232 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.

org
Sekuensing RNA Sel Tunggal Mengungkapkan
Evolusi Stromal menjadi LRRC15
+

Myofi broblast sebagai Penentu

Respon Pasien terhadap
Imunoterapi Kanker
Claudia X. Dominguez
1
, Sören Müller
2
, Shilpa Keerthivasan
1
, Jeffreepy
Hartmut K , Jeffreepy 3
, Hartmut K
Hung
3
, Sar ah Gierk e
4
,
Beatrice Breart
1
, Oded F oreman
3
, T r avis W . Jembatan
5
,
Alessandr a Castiglioni
1
, Y asin Senbabaoglu
2
,
Zor a Modrusan
6
, Y uxin Liang
6
, Melissa R. Junttila
7
,
Christiaan Klijn
2
, Richard Bourgon
2
, dan Shannon J. T urle y
1

AR TIKEL PENELITIAN
ABS TRA CT
With hanya sebagian kecil dari pasien yang menanggapi imunoterapi kanker, pemahaman yang lebih baik
tentang seluruh lingkungan mikro tumor diperlukan. Menggunakan sel tunggal
transkriptomik, kami memetakan lanskap fibroblastik selama
perkembangan adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) pada model hewan. Kami mengidentifikasi populasi fibroblas
terkait karsinoma (CAF) yang
diprogram oleh TGFβ dan mengekspresikan pengulangan kaya leusin yang mengandung protein 15 (LRRC15).
LRRC15
+ CAF ini
mengelilingi pulau tumor dan tidak ada di jaringan pankreas normal. Kehadiran
LRRC15
+ CAFs
pada pasien manusia dikonfirmasi di > 80.000 sel tunggal dari 22 pasien dengan PDAC
serta dengan menggunakan IHC pada sampel dari 70 pasien. Selanjutnya, uji klinis imunoterapi
yang melibatkan lebih dari 600 pasien di enam jenis kanker mengungkapkan peningkatan level tanda tangan LRRC15
+
CA F yang
berkorelasi dengan respons yang buruk terhadap terapi anti-PD-L1. Pekerjaan ini memiliki implikasi penting
untuk menargetkan elemen nonimun dari lingkungan mikro tumor untuk meningkatkan tanggapan pasien
kanker terhadap terapi blokade pos pemeriksaan imun.
SIGNIFIKANSI: Studi ini menggambarkan lanskap sel tunggal CAF pada kanker pankreas selama
evolusi tumor in vivo. Garis keturunan LRRC15
+
CAF yang digerakkan oleh TGFβ dikaitkan dengan hasil yang buruk dalam
data percobaan imunoterapi yang terdiri dari beberapa entitas tumor padat dan mewakili target untuk terapi kombinatorial
.
1
Departemen Imunologi Kanker, Genentech, San Francisco Selatan,
California .
2
Departemen Bioinformatika dan Biologi Komputasi,
Genentech, San Francisco Selatan, California.
3
Departemen Patologi,
Genentech, San Francisco Selatan, California.
4
Pusat
Mikroskop Cahaya Tingkat Lanjut, Genentech, San Francisco Selatan, California.
5
Departemen
Kimia Protein, Genentech, San Francisco Selatan, California.
6
Departemen
Mikrokimia, Proteomik & Lipidomik, Genentech, San Francisco Selatan
, California.
7
Departemen Onkologi Terjemahan, Genentech,
San Francisco Selatan, California.
Catatan: Data tambahan untuk artikel ini tersedia di Cancer Discovery
Online (http://cancerdisco v ery.aacrjournals.org/).
CX Dominguez dan S. Müller memberikan kontribusi yang sama untuk artikel ini.
Penulis Koresponden: Shannon J. Turley, Genentech, 1 DNA Way,
San Francisco Selatan, CA 94080. Telepon: 650-225-2790; Email: turley.shannon@
gene.com
Cancer Disco v 2020;10:232– 53
doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0644
©2019 American Association for Cancer Research.
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022
FEBRUARI 2020 PENEMUAN KANKER | 233
PENDAHULUAN
Adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) tetap merupakan
penyakit yang menghancurkan, dengan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sebesar 7% (1). Salah
satu ciri dari kanker agresif ini adalah
desmoplasia dramatis yang didorong oleh karsinoma terkait fibroblas (CAF).
CAF tidak hanya menyimpan matriks ekstraseluler (ECM) yang menjadi
ciri desmoplasia, tetapi juga menghasilkan faktor yang
mendorong pertumbuhan tumor. Selanjutnya, CAFs telah ditargetkan
dalam upaya untuk meningkatkan hasil PDAC, dengan hasil yang bertentangan
(2-6). Perbedaan dalam hasil mungkin
dijelaskan oleh heterogenitas CAF, dengan
populasi fibroblas yang berbeda memiliki fungsi yang terpisah, bahkan mungkin berlawanan
(7, 8). Aktin otot polos (SMA) dan
protein pengaktif fibroblast (FAP) telah digambarkan menunjukkan
ekspresi heterogen pada populasi CAF (8, 9), dan CAF
tinggi SMA telah diidentifikasi lebih lanjut sebagai
populasi yang digerakkan oleh TGFβ yang berdekatan dengan tumor dengan perbedaan sifat inflamasi
dari CAF SMA-rendah.
Menariknya, meskipun hasil yang bertentangan dari penargetan
CAF sebagai terapi tunggal, modulasi CAF dalam kombinasi
dengan imunoterapi meningkatkan hasil dalam beberapa
model praklinis (2, 4, 10). Karena studi ini memodelkan kanker
yang menunjukkan resistensi terhadap imunoterapi saja, mereka menyarankan
bahwa menjelaskan fungsi CAF dapat memberikan pemahaman yang
diperlukan untuk merancang pendekatan imunoterapi yang lebih manjur
dan mengatasi kebutuhan klinis yang tidak terpenuhi pada
kanker yang menghancurkan seperti PDAC. Cakupan penuh fungsi CAF di
konteks imunoterapi kanker masih harus ditentukan,
tetapi tentu akan dipengaruhi oleh keadaan fibroblas pada
antarmuka jaringan-tumor.
Kami berusaha untuk memberikan penilaian yang tidak bias dari
heterogenitas fibroblas pada jaringan normal serta PDAC dengan
menggunakan kombinasi sekuensing RNA sel massal dan sel tunggal
(RNA-seq) dari sel stroma. Jaringan normal,
jaringan berdekatan yang tidak ganas, dan tumor awal dan lanjut dari
model tikus rekayasa genetika (GEMM) digunakan
dalam penelitian ini. Kami berhipotesis bahwa perubahan
lingkungan mikro selama perkembangan tumor mempengaruhi fenotipe
fibroblas residen jaringan, menghasilkan perkembangannya
menjadi beberapa himpunan bagian CAF. Analisis kami mengungkapkan bahwa
heterogenitas fibroblas yang sudah ada sebelumnya dalam jaringan normal mendikte
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022
Dominguez et al .
PASAL PENELITIAN
234 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org
lintasan perkembangan CAF murine. Data ini memungkinkan
identifikasi profil transkripsi dari
populasi CAF individu, dan mengungkapkan CAF yang diprogram
TGF, yang dapat diidentifikasi dengan ekspresi pengulangan kaya leusin yang mengandung
15 (LRRC15), yang menjadi fibroblas dominan
pada tumor stadium lanjut. Menggabungkan data sekuensing manusia yang tersedia untuk umum
dengan IHC jaringan yang baru diperoleh dari
70 pasien dengan PDAC, kami mengkonfirmasi identifikasi
LRRC15
+ CAF ini
pada pasien manusia. Tanda tangan LRRC15
+

CAF digunakan untuk mengevaluasi dampaknya terhadap

respons imunoterapi anti-PD-L1 pada kohort pasien besar
dan mengungkapkan bahwa ekspresi tanda tangan LRRC15
+
CAF
yang tinggi dikaitkan dengan respons yang buruk terhadap
terapi anti-PD-L1 pada pasien yang dikecualikan dari kekebalan. tumor.
HASIL
PDPN
+
Sel Adalah Populasi Fibroblas Dominan
di Pankreas Murine Normal dan PDAC
Untuk mengkarakterisasi kompartemen stroma di PDAC, kami
mulai dengan mengoptimalkan kondisi pencernaan untuk
fenotip sel stroma dari pankreas murine, dimulai dengan protokol
untuk mengisolasi sel stroma dominan yang diketahui di pankreas ,
sel bintang. Pencernaan berbasis pronase sel stellata standar
(11) diamati untuk membelah banyak penanda permukaan,
sedangkan metode pencernaan baru kami mempertahankan ekspresi podoplanin
(PDPN) dan molekul adhesi sel endotel platelet 1
(PECAM1/CD31) (Gbr. 1A). Untuk memodelkan PDAC, kami
menggunakan tikus Pdx1 cre
/+
;LSL-Kras
G12D/+
;p16/p19
flox/flox
(KPP)
yang membentuk tumor agresif dalam 12 minggu (12). Meskipun
tumor dari tikus ini sering menunjukkan beberapa jenis karsinoma yang berbeda
, termasuk subtipe sarkomatoid, asinar, dan musinosa
, kami mengamati bahwa hingga 88% dari kohort tertentu
mengembangkan wilayah substansial PDAC seperti yang telah dilaporkan
sebelumnya (ref. 13, 14 ; Gambar Tambahan. S1A).
