampuan mem- bentuk kalus,
kemampuan beregenerasi, kemampuan membentuk planlet, dan jumlah tanaman yang
ber- hasil diaklimatisasi.

3. Permasalahan di Bidang Bioteknologi dan Solusinya

Salah satu permasalahan dalam bidang bioteknologi yaitu organisme
transgenik yang dimanfaatkan untuk pemuliaan hewan dan tumbuhan.
Analisis manfaat dari organisme transgenik untuk pemuliaan hewan dan
tumbuhan yaitu: Hewan transgenik merupakan hewan yang mengadung sisipan gen
asing di dalam genomnya. Genom adalah keseluruhan informasi genetik yag dimiliki
suatu sel organisme.
Contoh aplikasinya: Hormon EGF (epidermal growth factor) mempercepat
pertumbuhan rambutdomba penghasil wol. Peningkatan dosis menjadikan domba
memiliki rambut yag tumbuh lebih cepat dan helaian rambut tipis dan rontok dengan
sendirinya.
Tumbuhan transgenik adalah hasil rekayasa genetika denga sistem
penggabungan gen pada suatu rangkaian DNA. Contoh-contoh tumbuhan transgenik
antara lain: Buah-buahan tahan lama untuk disimpan seperti tomat flavr savr yang
mempunyai tingkat kematangan lebih lama setelah dipetik sehingga tidak mudah
busuk. Melon yang ditrasnfer gen dari bakteriofage T3 yang berfungsi mengurangi
pembentukan etilen agar tidak cepat busuk.