Sitometri aliran pankreas yang dipisahkan dari tikus KPP dan tikus
normal dari latar belakang B6 albino yang sama [B6(Cg)-
Tyr
c-2J
/J] mengungkapkan tiga populasi utama sel stroma
dengan komposisi serupa antara kedua keadaan (Gbr. 1B;
Gambar Tambahan. S1B). Sel stroma CD31
+ adalah sel endotel darah PDPN yang dominan dengan sel endotel limfatik yang sangat sedikit ( 15 ). Sel CD31 yang
tersisa sebagian besar adalah PDPN + dengan karakteristik fibroblas dan sel stellata (Gbr. 1B; Gambar Tambahan. S1C-
S1F). Mikroskop imunofluoresensi mengkonfirmasi keberadaan sel PDPN + di sekitar struktur di pankreas normal termasuk
kelompok asinar, saluran, dan pulau serta lapisan sel tunggal sel mesotel yang membungkus pankreas (Gbr. 1C, kiri;
Gambar Tambahan. S1G ). Tikus KPP menunjukkan peningkatan ekspresi PDPN, paling dramatis berbatasan pulau tumor,
tetapi juga di beberapa daerah distal tumor (Gbr. 1C, tengah dan kanan; Gambar Tambahan. S1H). Untuk lebih
mengkarakterisasi perubahan pada stroma nonendotel dengan perkembangan tumor, kami mengambil jaringan dari tikus
normal, tikus dengan tumor awal (<5 mm), dan tikus dengan penyakit lanjut (tumor >5 mm). Sel stroma pankreas diurutkan
pada sel CD31 PDPN + PDGFRA + dan CD31 PDPN ( DN) untuk RNA-seq dari dua populasi ini. Strategi ini digunakan untuk
mengecualikan sel mesothelial, yang juga PDPN + tetapi negatif untuk PDGFRA (ref. 16; Gambar Tambahan. S1I). Profil
transkripsi menegaskan bahwa PDPN + sel stroma diperkaya untuk gen tanda tangan fibroblas dan populasi DN untuk gen
tanda tangan perisit (ref. 17; Gambar 1D). Beberapa gen terkait CAF diperkaya dalam populasi PDPN + PDAC, meskipun
pada tikus Fap, Sma (Acta2), Fsp1, dan Pdgfrb, sering digambarkan sebagai gen penanda CAF, terdeteksi sampai tingkat
tertentu di kedua populasi stroma pada normal dan PDAC pankreas. Khususnya, kami menemukan bahwa Acta2 tertinggi
pada perisit normal dan Fap sama tingginya pada fibroblas normal (Gbr. 1E). Meskipun populasi yang diperkaya perisit juga
menunjukkan perubahan antara jaringan normal dan tumor , kami fokus pada populasi PDPN + karena mereka mewakili
konstituen CAF utama. RNA-seq Sel Tunggal Mengidentifikasi Beberapa Populasi PDPN + Sel Meskipun PDPN + sel stroma
merupakan mayoritas CAF, mereka mengekspresikan penanda CAF individu pada tingkat variabel antara ulangan [misalnya,
tingkat Il6 berkisar antara 60 hingga 240 pembacaan per kilobase transkrip per juta bacaan yang dipetakan (RPKM)], dan
selanjutnya mereka muncul untuk secara bersamaan mengekspresikan penanda yang dilaporkan untuk memisahkan
subset CAF, yaitu Acta2 dan Il6 (Gbr. 1E). Ini menyiratkan heterogenitas yang signifikan dalam PDPN + stroma. Untuk
mengatasi heterogenitas ini, kami melakukan sel tunggal RNA-seq (scRNA- seq) dari PDPN + sel stroma yang layak dari
pankreas KPP dan tikus normal. Untuk menangkap perubahan yang terjadi dengan perkembangan tumor dengan lebih baik,
kami membagi sampel KPP menjadi jaringan yang berdekatan dengan tumor serta sampel tumor kecil (1-4 mm) dan besar
(5-10 mm) untuk scRNA-seq (Gbr. 2A). Lima hewan dikumpulkan per kondisi di masing-masing dua ulangan biologis, dan
scRNA-seq dilakukan (Gbr. 2A). Setelah kontrol kualitas dan koreksi batch ( Gambar Tambahan S2A; dijelaskan dalam
Metode), kami memperoleh 13.454 sel berkualitas tinggi untuk analisis hilir (replikasi 1: n = 3.315; replikasi 2: n = 10.139).
Pengelompokan sel berbasis grafik setelah pengurangan dimensi dengan t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-
SNE; Gambar 2B) atau Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP; Gambar Tambahan S2B) mengidentifikasi
12 kelompok sel yang kuat (Tambahan Tabel S1) . Cluster sel endotel, myeloid, dan asinar mewakili sel yang terkontaminasi
sebagai anti-CD31, anti-CD45, dan anti-EPCAM, masing-masing, digunakan untuk mengeluarkan populasi tersebut dalam
protokol aliran kami sebelum pengurutan (3% dari semua sel, Gambar 2A-C; Gambar Tambahan S2C). Dalam sisa 97% sel,
83,5% sel diidentifikasi sebagai fibroblas, 11,5% diklasifikasikan sebagai sel tumor yang menjalani transisi epitel ke
mesenkim (EMT), dan 5,1% adalah sel mesotel. Semua cluster diwakili di kedua ulangan (Gbr. 2B-D). Cluster 5 dan 7 telah
kehilangan ekspresi Epcam tetapi mempertahankan ekspresi yang lebih tinggi dari beberapa keratin dan gen yang terkait
dengan asal epitel. Ini menunjukkan bahwa mereka mungkin adalah populasi tumor EMT (Gambar Tambahan S2D). Untuk
mengkonfirmasi tugas ini, kami mengidentifikasi Alcam sebagai gen yang diekspresikan secara unik oleh kelompok-
kelompok ini (Gbr. 2C). Flow cytometry mengkonfirmasi protein ALCAM diekspresikan oleh subset sel yang hanya
ditemukan di beberapa tumor besar. Isolasi dan sekuensing sel ALCAM + mengungkapkan ekspresi alel Kras G12 dengan
frekuensi alel varian 98% (Gambar Tambahan S2E), mengkonfirmasikannya Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232 /1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs dalam PDAC ARTICLE PENELITIAN FEBRUARI 2020 PENEMUAN KANKER |
235 Gambar 1. Ekspresi PDPN mengidentifikasi sebagian besar fibroblas jaringan pada pankreas normal dan yang
mengandung tumor. Ekspresi A, PDPN dan CD31 pada sel yang dicerna sesuai dengan protokol pronase sel stellata standar
(kiri) atau protokol pencernaan baru (kanan) dan diperkaya dengan sentrifugasi gradien, dipagari pada sel CD45 EPCAM
hidup . Ekspresi B, PDPN dan CD31 pada pankreas KPP GEMM normal atau yang mengandung tumor (kiri) dengan
kuantifikasi (kanan). Sel endotel darah (BEC) adalah PDPN CD31 + seperti yang disorot dalam plot kontur (hijau). C,
Pencitraan imunofluoresensi pewarnaan PDPN di pankreas normal (kiri; panah menyoroti contoh sel PDPN + di sekitar
kluster asinar) dan KPP GEMM di PDAC lanjut, baik di jaringan "distal" yang tidak langsung bersentuhan dengan tumor
(tengah) atau jaringan "proksimal", di mana sel-sel tumor terlihat menghubungi jaringan nontumor (kanan). Batang
timbangan, 50 m. D, Peta panas menunjukkan tingkat ekspresi gen relatif dari analisis RNA-seq dari PDPN + CD31 PDGFRa
+ stroma dan populasi DN yang menunjukkan sifat fibroblastik dari populasi PDPN + . E, Ekspresi gen terkait CAF terpilih
dalam populasi fibroblas masing-masing [log 2 (RPKM+1)]. Perbandingan statistik antara semua kelompok dilakukan
dengan uji Tukey; bar menunjukkan perbandingan berpasangan di mana P <0,05. Semua plot titik mewakili data flow
cytometry dari jaringan yang dipisahkan sel tunggal. A adalah perwakilan dari empat percobaan independen dengan 5
hewan dikumpulkan per kondisi. B, Data gabungan dari lima eksperimen independen dengan total n = 12 untuk normal dan
n = 25 untuk PDAC GEMM. Uji perbandingan berganda sidak digunakan untuk analisis statistik (***, P < 0,0005; ****, P <
0,0001). C, Gambar representatif dari normal n = 4 untuk PDAC GEMM n = 10. D, Untuk sampel normal n = 3-4, dengan 5
hewan dikumpulkan/sampel sekuens tunggal; untuk tumor n = 4 dengan 1-2 hewan dikumpulkan/sampel sekuens tunggal.
A CD31 PDPN Isolasi sel stellate baru Pengayaan sel stellata standar CD31 PDPN 96% 2% B PDPN DAPI Pankreas normal
PDAC distal PDAC proksimal D % gerbang stroma # sel/gram Normal PDAC C Fbn1 Pdgfra Dpt Dcn Lum Pdpn Fap Tcf21
Fnn1 Acta2 Nes Mcam Rgs5 Des Pdgfrb Cspg4 3 0 2 Fibroblast signature Pericyte signature 0 2 4 6 8 10 rPKM Log 2 Postn
P < 0,05 0 2 4 6 8 rPKM Log 2 Pdgfra P < 0,05 0 2 4 6 8 10 rPKM Log 2 Pdgfrb P < 0,05 0 2 4 6 8 rPKM Log 2 Fap P < 0,05 0 2
4 6 8 rPKM Log 2 Fsp1 P < 0,05 PDPN + PDAC PDPN + normal BEC normal BEC PDAC DN normal DN PDAC PDPN + PDAC
PDPN + DN normal DN PDAC PDPN + DN PDPN + DN BEC PDPN + DN BEC 0 20 40 60 80 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 **** ****
0 5 10 15 rPKM Log 2 Acta2 P < 0,05 0 2 4 6 8 10 rPKM Log 2 Il6 P < 0,05 0 2 4 6 8 rPKM Log 2 Cdh11 P < 0,05 0 5 10 15
rPKM Log 2 Col1a P < 0,05 E *** *** z-score Diunduh dari http://aacrjournals.org /cancerdiscovery/article-
pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022 Domingu ez dkk. PASAL PENELITIAN 236 | CANCER
DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org Gambar 2. Ekspresi PDPN adalah fitur dari beberapa populasi stroma. A,
Desain eksperimental dari eksperimen scRNA-seq. B, Kiri, t-SNE embedding dari 13.454 sel tunggal diurutkan dari n = 20
tikus di semua kondisi (tumor normal, berdekatan, kecil, dan besar). Cluster yang diidentifikasi melalui clustering berbasis
grafik ditunjukkan dengan warna. Benar, peta panas menunjukkan ekspresi rata-rata relatif dari gen yang diperkaya paling
kuat untuk setiap kluster yang diidentifikasi oleh perubahan log-lipat sel dalam kluster ke semua sel lain dalam kumpulan
data. Dua gen representatif disorot untuk setiap cluster. fEMT, EMT penuh; pEMT, sebagian EMT. C, penyematan t-SNE
seperti pada B; warna menunjukkan tingkat ekspresi yang dinormalisasi [log(CPM/100+1)] dari gen yang ditunjukkan. D,
Fraksi sel di setiap cluster (skor z per baris) dari setiap kondisi (kolom). Dua baris yang berdekatan per cluster
memvisualisasikan fraksi di setiap ulangan. E, Kiri, perbandingan ekspresi gen dari data RNA-seq massal antara sel
mesothelial normal dan fibroblas berdasarkan log 2 fold-change (sumbu x) dan log 10 (P adj ; limma). Gen yang diperkaya
dalam cluster 6 dari data scRNA-seq di B disorot dengan warna merah, gen yang diregulasi di cluster 3 dan 4 disorot
dengan warna hijau. Benar, peta panas dari ekspresi penanda relatif rata-rata untuk sel mesothelial yang diidentifikasi oleh
Xie dan rekannya (scRNA-seq) dan Buechler dan rekannya (bulk RNA-seq) dalam kelompok 0, 1, 2, 3, 4, 6, dan 8 dari B. F,
Fraksi sel fibroblas dari kelompok 0, 2, 8, dan 1 (sumbu y) pada jaringan yang berdekatan dengan tumor, jaringan dari tumor
kecil, dan jaringan dari tumor besar (sumbu x; kolom jumlah ke 1). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 1 0 % sel z-score 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 Jaringan fibroblas CAFs Prolif. Sel EMT Lainnya Normal Berdampingan Kecil Besar 0 Ly6c1 Pi16 Serpine2
Gpx3 Tagln Cthrc1 Tmem100 Dpp4 Smoc2 Col15a1 Crabp1 Crabp2 Upk3b Lrrn4 Krt8 Krt18 Cxcl1 Has1 Top2a Mki67 C1qb
Csf1r Pnlip Cpa1 Pecam1 1 z 3 zs- 0Cg Esam normal mouse Tyr c-2J /J Pdx1cre/+;LSL-Kras G12D /+; p16/p19 tikus
flox/flox n = 5 per ulangan n = 5 per ulangan CD45 yang layak , EPCAM , CD24a , CD31 , PDPN + Isolasi dan disosiasi Sortir
sel 10x Urutan Batch 1 Batch 2 Tumor 5-10 mm 1– 4 mm tumor Adj. jaringan tanpa tumor Bioinformatika Koreksi batch
Rekonstr . Analisis pengayaan Hewan −50 25 0 25 50 50 25 02550 t-SNE_1 t-SNE_2 n = 13.454 sel 4 3 1 0 8 2 CAFs
Jaringan Fibroblas 10 5 9 7 6 11 12 Sel yang berproliferasi Sel mieloid Sel mesotel Sel endotel Acinar sel fEMT sel tumor
pEMT sel tumor A B Cluster Normal Berdekatan Kecil Cluster Besar Replikasi 1 Replikasi 2 C D Penanda sel tunggal: Sel
mesothelial 510152025 Log 10 (P adj ) 10 50 5 Log 2 (perubahan lipatan) Sel mesothelial vs fibroblas Buechler et al.
Fibroblast E Berdekatan Kecil Besar 0.6 0 0.2 0.4 Fraksi sel fibroblas 8 2 0 1 F t-SNE_2 Pdpn Pdgfra Mki67 Msln t-SNE_2
Alcam (Cd166) Krt18 Log(CPM/100+1) 0 Max t-SNE_1 t-SNE_2 Csf1r Cpa1 6 ​3 401 2 8 Gsta3 Igfbp5 Igfbp6 Arhgap29
Atp1b1 Crip1 Cldn15 Tm4sf1 Gas6 Clu C2 Rspo1 Fgf1 Slc9a3r1 Ezr Nkain4 Krt19 Lrrn4 Slpi Lgals2 Upk3b Msln Gpm6a _ _ _
_ _ /aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs dalam PDAC ARTIKEL PENELITIAN FEBRUARI 2020 PENEMUAN KANKER |
237 identitas sebagai sel tumor. Cluster 6 diidentifikasi sebagai sel mesothelial berdasarkan penelitian sebelumnya dari
Buechler dan rekan, yang secara transkripsi memprofilkan sel-sel ini dan perbedaan transkripsinya ke fibroblas
menggunakan RNA-seq massal, serta Xie dan rekan, yang mengidentifikasi gen tanda tangan mereka dengan scRNA- seq
(16, 18). Gen yang diidentifikasi oleh kedua penelitian sebagai penanda sel mesothelial sangat diperkaya di cluster 6;
sebaliknya, 18 dari 20 gen yang paling diperkaya di cluster 6 juga diregulasi dalam sel mesothelial dibandingkan dengan
fibroblas di dataset Buechler dan rekan (Gbr. 2C dan E; Tabel Tambahan S2). Kami terutama mengamati sel-sel mesothelial
di jaringan normal dan normal yang berdekatan (Gbr. 2D). Cluster 0 hingga 4, 8, dan 9 diidentifikasi sebagai fibroblas
dengan ekspresi gen fibroblas tanda tangan mereka (Gambar Tambahan S2D). Dua kelompok fibroblas jaringan normal
(ntFib) yang berasal dari tikus normal (c3 dan c4), serta lima kelompok CAF, diidentifikasi (Gbr. 2B; Gambar Tambahan. S2B;
c0, c1, c2, c8, dan c9) . c0 dan c1 paling banyak terdapat pada jaringan yang berdekatan dengan tumor (∼88% dari CAF;
Gambar 2F). Sementara itu, frekuensi sel dari c8 dan terutama c2 meningkat dengan perkembangan tumor dan
mendominasi pada tumor stadium akhir (>70% dari semua CAF; Gambar 2F). Mengingat hilangnya ntFib dengan
perkembangan tumor, tetapi kedekatan fibroblas normal dan kluster CAF di ruang t-SNE dan UMAP, kami berhipotesis
bahwa heterogenitas pada awal mungkin berperan dalam pengembangan CAF selanjutnya. Pada Tikus, Dua Garis Fibroblas
Terpisah Berkoevolve selama Perkembangan Tumor Didorong oleh pengurangan dimensi TGFa dan IL1 UMAP dari ntFib
saja mengkonfirmasi dua populasi sel Pdpn + Pdgfra + utama (Gbr. 3A), dan kami mengidentifikasi profil transkripsi mereka
(Tambahan Gambar S3A;Tabel Tambahan S3). Populasi c3 mengekspresikan gen ECM yang terkait dengan fibril elastin dan
perlekatan ECM (misalnya, Emilin2, Mfap5, Fbn1) sedangkan populasi c4 dicirikan oleh ekspresi tinggi protein ECM yang
menunjukkan peran dominan dalam dukungan struktural melalui produksi dan pemeliharaan. pemeliharaan jaringan
kolagen dan membran basal (misalnya, Col4a1, Col6a6, Plc). Akibatnya, c4 menunjukkan ekspresi kolagen keseluruhan
yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan c3 (uji jumlah peringkat Wilcoxon <0,001; Gambar Tambahan. S3B).
Tren serupa diamati sehubungan dengan regulasi imun, dengan c4 menunjukkan pengayaan beberapa kemoatraktan imun
(termasuk Ccl11, Cxcl14, dan Cxcl16), sedangkan c3 menunjukkan pengayaan berbagai gen imunoregulasi [Thbd, Cd55,
Il33, Dpp4, dan Ackr3 (Cxcr7)]. Ekspresi gen yang tidak tumpang tindih menunjukkan aktivitas komplementer c3 dan c4.
Flow cytometry untuk DPP4 dan Ly6C, penanda untuk c3, dan ENG, penanda c4 (Tabel Tambahan S3), menegaskan bahwa
kedua populasi ini dapat diidentifikasi secara fenotipik (Gbr. 3B). Untuk menilai perubahan transkripsi selama
perkembangan tumor , pertama-tama kami melakukan analisis komponen utama (PCA) yang tidak memihak yang terdiri
dari semua sel CAF dan ntFib. PC1, komponen yang menjelaskan varians terkuat dalam kumpulan data, dengan jelas
memisahkan c4 ntFib dan c1 dan c2 CAF dari c3 ntFib dan c0 dan c8 CAF (Gbr. 3C, atas). Gen yang mendorong pemisahan
yang tidak bias ini sama ditemukan dalam uji ekspresi diferensial terawasi antara dua ntFibs c3 dan c4 (Gbr. 3C, bawah).
Analisis ini sangat menyarankan hubungan garis keturunan antara CAF dan fibroblas yang sudah ada sebelumnya di
jaringan. Untuk menyelidiki ini lebih lanjut, kami menghitung skor untuk setiap sel CAF berdasarkan gen tanda tangan
ontogeni fibroblas normal (Gambar Tambahan S3C), yang memungkinkan penelusuran populasi CAF kembali ke nenek
moyang mereka yang tidak ganas (Gambar 3D; Gambar Tambahan. S3C) . c3 dan c4 ntFibs memiliki lintasan diferensiasi
terpisah selama progresi tumor , dengan c4 menimbulkan c1 CAF, yang secara dominan menimbulkan c2 CAF; sementara
itu, c3 ntFibs memunculkan c0 CAFs, yang kemudian secara dominan berkembang menjadi c8 CAFs (Gbr. 3D, kanan; Gbr.
3E). Kami menemukan c9, sangat dicirikan oleh ekspresi penanda proliferasi yang tinggi (Mki67, Top2a), terbagi menjadi
dua kelompok dalam ruang UMAP (Gambar Tambahan S2B), satu sejajar dengan sel tumor EMT, yang lainnya sejajar
dengan c2 CAF. Sel-sel CAF-proksimal yang berkembang biak juga menunjukkan skor c4 ntFIB yang lebih tinggi,
menjelaskan perluasan yang diamati dari keturunan garis keturunan ini dengan progresi tumor (Gambar Tambahan S3D).
Dengan demikian kami menyimpulkan bahwa sel-sel nontumor dari c9 sebagian besar merupakan subset c2 CAF yang
berkembang biak. Lintasan untuk dua populasi fibroblas terpisah dikonfirmasi dengan analisis pseudotime untuk masing-
masing garis keturunan (ref. 19; Gambar 3F). Membandingkan ekspresi gen ECM dan gen pengatur kekebalan terpilih di
semua kelompok CAF mengungkapkan pergeseran transkripsi yang tajam dalam pemrograman c2 dan c8 (Gbr. 3G). Dalam
transisi dari c4 ntFib, ada kehilangan yang signifikan dari komponen membran basal (misalnya, kolagen tipe IV dan tipe VI)
dengan peningkatan drastis kadar beberapa kolagen fibrilar di c2 (Gbr. 3G), menunjukkan peningkatan dan reorganisasi
deposisi kolagen fibrilar (20, 21). CAF yang berasal dari c3 juga meningkatkan ekspresi gen ECM, khususnya kolagen fibril
(Gbr. 3G, atas), tetapi perubahan paling dramatis yang diamati dengan perkembangan tumor adalah pada ekspresi kemokin
dan sitokin (Gbr. 3G, bawah) seperti upreg - ulasi Cxcl9/10, Cxcl1, dan Ccl2, yang kemungkinan merekrut populasi myeloid
melalui CXCR2 dan CCR2 serta sitokin pleiotropik seperti IL6 (22-24), terutama pada fibroblas stadium lanjut (Gbr. 3G).
Menariknya, meskipun ada perbedaan tingkat ekspresi antara CAF c2 dan c8, kami juga melihat peningkatan ekspresi gen
yang mengkode faktor yang diketahui mendukung kelangsungan hidup sel tumor dan metastasis, seperti Timp1, Vegf, Il11,
Lif, dan Pdgf (25- 29), yang meningkat di kedua garis keturunan (Gbr. 3G). Selain itu, dengan perkembangan tumor kedua
garis keturunan memperoleh ekspresi gen regulator imun potensial seperti peningkatan ekspresi Mif dan Timp1, yang dapat
mendorong infiltrasi sel supresor yang diturunkan dari myeloid dan sel T regulator di PDAC (30, 31). Jadi, meskipun setiap
garis keturunan tampaknya memiliki fungsi khusus yang dicerminkan oleh perbedaan dalam tanda tangan gen mereka,
mereka juga berbagi beberapa program yang sama. Untuk menyelidiki lebih lanjut sinyal yang mendorong perbedaan antara
kedua garis keturunan, kami menanyakan promotor gen tanda tangan mereka (Tabel Tambahan S1) untuk situs pengikatan
faktor transkripsi. Analisis ini mengungkapkan pengayaan yang kuat dari situs pengikatan NFkB di promotor gen spesifik
c8, sedangkan gen spesifik c2 menunjukkan pengikatan SMAD3 Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232 /1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Dominguez dkk. PASAL PENELITIAN 238 | PENEMUAN KANKER FEBRUARI 2020 AACRJournals.org c4 c3 4 0 4

8
2468
UMAP1
UMAP2
ENG
DPP4
PDPN
+
fibroblas Dpp4
2468
UMAP1 UMAP1
Eng
2468
c3
c4
UMAP2
2468
0
4
8
UMAP1
C
0.00
0.05
0.10
−30 −20 10 01020
PC1
Kepadatan sel
3
8
0
2
1
4
Ser pine2
Col15a1
Sparcl1
Col4a32
Col4a Sema3c Ly6c1 Cd248 Ackr3 0,06 -0.06 0 Pemuatan PC1 D 50 25 0 25 50 50−25 02550 t-SNE_2 50 25 02550 0.0 1.0
2.0 308214 0.5 0.5 1.5 c3 Skor 0.0 1.0 2.0 0.5 0.5 1.5 Skor c4 1 308214 c3 Score 50 25 0 25 50 t-SNE_2 c4 Score 12 Score A
E Pseudotime 2 −1 0 1 2 3 5 05 10 Komponen 1 Komponen 2 c4 Silsilah F 2 1 0 1 2 10 −50 5 Komponen 1 Komponen 2 c3
Lineage Pseudotime SP1 NFκB RELA MZF1_1-4 SMAD3 MZF1_5-13 01020 Enrichment z-score c8 CAF c2 CAF Log 10 (P
adj ) Respon seluler terhadap IL1 Respon seluler terhadap TNF Adhesi sel terhadap sitokin Respon seluler terhadap TGFβ
Organisasi fibril kolagen c8 CAF c2 CAF 02 4 6 02 4 6 J 4 B G 1: CAF awal 2: CAF akhir 4: Fib normal. 0: CAF awal 8: CAF
akhir 3: Fib normal. HI ENG Ly6C Cluster Cluster 241 8 30 Sparcl1 Col15a1 Cxcl14 Serpine2 Col4a2 Eng Dpp4 Ackr3 Cd248
Sfrp2 Ly6c1 Scara3 −1 01 z-score Cluster c3 c3 c4 c4 1 0 1 z-score 1 0 −1 z- score Lfap1 z - score Tmem100 Efhd1 Ly6c1
Sfrp4 Il33 Ackr3 Pcolce2 Plpp3 Ly6a Fbn1 Cd248 Smpd3 Sema3c Anxa3 Ano1 F11r Stk26 Esam Lgals7 Krt8 Cav1 Cldn10
Myrf Nkain4 Slc9a3r1 Cxadr Gpm6a Lsr Pkhd1l1 Upk1b Tmem151a Lrrn4 Lpl Col4a1 Cxcl12 Abca8a Ptn Mgp Cygb G0s2
Col4a2 Ifitm1 Crispld2 Smoc2 Emp1 Cxcl14 Bgn Sparcl1 Hsd11b1 Col15a1 Spry1 Serpine2 1 0 1 Meso normal. apCAF
Normal c3 Normal c4 myCAF iCAF Normal c4 fib. gen Meso. gen normal c3 fib. gen Dominguez et al., WT B6(Cg)-Tyr c-2J
/J z-score 4 1 2 3 0 8 Timp2 Col14a1 Mmp3 Col5a3 Col4a4 Col4a3 Col6a2 Col6a6 Col4a2 Col6a3 Col4a1 Timp3 Mmp11
Col8a1 Col12a1 Col6a2 Col6a6 Col4a2 Col6a3 Col4a1 Timp3 Mmp11 Col8a1 Col12a1 Mmp14 Col8 Col7a1 Mmp7 Col28a1
Col3a1 Col1a2 Col1a1 Timp1 Col24a1 Col5a2 Mmp8 Il17d Ccl11 Il12a Ccl8 Ccl3 Pdgfc Vegfa Il33 Il18 Ccl9 Cxcl5 Ccl7 Ccl4
Lif Ccl24 Ccl12 Ccl6 Ccl2 Il6 Cxcl9 Cxcl2 Cxcl10 Csf2 Cxcl3 Cxcl1 Tgfb3 Spp1 Ccl17 Cxcl16 Il1a Il11 Mif Pdgfa 4 1 2 3 0 8
Cluster 2 1 0 .5 z - score Col4a1 Pxdc1 Tns1 Adam12 Hsbp1 Adam19 Sh3pxd2a Fstl3 Tpm1 Ctgf Sema7a Actg2 Cnn1
Acta2 Tagln Igfbp3 Tgfbi 4 1 2 3 0 8 .5 01 Il6 Cxcl1 Ccl2 Tgfly 4 1 2 3 0 8 Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs di PDAC RESEARCH ARTICLE FEBRUARI 2020 PENEMUAN KANKER | 239
pengayaan situs (Gbr. 3H). Analisis pengayaan jalur mendukung prediksi ini, menyarankan pensinyalan melalui IL1 dan
TNFα sebagai pendorong tanda tangan transkripsi c8 dan aktivasi c2 yang digerakkan oleh TGF (Gbr. 3H). Selanjutnya, kami
mengamati pengayaan kuat tanda tangan gen fibroblast TGFβ (32) dalam sel c2, selanjutnya memvalidasi TGF sebagai
pendorong utama fenotipe c2 (Gbr. 3I, kiri). Menariknya, tanda tangan transkripsi mereka menunjukkan bahwa populasi ini
mungkin mempromosikan program mereka sendiri; sedangkan sel c8 mengekspresikan IL1α dan profil kemotaktiknya
menunjukkan interaksi parakrin dengan sel myeloid, yang juga dapat menjadi sumber utama IL1 dan TNF (Gbr. 3I, kanan;
ref. 33-35), c2 menunjukkan ekspresi Tgf b1 dan Tgf b3 (Gbr. 3I). Untuk mengkonfirmasi validitas model evolusi fibroblas
kami, kami membandingkan tanda tangan ekspresi kami dengan data yang diperkaya fibroblas yang diterbitkan
sebelumnya dari tikus KPC (36). Pengelompokan UMAP mengidentifikasi sekelompok sel Pdpn + Pdgfra + yang dapat
dibedah menjadi tiga subkluster yang berbeda ( Gambar Tambahan S3E): satu kluster sel Ly6a/c1 + , yang sebelumnya
digambarkan sebagai “iCAFs,” satu kluster sel Col15a1 + , yang sebelumnya digambarkan sebagai "myCAFs," dan satu
cluster dengan tingkat Cd74, H2-Ab1, dan Saa3 yang tinggi, yang sebelumnya digambarkan sebagai "apCAFs." Ketika kami
membandingkan tingkat ekspresi rata-rata dari dua program garis keturunan fibroblas normal kami dengan kelompok-
kelompok ini, kami menemukan bahwa myCAFs secara jelas mengelompok dengan fibroblas c4 kami dan iCAFs dengan
fibroblas c3, mengkonfirmasikan bahwa hierarki garis keturunan juga ada dalam model KPC (Gbr . .3J). Khususnya, apCAF
berkerumun dengan sel mesothelial c6 dari pankreas normal (penanda, Tabel Tambahan S3). Dengan demikian, IL1 c8
CAFs menunjukkan profil ekspresi yang paling mirip dengan iCAFs, TGF c2 CAFs berkerumun dengan myCAFs, dan sel-sel
mesothelial c6 berkerumun dengan apCAFs (Tambahan Gambar. S3F). Model Tikus dari PDAC Identifikasi LRRC15 sebagai
Penanda CAF c2 Berbasis TGFa Kami sangat tertarik untuk mengkarakterisasi c2 lebih lanjut karena meningkat dengan
perkembangan tumor, mendominasi kompartemen CAF pada tumor stadium akhir (Gbr. 2F), dan karena terkait TGFβ
stroma berkorelasi dengan prognosis yang buruk (32, 37). Oleh karena itu, kami berusaha mengidentifikasi penanda yang
membedakan CAF c2 yang digerakkan oleh TGF dari subset stroma fibroblas lainnya di PDAC. Data RNA-seq massal dari
tumor tahap awal dan akhir PDPN + CAF mengidentifikasi Lrrc15 sebagai salah satu gen yang paling berbeda diekspresikan
antara CAF dan ntFIB (Gbr. 4A). Lrrc15 mengkodekan molekul yang mengandung domain transmembran yang
diekspresikan dalam stroma beberapa tumor manusia dan diregulasi oleh TGFβ (38). Gen referensi silang yang diperkaya
dalam c2 yang digerakkan TGFβ ke atlas protein yang secara eksperimental diidentifikasi berada di permukaan sel (39)
selanjutnya memvalidasi Lrrc15 menjadi gen c2 yang sangat diperkaya yang mengkode protein permukaan ( Gambar
Tambahan S4A). Kehadiran sel LRRC15 + PDPN + dengan morfologi fibroblas di pankreas yang mengandung tumor
dikonfirmasi dengan mikroskop imunofluoresensi; Sel LRRC15 + biasanya ditemukan di sarang di seluruh pankreas yang
mengandung tumor di sekitar sel tumor di KPP GEMM (Gbr. 4B). Kami selanjutnya menggunakan model PDAC subkutan,
menggunakan garis sel yang berasal dari KPP GEMM (KPP14388). Karakterisasi injeksi panggul sel tumor 100K
menunjukkan tumor dengan komposisi stroma yang mirip dengan tikus KPP (Gambar Tambahan S4B). Mikroskop
imunofluoresensi mengungkapkan banyak sel LRRC15 + PDPN + pada tumor subkutan yang berasal dari garis KPP PDAC
(Gbr. 4C). Analisis flow cytometry menunjukkan bahwa LRRC15 menandai sebagian besar sel PDPN + stroma, dan sebagian
besar tidak ada pada populasi sel lain di lingkungan mikro tumor (TME; Gambar 4D). Khususnya, LRRC15, tidak seperti
banyak penanda CAF lainnya, juga tidak ada pada stroma kelenjar getah bening serta pankreas normal ( Gambar Tambahan
S4C). Karena kedekatannya dengan pulau tumor, kami memutuskan untuk menilai apakah LRRC15 + CAF dapat secara
langsung meningkatkan pertumbuhan tumor . Kami menghasilkan garis KPP yang mengekspresikan reseptor toksin difteri
(DTR) yang memungkinkan kami untuk menghilangkan sel tumor sisa dan mengkultur CAF yang diisolasi dengan
penambahan toksin difteri. Dua ribu sel tumor KPP-mApple ditumbuhkan sendiri atau dalam kultur bersama dengan
LRRC15 + CAFs dibandingkan dengan LRRC15 Ly6C + CAFs atau c3 dan c4 ntFIBs dan dinilai kemampuannya untuk
mendorong pertumbuhan spheroid dalam kultur 3-D. Spheroid tumor yang dikultur dengan populasi fibroblas mana pun
tumbuh lebih besar daripada yang di media saja. Hal ini menunjukkan bahwa semua fibroblas yang diuji dapat secara
langsung meningkatkan pertumbuhan tumor (Gbr. 4E). Meskipun kita tidak dapat mengesampingkan bahwa spheroids itu
sendiri memprogram ulang fibroblas seperti sebelumnya Gambar 3. Dua fibroblas jaringan normal mengikuti dua lintasan
diferensiasi terpisah yang didorong oleh IL1 dan TGFβ. A, Kiri, UMAP embedding sel dari pankreas normal. Warna dan
angka menunjukkan kerapatan titik (abu-abu, rendah; biru, rendah/sedang; merah, sedang/tinggi; kuning, tinggi). Tengah,
warna menunjukkan keanggotaan cluster. Benar, warna menunjukkan ekspresi gen penanda. B, Plot sitometri aliran
representatif dari fibroblas yang terjaga keamanannya pada PDPN + fibroblas hidup dari pankreas tikus normal yang
diwarnai untuk DPP4 dan endoglin (ENG) atau Ly6c dan ENG . C, Atas, distribusi kepadatan sel dari kelompok fibroblas
individu (warna) di sepanjang komponen utama pertama PCA. Bawah, pemuatan gen PC1 disorot dalam Gambar
Tambahan. S3A. D, Kiri, t-SNE dari Gambar. 2B terbatas pada fibroblas. Warna menunjukkan skor ekspresi gen penanda
untuk dua populasi dari pankreas normal yang ditunjukkan pada A. Kanan, plot kotak menguraikan distribusi skor di setiap
cluster. E, Peta panas memvisualisasikan ekspresi rata-rata relatif dari gen yang ditunjukkan (baris) dalam kelompok
fibroblas (kolom). Lintasan pseudotime F, Top, Monocle 2 dari fibroblas normal c4 dan CAF turunan c4. Sel diwarnai oleh
cluster. Bawah, sama seperti atas, tetapi untuk fibroblas normal c3 dan CAF turunan c3. G, Peta panas memvisualisasikan
ekspresi rata-rata relatif dari gen penyandi ECM (atas) dan kemokin/sitokin (bawah) di 6 kluster fibroblas utama (baris).
Kolom-kolom dikelompokkan menggunakan complete linkage clustering dan Euclidean distance sebagai ukuran jarak. H,
Kiri, analisis pengayaan motif faktor transkripsi dalam promotor (±10 kb situs awal transkripsi) gen khusus untuk populasi
CAF c2 dan c8. Benar, analisis pengayaan jalur untuk gen khusus untuk kluster CAF 8 (atas) dan 2 (bawah). I, Kiri, peta
panas memvisualisasikan ekspresi rata-rata relatif gen dari tanda tangan F-TBRS di seluruh kluster fibroblas. Kolom di-
cluster dengan complete linkage clustering menggunakan jarak Euclidean. Benar, ekspresi rata-rata relatif dari gen yang
ditunjukkan (kolom) dalam kelompok CAF (baris). Kolom di-cluster dengan complete linkage clustering menggunakan jarak
Euclidean. J, Peta panas membandingkan ekspresi rata-rata relatif gen penanda (baris) dari kluster fibroblas normal 3 dan
4, serta sel mesotel normal antara iCAF, myCAF, apCAF, fibroblas normal c3, fibroblas normal c4, dan sel mesotel normal
(baris ). Baris dan kolom dikelompokkan dengan pengelompokan linkage lengkap menggunakan jarak Euclidean sebagai
ukuran jarak. Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada
26 September 2022 Dominguez et al. PASAL PENELITIAN 240 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org
Gambar 4. CAF responsif TGF dapat diidentifikasi dengan ekspresi LRRC15. A, Log 2 kali lipat perubahan ekspresi gen (titik)
antara fibroblas normal dan PDPN + PDAC CAF awal (sumbu x) dan fibroblas normal dan PDAC CAF tahap akhir (sumbu y).
Gen signifikan [P adj <0,1 dan absolut (log 2 FC)> 1] ditunjukkan dengan warna biru, gen signifikan hanya pada CAF tahap
akhir berwarna hijau, dan hanya pada CAF awal berwarna merah. B, Gambar imunofluoresensi ekspresi PDPN (hijau),
LRRC15 (putih), EPCAM (merah), dan DAPI (biru) pada pankreas KPP GEMM yang mengandung tumor; panah kuning
menyoroti contoh cluster LRRC15 + . C, Gambar imunofluoresensi ekspresi PDPN (hijau), LRRC15 (putih), EPCAM (merah),
dan DAPI (biru) pada tumor KPP subkutan yang menunjukkan PDPN + LRRC15 + fibroblas. D, Plot representatif yang
menunjukkan pewarnaan LRRC15 dengan flow cytometry di gerbang PDPN + fibroblast (kiri), kuantifikasi sel LRRC15 +
berdasarkan frekuensi populasi dan jumlah yang dinormalisasi ke bobot dalam model KPP sc. E, Atas, gambar representatif
dari sumur tunggal (dari pelat 24-sumur) spheroid KPP-mApple setelah 12 hari kultur 3-D. Spheroids KPP-mApple dikultur
sendiri atau dikultur bersama dengan populasi fibroblas yang ditunjuk. Bawah, kuantifikasi total area mApple + spheroids
per sumur keseluruhan dari waktu ke waktu. Data ini digabungkan dari dua eksperimen independen; untuk setiap percobaan
n = 4 sumur/kondisi. Uji perbandingan berganda Dunnett, membandingkan tumor saja dengan semua kondisi lain,
menunjukkan perbedaan yang signifikan (****, P <0,0001) untuk semua kondisi. PDPN CAF DN BEC CD45Tumor 0 20 40 60
80 Untuk semua P < 0,05 A Lrrc15 Log FC PDAC terlambat vs. sehat Log FC PDAC awal vs. sehat Masuk. berbeda kedua
perbandingan Tanda. bedanya cuma telat PDAC Sign. berbeda hanya awal PDAC KPP GEMM DAPI PDPN EPCAM LRRC15 B
KPP subkutan DAPI PDPN EPCAM LRRC15 C Subkutan KPP, gated on PDPN + CAF LRRC15 PDPN Isotipe PDPN % LRRC15
+ Sel melebihi isotipe # dari LRRC15 + Sel/g 0,05,0 × 10 5 1,0 × 0,05,0 × 10 5 10 6 1.5 × 10 6 2.0 × 10 6 2.5 × 10 6 2.0 × 10 7
1.5 × 10 7 1.0 × 10 7 5.0 × 10 7 0.0 Untuk semua P < 0,005 PDPN CAF DN BECCD45Tumor D LRRC15 + CAF + KPP c4
Fibroblast + KPP KPP sendiri Hari 12 Ly6C + + KPP E 05 10 15 Hari dalam kokultur Total area (μm 2 ) Tumor KPP LRRC15 +
c2 CAF + KPP Ly6C + CAF c0/c3 + KPP c3 Fibroblast + KPP c4 Fibroblast + KPP c3 Fibroblast + KPP * *** Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs di PDAC ARTIKEL PENELITIAN FEBRUARI 2020 PENEMUAN KANKER | 241
melaporkan (40), ini menunjukkan bahwa posisi in situ spesifik LRRC15 + CAF di sebelah pulau tumor mungkin menjadi
salah satu kunci untuk peran mereka dalam ceruk protumor, daripada kemampuan unik untuk mendorong pertumbuhan
tumor. Eksperimen ini juga merupakan uji fungsional tunggal; mengingat perbedaan transkripsi unik antara populasi
fibroblas, kita mungkin mengharapkan perbedaan fungsional di area lain, seperti regulasi kekebalan. LRRC15 + CAFs Hadir
dalam Sampel PDAC Manusia Untuk menerjemahkan temuan kami dari model tikus menjadi kanker manusia, kami
menganalisis ulang data dari studi scRNA-seq pasien manusia dengan PDAC yang baru-baru ini diterbitkan, oleh Peng dan
rekan (41). Setelah kontrol kualitas dan penyaringan, kami mempertahankan 84.276 sel dari 22 pasien untuk analisis hilir.
Pengelompokan dalam ruang yang dikurangi dimensi mengungkapkan 12 kelompok dari 11 jenis sel utama (Gbr. 5A; Tabel
Tambahan S4). Semua kelompok terdiri dari sel- sel dari lebih dari 8 pasien (Gbr. 5B). Untuk mengkonfirmasi penugasan sel
tumor kami dan dengan ekstensi memastikan bahwa penugasan fibroblas kami tidak termasuk sel tumor yang telah
menjalani EMT, kami mengumpulkan tiga jalur bukti independen. Pertama, kami mengkonfirmasi hanya sel di cluster 0 yang
positif untuk mRNA dengan mutasi missense KRAS G12 (Gbr. 5A). Kedua, analisis ulang dari studi mikrodiseksi terpisah
yang tersedia untuk umum (42) menunjukkan bahwa hanya penanda untuk sel tumor (cluster 0) yang diperkaya dalam
jumlah besar RNA-seq dari sampel tumor mikrodiseksi dibandingkan dengan sampel dari stroma mikrodiseksi atau
pankreas kontrol nonmalignant ( Gambar 5C). Ketiga, kami mengidentifikasi varian jumlah salinan skala besar dalam sel
dari kluster 0, tetapi bukan sel dari kluster CAF (Gambar Tambahan S5A). Setelah mengkonfirmasi asal nontumor dari
populasi yang diidentifikasi sebagai sel CAF, kami secara khusus berfokus pada klaster ini. Subclustering dari 8.931
fibroblas mengungkapkan tiga himpunan bagian yang berbeda (Tabel Tambahan S5): 52% sel menyatakan tingkat tinggi
penanda CAF TGFβ c2 TAGLN dan LRRC15, 3% sangat diperkaya dalam penanda IL1 c8 CAF HAS1 dan CCL2 (Gbr. 5D ), dan
44% sel menyatakan tingkat C7 dan CFD yang tinggi. LRRC15 juga sangat diekspresikan dalam RNA-seq massal dari
stroma mikrodiseksi dibandingkan dengan tumor atau sampel kontrol normal, menunjukkan bahwa populasi ini Sel A
dengan mutasi KRAS yang terdeteksi 5 3 1 2 4 0 7 10 8 11 6 9 15 10 5 0 5 10 10 01020 UMAP_1 UMAP_2 FXYD3 AGR2
TRAC CD3D HLA − DRA C1QA RGS5 PDGFRB PLVAP PECAM1 LUM DCN FXYD2 CLU CD79A MZB1 IGHA1 CPA1 PNLIP
NEUROD1 NKX2−2 TPSB2 MS4A2 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1 11 n = 84.276 sel 2 2 Tumor Stroma Normal z-score B C FXYD2
SFRP5 AMBP CLU FXYD3 AGR2 TFF1 SLPI DCN LUM COL1A1 MMP2 0123456789 1011 0 10 20 # Pasien Cluster Tumor
Stroma Normal Stroma Tumor Normal 0 2 4 6 8 10 LRRC15 Log 2 (CPM+1) z-score sel T Sel B Sel B Endotel Perisit
Fibroblas Endokrin Ductal Acinar Tumor Mast Mac/Mono CFD 1 1 LRRC15 TAGLN COL11A1 C7 PTGDS HAS1 IL6 CCL2 0 1
2 HAS1 0 1 2 3 4 Log 2 (CPM+1) D z-score 5 06 Cluster sig. gen E F 0,0 2.5 5.0 7.5 10,0 C0 C1 C2 Rata-rata. ekspresi di
stroma mikrodiseksi Cluster gen sig. 6 3 0 3 6 50 5 UMAP_1 UMAP_2 0 1 2 n = 8.931 sel Gambar 5. TGFβ-responsive
LRRC15 + CAFs adalah populasi fibroblas yang paling sering pada PDAC manusia. A, Kiri, UMAP embedding dari 84.276 sel
berkualitas tinggi dari 22 pasien dengan PDAC. Cluster yang diidentifikasi melalui clustering berbasis grafik ditunjukkan
dengan warna. Sel dengan variasi nukleotida tunggal KRAS yang teridentifikasi dari pembacaan scRNA-seq disorot dalam
warna oranye. Label untuk setiap cluster diidentifikasi dengan penanda di sebelah kanan. Benar, peta panas menunjukkan
ekspresi rata-rata relatif dari gen yang paling diperkaya untuk setiap kluster yang diidentifikasi dengan perubahan log lipat
sel dalam kluster ke semua sel lain dalam kumpulan data. Dua gen representatif disorot untuk setiap cluster. B, Plot batang
mewakili jumlah pasien yang menyumbang setidaknya 10 sel ke kluster yang diberikan dalam A. C, Ekspresi relatif gen
penanda untuk kluster 0, 5, dan 6 dari A dalam sampel RNA-seq massal dari tumor yang didiseksi mikro (n = 65), stroma (n
= 122), dan pankreas normal (n = 247). D, Kiri, penyematan UMAP dari 8.931 sel fibroblas. Cluster yang diidentifikasi melalui
clustering berbasis grafik ditunjukkan dengan warna. Benar, peta panas menunjukkan gen yang paling diperkaya untuk
setiap cluster yang diidentifikasi oleh uji jumlah peringkat Wilcoxon, semuanya P <1e-10. Tiga gen representatif disorot
untuk setiap cluster. E, Distribusi ekspresi LRRC15 (kiri) dan HAS1 (kanan) dalam data RNA-seq massal dari 65 tumor, 122
stroma, dan 247 sampel normal. F, Ekspresi rata-rata (± SEM) gen tanda tangan dari D dalam 122 sampel RNA-seq massal
PDAC stroma mikrodiseksi. (bersambung ke halaman berikutnya) Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Dominguez et al. PASAL PENELITIAN 242 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org Gambar 5. (Lanjutan)
G, Gambar representatif IHC dari sampel pasien PDAC (1 dari 70; lebih banyak gambar di Gambar Tambahan. S5B). Ungu,
pewarnaan LRRC15; biru, counterstaining nuklir; coklat, pewarnaan CD8. Garis putus-putus membatasi pulau tumor. Panah,
sel CD8 + T. Bilah skala, 200 m. H, Plot sitometri aliran representatif dari sel mesenkim, berpagar pada sel EPCAM , CD45 ,
CD31 hidup dari jaringan PDAC yang diwarnai untuk LRRC15 dan EPCAM. I, Peta panas memvisualisasikan ekspresi rata-
rata relatif dari penanda IL1 CAF tikus dan penanda TGFβ CAF tikus dan homolognya masing-masing pada manusia di
seluruh CAF IL1 manusia dan tikus, fibroblas normal manusia dan tikus, serta TGFβ CAF manusia dan tikus (baris). Baris
dan kolom dikelompokkan menggunakan complete linkage clustering dan Euclidean distance sebagai ukuran jarak. Gen
perwakilan untuk masing-masing dari dua kelompok utama disorot dan diwakili oleh simbol gen manusia mereka. J, Atas,
plot sebar membandingkan ekspresi rata-rata gen dalam kluster sel tunggal fibroblas 5 dari pankreas normal (Gambar
Tambahan S5D) dengan ekspresi rata-rata kluster CAF 1 dari D. Bawah, peta panas memvisualisasikan ekspresi rata-rata
relatif dari yang ditunjukkan gen (baris) dalam kelompok CAF tikus dari Gambar. 2B. Kolom-kolom dikelompokkan
menggunakan complete linkage clustering dan Euclidean distance sebagai ukuran jarak. K, PCA fibroblas normal dari
Gambar Tambahan 5D dalam warna ungu dan CAF manusia yang diwarnai oleh kluster dari D. Titik dan garis putus-putus
mewakili pohon rentang minimum berbasis kluster. L, Representasi skematis dari evolusi fibroblast PDAC tikus dan
manusia. Persegi panjang membatasi berbagai tahap perkembangan tumor; ungu, stadium tidak ganas*; oranye, tahap
awal perkembangan tumor; merah, stadium tumor yang sudah mapan. Protein yang ditunjukkan telah divalidasi sebagai
penanda yang mengidentifikasi populasi masing-masing; gen yang ditampilkan termasuk yang paling kaya secara signifikan
untuk populasi itu. Saat ini, kami tidak dapat mengidentifikasi semua populasi dengan penanda protein. Diagram lingkaran
menunjukkan frekuensi populasi CAF yang ditemukan pada tumor lanjut untuk tikus, dan secara keseluruhan pada sampel
tumor PDAC pasien berdasarkan percobaan scRNA-seq yang dijelaskan pada Gambar. 2 dan 5. *Pada tikus, ini adalah garis
dasar jaringan normal; pada manusia jaringan kontrol berasal dari pasien dengan tumor duodenum, tumor saluran empedu,

atau tumor pankreas nonmalignant yang dinilai oleh ahli patologi sebagai "tidak ada peradangan yang terlihat" (41).
Nonmalignant* Tumor awal Tumor
yang terbentuk eCAF2 25%
TGFβ CAF 55%
eCAF 8%
CAF1 12%
eCAF 44%
CAF1 3% TGFβ CAF 52%
TGFβ IL1 TGFβ IL1
ntFib1 ntFib2 meso
eCAF2
(c1)
eCAF
(c1)
eCAF2
(c0)
IL1 CAF
(c8)
TGFβ CAF
(c2)
IL1 CAF
(C2)
TGFβ CAF
(C0)
NM Fibmeso
DPP4
+
Ly6C
+
PDGFRa
+
ENG
+
PDGFRa
+
DPP4
+/−
Ly6C
+
PDGFRa
+
ENG
+/−
ENG
+
PDGFRa
+
Ly6C
+
PDGFRa
+
IND
+/−
Has1
+
Cxcl1
+
LRRC15
+
PDGFRa
lo
Col11a
+
Acta2
+
Semua fibroblas PDPN
+
FAP
+
Lum
+
Dcn
+
Semua fibroblas LUM
+
DCN
+
PDPN
hi
PDGFRa DPP4 hi MHCII
+ CD74 + Tidak dalam kumpulan data saat ini LRRC15 + COL11A + ACTA2 + FAP + CD74 hi HLA-DRA + Keduanya eCAF
Col1a1 + Col3a1 + Timp1 + PDPN FAP ENG + C7 + K Nonmalig . Awal C1 CAF TGFβ C0 CAF IL1 C2 CAF HAS1 + CXCL1 +
CCL2 + FAP + CD74 hi HLA-DRA + CD74 + HLA-DRA lo COL1A1 + COL3A1 + TIMP1 + FAP + (C3) (C4) (C6) ENG + C7 + GI J
Nonmalignant hCluster 1 Human PCC = 0.97 COL1A1 COL1A2 COL3A1 SPARC TIMP1 DPT CFD PTGDS C7 Timp1 Col1a1
Col3a1 Sparc 34 01 28 Norma. 1 Kecil Besar msCluster Mouse L −1 0 1 z-score Mouse Manusia TAGLN ACTA2 SDC1
LRRC15 COL8A1 INHBA FZD1 MMP11 CTHRC1 IL1R1 IL6 LIF CXCL1 CCL2 HAS1 HAS2 Mouse IL1 Penanda CAFMouse
TGFβ CAFs markers IL35.7 CAF MAILz 0 0 44.3 0 20 40 60 80 Gerbang stroma EPCAM CAF Epcam + CD45 + LRRC15 %
LRRC15 positif H 60 40 20 02040 20 0 20 40 PC_1 PC_2 menonjol pada stroma PDAC (Gbr. 5E). Sebaliknya, kami
menemukan HAS1 rendah diekspresikan di seluruh tumor, stroma, dan sampel nonmalignant dan diperkaya hanya sebagian
kecil sampel stroma mikrodiseksi, kemungkinan hanya mewakili populasi kecil di stroma PDAC. Tren ini dikonfirmasi ketika
ekspresi rata-rata gen tanda tangan untuk masing-masing kelompok sel tunggal fibroblas manusia dibandingkan dalam
sampel sekuensing massal mikrodiseksi (Gbr. 5F). Untuk mengkonfirmasi ekspresi protein LRRC15 pada CAF manusia,
kami melakukan IHC ganda pada jaringan dari 70 pasien dengan PDAC (Tabel Tambahan S6) untuk LRRC15 dan CD8. Kami
menemukan 100% pasien menunjukkan pewarnaan LRRC15 di area pankreas yang tidak normal dan LRRC15 muncul
fibrillar dan sebagian besar dikeluarkan dari pulau tumor. Sebagian besar, ditemukan di sekitar mereka; selain itu, sering
terlihat di dekat CD8 + Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh
tamu pada 26 September 2022 Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAF di PDAC RESEARCH ARTICLE PENEMUAN
KANKER FEBRUARI 2020 | 243 sel T di area tersebut (Gbr. 5G; Gambar Tambahan. S5B). Flow cytometry pada 4 sampel
pasien yang dikonfirmasi lebih lanjut LRRC15 sebagian besar terbatas pada gerbang stroma EPCAM CD45 dan menandai
sebagian besar CAF (Gbr. 5H). Secara keseluruhan , kami menemukan bahwa LRRC15 + TGFβ cluster 0 (hC0) CAFs adalah
populasi fibroblas yang paling menonjol dalam beberapa dataset PDAC manusia, mengkonfirmasi temuan kami dari model
tikus. Meskipun kluster fibroblas manusia 0 dan 2 (hC0 dan hC2) menunjukkan gen yang tumpang tindih dari tikus TGFβ c2
dan IL1 c8 CAFs dalam perbandingan lintas spesies, masing-masing (Gbr. 5I), kluster 1 (hC1) tidak jelas cocok dengan
populasi CAF awal. diamati pada tikus. Meskipun HC1 dicirikan oleh c4 tikus tingkat tinggi relatif terhadap gen c3 (Gambar
Tambahan S5C), sel-sel individu tidak menunjukkan fenotipe yang jelas dari satu atau populasi lainnya. Untuk menguji
apakah, berbeda dengan tikus, fibroblas pankreas manusia adalah populasi yang homogen, kami melakukan isolasi silico
sel fibroblas tunggal dari 11 jaringan pankreas nonmalignant , diterbitkan sebagai bagian dari Peng dan rekan (41).
Pengurangan dimensi dengan UMAP dan pengelompokan dalam ruang yang dikurangi mengungkapkan populasi 1.407
fibroblas (DCN, LUM; Gambar Tambahan. S5D; Tabel Tambahan S7). Subclustering sel-sel ini mengidentifikasi dua cluster ,
yang kecil (<5% dari sel) menunjukkan tingkat tinggi EPCAM dan penanda epitel lainnya dan kemungkinan mewakili artefak
isolasi in silico kami (Tambahan Gambar. S5E). Cluster lainnya dicirikan oleh ekspresi C7 dan CFD yang kuat. Kesamaan
kuat penanda fibroblas nonmaligna ini dengan hC1 menunjukkan bahwa hC1 belum mengalami perubahan transkripsi
ekstensif relatif terhadap fibroblas nonmaligna. Ini dikonfirmasi dengan membandingkan profil ekspresi rata-rata dari kedua
tipe sel ini (korelasi Pearson: 0,97), di mana hanya beberapa gen yang mengubah ekspresi (Gbr. 5J). Atas dasar analisis ini,
kami dapat mengidentifikasi gen yang diperkaya dalam fibroblas nonmaligna dan hC1 CAFs, tetapi tidak hC0 TGF CAFs
atau hC2 IL1 CAFs, serta gen yang diinduksi pada ketiga populasi CAF dibandingkan dengan fibroblas nonmaligna
(Tambahan Gambar. S5F). Bersama-sama, hasilnya menunjukkan bahwa hC1 CAFs adalah CAFs awal (eCAFs) dan
pendahulu dari hC2 IL1 dan hC0 TGF CAFs. Untuk menguji hipotesis ini , kami melakukan PCA dari semua fibroblas
termasuk yang berasal dari pankreas nonmaligna. Menariknya, PC1 memisahkan sel dalam urutan fibroblas nonmalignant,
hC1 eCAFs, hC2 IL1 CAFs, dan hC0 TGF CAFs (Gbr. 5K). Pohon rentang minimum yang sesuai dengan data pengurangan
dimensi ini mendukung bahwa mulai dari sel fibroblas nonmaligna mengalami transformasi menjadi C1 eCAF,
meningkatkan regulasi kolagen tipe I, SPARC, dan protein ECM lainnya. Dari keadaan peralihan ini, sel menjadi hC2 IL1 CAFs
atau hC0 TGF CAFs. Menariknya, baik hC1 eCAFs dan hC0 TGF CAFs membentuk hampir semua fibroblas dalam dataset
sel tunggal yang sedang diselidiki. Kami tidak melihat bukti adanya sel dengan tanda mesothelial atau apCAF dalam data
ini; namun, kami menemukan bahwa semua CAF manusia mengekspresikan CD74 dan HLA-DRA (Gambar Tambahan S5G),
yang konsisten dengan data yang ditemukan di Elyada dan rekan (36). Kami telah merangkum temuan kami pada manusia
dan tikus dalam sebuah model (Gbr. 5L). Tanda Tangan LRRC15 + CAF Dapat Ditemukan di Beberapa Indikasi Kanker
Manusia Seperti yang telah dilaporkan sebelumnya bahwa ekspresi LRRC15 stroma dapat diamati pada beberapa jenis
tumor (38), kami melakukan analisis pan-kanker di seluruh tumor di The Cancer Genome Atlas (TCGA). ; n = 9.736) dan
membandingkan data ini dengan jaringan tidak ganas yang cocok dari database GTEx (n = 8.587). Kami menemukan
bahwa ekspresi LRRC15 secara konsisten rendah / tidak ada di seluruh jaringan normal, tetapi diregulasi dalam berbagai
tumor termasuk tetapi tidak terbatas pada kanker pankreas, payudara, dan kepala dan leher (Gbr. 6A). Untuk memverifikasi
bahwa sinyal LRRC15 berasal dari CAF yang diaktifkan TGFβ pada tipe tumor selain PDAC, pertama-tama kami
mengidentifikasi tanda tangan ekspresi TGFβ CAFs yang lebih kuat dari analisis scRNA- seq PDAC manusia kami. Kami
berfokus pada gen yang diperkaya secara signifikan dalam TGFβ CAFs dibandingkan dengan semua populasi fibroblas
lainnya yang menunjukkan tidak ada/ekspresi rendah oleh tipe sel lain dalam kumpulan data lengkap (Gbr. 6B). Kumpulan
gen sangat diperkaya dalam stroma massal PDAC mikrodiseksi versus sampel tumor (Gbr. 6C), menunjukkan bahwa sinyal
gabungan mereka memungkinkan kesimpulan tentang ada/tidaknya fibroblas TGFβ dalam data RNA-seq massal. Untuk
selanjutnya mengkonfirmasi keberadaan populasi ini pada tipe tumor lain, kami menganalisis ulang data RNA-seq sel
tunggal dari 18 pasien dengan karsinoma sel skuamosa kepala dan leher (HNSCC; ref. 43). Pengurangan dimensi dengan
UMAP dari 3.363 sel dari TME bebas dari mutasi somatik mengkonfirmasi anotasi tipe sel yang disediakan oleh penulis
(Gbr. 6D, atas). Pengelompokan sel mesenkim menunjukkan 5 subklaster, dua di antaranya adalah perisit (25% dari semua
sel; PDGFRB, MCAM, RGS5, ACTA2), dua adalah fibroblas (15% dari semua sel; LUM, DCN), dan satu adalah myoblastik-
seperti (2% dari semua sel). Mengkonfirmasi hasil dari data sel tunggal kanker pankreas, ekspresi set gen penanda TGFβ
CAF kami hampir seluruhnya terbatas pada salah satu dari dua kluster fibroblas (Gbr. 6D, kanan bawah; kluster 2, 60% dari
semua fibroblas ) . Ini menggarisbawahi adanya LRRC15 + TGF CAFs juga pada kanker kepala dan leher. Lebih lanjut,
sebagian besar gen menunjukkan ekspresi rendah/tidak ada oleh sel tumor ( Gambar Tambahan S6A), menunjukkan bahwa
sinyal utama gen ini dalam data RNA-seq massal, seperti yang telah kami tunjukkan pada kanker pankreas, kemungkinan
besar berasal dari dari TGFβ CAFs dan lebih sedikit dari sel tumor EMT. Berdasarkan hasil ini, kami menggunakan tanda
tangan 11-gen (MMP11, COL11A1, C1QTNF3, CTHRC1, COL12A1, COL10A1, COL5A2, THBS2, AEBP1, LRRC15, ITGA11)
untuk menyimpulkan keberadaan TGFβ CAF di berbagai jenis kanker yang berbeda. dari data TCGA RNA-seq massal. Dalam
analisis pan-kanker ini yang terdiri dari 31 jenis kanker berbeda dari TCGA, kami menemukan korelasi positif antara ekspresi
rata-rata dan korelasi rata-rata berdasarkan gen dari tanda tangan inti kami di seluruh jenis kanker (Gbr. 6E). Korelasi positif
menunjukkan bahwa pada jenis kanker di mana TGFβ CAF hadir (ekspresi rata-rata tinggi ), ada sinyal sebenarnya dalam
jumlah besar yang berasal dari populasi ini yang mengarah ke korelasi gen yang tinggi. Pada jenis kanker yang kekurangan
TGFβ CAFs (ekspresi rata-rata rendah), hanya ada sinyal “noise” dan gen tidak berkorelasi. Selain adenokarsinoma
pankreas (PAAD), analisis menunjukkan TGFβ CAFs juga memainkan peran kuat dalam kanker payudara (BRCA), Diunduh
dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232 .pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Dominguez et al. PASAL PENELITIAN 244 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org BLCA BRCA COAD
DLBC ESCA HNSC LUAD LUSC OV READ SARC STAD 10 08 6 4 2 ekspresi LRRC15 1 PAAD Cancer (TCGA) Normal (GTEx)
(404; 28) (1085; 291) (275; 349 ) (47; 337) (182; 286) (519; 44) (483; 347) (486; 338) (426; 88) (179; 171) (92; 318) (262; 2)
(408; 211 ) Nomor pasien Jenis tumor Program ekspresi TGFβ CAF A ​B 1 1 Cor . 0 Fibroblas Sel B Miosit Makrofag Sel T
Endotel Tiang Dendritik 5 0 5 10 15 UMAP_2 0 9 1 12 15 8 11 14 13 10 4 3 6 5 2 7 5 0 5 10 15 −10 010 20 UMAP_1 UMAP_2
10 5 0 5 10 15 UMAP_2 MCAM Fibroblas Perisit 10 −5 0 5 10 15 −10 01020 UMAP_1 UMAP_2 LUM Myoblasts 0 1 2 3 z-
score 0 2 15 4 6 8 1012 Kanker kepala dan leher TME n = 3.363 sel D Epitel Stroma 2 2 2 0 1 Fibroblas Semua sel lain
Cluster 0.5 1 z-score z-score 10 01020 UMAP_1 LRRC15 MMP11 COL11A1 C1QTNF3 CTHRC1 COL12A1 COL10A1 COL5A2
GJB2 THBS2 AEBP1 MFAP2 1.011 Fraksi 0.0 0 PLAU lainnya mengekspresikan 0.8 GALRRC15 0.6 0 PLAU.2 gene GJB2
PLAU MMP11 MFAP2 ITGA11 COL10A1 COL5A2 THBS2 CTHRC1 AEBP1 C1QTNF3 LRRC15 COL11A1 COL12A1 C MMP11
COL11A1 C1QTNF3 CTHRC1 COL12A1 COL10A1 COL5A2 GJB2 THBS2 AEBP1 MFAP2 LRRC15 PLAU ITGA11 MMP11
COL11A1 C1QTNF3 CTHRC1 COL12A1 COL10A1 COL5A2 THBS2 AEBP1 LRRC15 ITGA11 MMP11 COL11A1 C1QTNF3
CTHRC1 COL12A1 COL10A1 COL5A2 THBS2 AEBP1 LRRC15 ITGA11 PAAD UVM MMP11 COL11A1 C1QTN F3 CTHRC1
COL12A1 COL10A1 COL5A2 THBS2 AEBP1 LRRC15 0.20.3 0.40.5 0.60.7 0.8 6 7 8 9 10 11 TGCT PCPG KIRP KIRC UCS
THCA THYM STAD SARC SKCM READ PRAD PAAD OV DLBC LUSC LUSC MESO KICH LIHC _ _ _ BRCA GBM LGG BLCA
CHOL ACC Ekspresi rata-rata Korelasi rata -rata E Max 0 ITGA11 COL11A1 Gambar 6. Analisis pan-kanker mengidentifikasi
LRRC15 + CAF sebagai populasi yang sering ditemukan di beberapa jenis tumor manusia. A, Distribusi ekspresi LRRC15
(Log 2 TPM) di seluruh jenis kanker yang ditunjukkan (TCGA, n = 4.848) dibandingkan dengan jaringan inangnya (GTEx, n =
2.810). B, Top, ekspresi dari 14 gen yang paling diperkaya secara signifikan (uji jumlah peringkat Wilcoxon < 1e-285) dalam
kluster TGFβ CAF 0 dibandingkan dengan kluster 1 serta kluster 2 dari Gambar 5D yang diekspresikan oleh kurang dari 10%
dari sel lain dalam set data sel tunggal PDAC lengkap. Bawah, ekspresi rata-rata relatif dalam cluster CAF dari Gambar. 5D.
C, Ekspresi relatif gen dari B dalam 122 stroma mikrodiseksi dan 65 sampel tumor mikrodiseksi. D, Kiri atas, penyematan
UMAP dari 3.363 sel nonmaligna dari 18 biopsi HNSCC. Penugasan tipe sel yang disediakan oleh penulis ditandai dengan
warna. Kanan atas, reduksi UMAP seperti di kiri, diwarnai dengan ekspresi [Log(CPM/10+1)] dari gen yang ditunjukkan. Kiri
bawah, UMAP seperti di atas, cluster yang diidentifikasi melalui pengelompokan berbasis grafik ditunjukkan dengan warna.
Kanan bawah, peta panas memvisualisasikan ekspresi rata-rata relatif dari gen yang ditunjukkan (baris) dalam kelompok
yang diberikan di kiri bawah. E, Top, matriks korelasi gen-demi-gen memvisualisasikan koefisien korelasi Spearman
berpasangan dalam data TCGA RNA-seq massal dari pasien dengan kanker pankreas (kiri, n = 178) dan melanoma uveal
(kanan, n = 80). Bawah, plot sebar membandingkan korelasi berpasangan rata-rata (sumbu x) dan ekspresi rata-rata (sumbu
y) gen dari yang diberikan di atas di 31 indikasi kanker dari TCGA (total 9.712 sampel dari tumor primer; garis regresi
berwarna biru) . kanker paru-paru (LUSC, LUAD), kanker ovarium (OV), kanker usus besar (COAD), kanker ginjal (READ),
kanker esofagus (ESCA), adenokarsinoma lambung (STAD), dan kanker kandung kemih (BLCA; Gambar Tambahan S6B ),
serta HNSCC. Singkatnya, data ini menunjukkan bahwa LRRC15 + CAFs adalah populasi yang menonjol di beberapa jenis
kanker manusia yang muncul dari populasi fibroblas LRRC15 . Tanda Tangan LRRC15 + CAF Memprediksi Respon Klinis
yang Buruk terhadap Blokade Pos Pemeriksaan Setelah menunjukkan bahwa Lrrc15 + CAF ada pada kanker manusia, kami
selanjutnya mencoba menguji dampak klinis dari populasi ini. Karena peran TGFβ yang diketahui dalam memodulasi
imunoterapi (32, 44), kami mengevaluasi signifikansi klinis dari LRRC15 + CAF yang baru diidentifikasi sebagai respons
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/ 10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022 Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs dalam PDAC ARTICLE PENELITIAN FEBRUARI 2020
PENEMUAN KANKER | 245 Gambar 7. Ekspresi LRRC15 dan tanda transkripsionalnya memprediksi respons terhadap
imunoterapi. A, Plot kotak yang membandingkan distribusi TGFβ CAF (atas) pada tumor yang dikecualikan, meradang, dan
gurun imun dari IMvigor210 antara responden dan nonresponder. ***, P < 0,001, uji t dua sisi; CR, tanggapan lengkap; PR,
respons parsial; SD, penyakit stabil; PD, penyakit progresif. B, plot kelangsungan hidup Kaplan-Meier membandingkan
probabilitas kelangsungan hidup (sumbu y) dan waktu tindak lanjut untuk 134 pasien dengan karsinoma urothelial stadium
lanjut atau metastasis lokal (IMvigor210) yang menerima pengobatan atezolizumab, terbatas pada tumor dengan fenotipe
yang dikecualikan dari imun. Kelompok-kelompok dibagi berdasarkan tingkat ekspresi tanda tangan gen penanda TGFβ
CAF yang tinggi (merah) atau rendah (hijau) (cutoff median). C, Plot kotak yang membandingkan distribusi korelasi
berpasangan gen dari TGFβ CAF dan tanda tangan F-TBRS dalam data RNA-seq massal IMvigor210. D, Kelangsungan hidup
plot seperti pada B, tetapi di sini dengan skor berdasarkan gen tanda tangan F-TBRS. E, plot kelangsungan hidup Kaplan-
Meier membandingkan probabilitas kelangsungan hidup (sumbu y) dan waktu tindak lanjut untuk 128 pasien dari
percobaan PCD yang menerima pengobatan atezolizumab. Kelompok dibagi berdasarkan ekspresi tanda tangan gen
penanda TGFβ CAF tingkat tinggi (merah) atau rendah (hijau) (>atas vs.

F-TBRS
Tinggi: n = 67
Rendah: n = 67
P = 0,017
HR = 1,7
AB C
DE
IMvigor210 tumor percobaan-dikecualikan
IMvigor210 tumor percobaan-dikecualikan
TGFβ
CAF
F-TBRS
Tinggi: n = 67
Rendah: n = 67
P < 0,001
HR = 2,3
TGFβ CAF
Korelasi
berpasangan Tidak termasuk Gurun yang meradang
***
2
1
−1
0
Skor TGFβ CAF
N.SNS
CR/PR SD/PD
(28) (85) # Pasien (14)(55) (19)(43)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
05 10 15 20 25
Probabilitas kelangsungan hidup
Waktu tindak lanjut (bulan)
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
05 10 15 20 25
Probabilitas kelangsungan hidup
Waktu tindak lanjut (bulan)
01020304050
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Probabilitas kelangsungan hidup
Waktu tindak lanjut (bulan)
Rendah: n = 64
Tinggi: n = 64
HR = 1,9
P = 0,01
percobaan PCD
TGFβ CAF
0,4
0,0
0,4
0,8
Tingkat tinggi Tingkat rendah
untuk imunoterapi kanker. Beberapa laporan telah menunjukkan bahwa
susunan molekul kanker kandung kemih mirip dengan
kanker pankreas dengan subtipe yang sama (45, 46). Selanjutnya,
kami telah menunjukkan dalam analisis kami sebelumnya bahwa LRRC15
+
CAF
juga merupakan populasi yang sering pada kanker kandung kemih (Gbr. 6E).
Kami menemukan bahwa penanda untuk LRRC15
+ CAF yang
diidentifikasi dalam
PDAC juga diekspresikan secara signifikan dalam data RNA-seq
dari percobaan imunoterapi kanker kandung kemih kami baru-baru ini (ref. 32;
Gambar Tambahan. S7A). Selain itu, tanda tangan dikaitkan
dengan hasil yang lebih buruk untuk pasien yang menerima terapi anti-PD-L1
(atezolizumab) (P = 0,03, HR = 1,4;
Gambar Tambahan. S7B). Efek ini dijelaskan oleh peningkatan ekspresi
tanda tangan pada pasien yang gagal merespon
terapi anti-PD-L1 secara eksklusif pada tumor yang dikecualikan dari imun, tetapi tidak pada
tumor dengan fenotipe gurun yang meradang atau imun (Gbr. 7A).
Akibatnya, kami mengamati hubungan yang signifikan dari tanda tangan
LRRC15
+
CAF dengan hasil yang lebih buruk khususnya pada
pasien dengan tumor yang dikecualikan dari kekebalan (P <0,001, HR = 2,3;
Gambar 7B). Hasil kami menunjukkan peningkatan dari
tanda respon fibroblast TGFβ yang diperoleh melalui
aktivasi in vitro fibroblas dengan TGF sehubungan dengan
spesifisitas tipe selnya (Gbr. 7C) dan kekuatan prediktif (Gbr. 7D).
Immunoscoring pasien dengan PDAC mengungkapkan bahwa
mayoritas menunjukkan fenotipe yang dikecualikan dari kekebalan, menunjukkan
temuan ini mungkin juga berlaku untuk pasien dengan PDAC
(Gambar Tambahan S7C). Yang penting, tanda tangan LRRC15
+
CAF
juga memprediksi respons terhadap atezolizumab dalam
percobaan kedua yang terdiri dari beberapa jenis kanker lainnya, seperti
karsinoma sel ginjal, kanker kepala dan leher, dan
kanker paru-paru non-sel kecil (P = 0,01, HR = 2,01 Gambar 7E;
Gambar Tambahan S7D). Efek ini (HR> 1,5) terlihat jelas
di beberapa indikasi kanker individu, meskipun
ukuran sampel individunya kecil (Gambar Tambahan S7E). Masih
belum jelas apa sifat dari imunosupresi LRRC15
+
CAF
, tetapi data ini memberikan dasar yang kuat
untuk lebih menjelaskan fungsi sel-sel ini. Korelasi
antara LRRC15
+ CAFs
dan hasil yang buruk dalam
pengobatan imunoterapi menunjukkan bahwa beberapa indikasi tumor
dapat mengambil manfaat dari pemrograman ulang LRRC15
+
CAF yang dikombinasikan
dengan imunoterapi.
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022
Dominguez et al.
PASAL PENELITIAN
246 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org
DISKUSI
Di sini, kami memanfaatkan metode pencernaan baru kami untuk membuat
profil PDPN
+ CAFs
ex vivo menggunakan scRNA-seq. Pendekatan kami
mengidentifikasi dua populasi terpisah dari ntFibs di pankreas tikus
. Tanda tangan ekspresi mereka menunjukkan fungsi yang berbeda
, dengan satu lagi siap untuk memberikan dukungan struktural
dan yang lain tampak lebih imunoregulasi. Kedua
garis keturunan yang terpisah ini berevolusi secara terpisah menjadi CAF yang digerakkan oleh IL1 dan TGFβ
dalam konteks PDAC. Pekerjaan lebih lanjut pada lokalisasi
dan pelacakan garis keturunan akan memungkinkan kami untuk membedakan apakah
ada kompartementalisasi fisik atau ceruk yang menghasilkan
paparan diferensial terhadap IL1 dan TGFβ atau apakah
ntFibs secara fundamental memiliki potensi berbeda untuk merespons
IL1 dan TGF yang menghasilkan dua CAF terpisah lintasan
yang kita amati.
Temuan kami dari tumor stadium akhir murine mendukung
pengamatan sebelumnya yang mengidentifikasi "iCAFs" yang digerakkan oleh IL1 dan "myCAFs"
yang digerakkan oleh TGFβ (40, 47). Selanjutnya, kami memberikan
wawasan baru tentang bagaimana heterogenitas fibroblas istirahat
menentukan nasib sel stroma di TME. Tampaknya juga
dari perbandingan silang kami bahwa "iCAFs" mencakup
CAF1 dan IL1 CAF awal kami sedangkan "myCAFs"
mencakup CAF2 awal dan TGF CAF kami. Kami
mengamati perbedaan dengan identifikasi kami dari populasi yang
sebelumnya ditetapkan sebagai "apCAF" (36), yang kami identifikasi
sebagai populasi sel mesothelial. Perbedaan ini mungkin
karena sel-sel mesothelial memperoleh ekspresi dari beberapa
gen fibroblas dalam sistem KPC, seperti transisi mesothelial-to-
mesenchymal telah dijelaskan di beberapa jaringan
(48). Faktanya, dalam sistem KPC, hubungan antara
"apCAFs" dan "myCAFs" terlihat jelas di ruang UMAP, dan
"apCAFs" mengekspresikan Pdgfra, menunjukkan perubahan dari
keadaan jaringan normal. Namun, gen mesothelial dominan
yang mendorong pengelompokan populasi tersebut, termasuk
gen penyaji antigen Cd74 dan H2-Ab1, terdapat
di pankreas normal. Kami juga tidak mengamati sel-sel ini
dalam tumor, yang mungkin merupakan konsekuensi dari
metode diseksi kami di mana sebagian besar mesothelium akan
dimasukkan dalam jaringan normal yang berdekatan, atau dapat mencerminkan
perbedaan antara model KPC dan KPP.
Perbandingan dengan beberapa kohort pasien manusia yang berbeda
mengungkapkan persamaan dan perbedaan dengan tikus,
yang telah kami modelkan (Gbr. 5L). Meskipun konservasi
IL1 dan TGFβ CAFs cukup jelas, kami
dikejutkan oleh beberapa perbedaan antara model tikus dan
data pasien manusia. Pertama, kami tidak mengamati heterogenitas dasar
dalam fibroblas jaringan manusia yang tidak ganas.
Sebaliknya, fibroblas manusia dari jaringan nonmalignant menunjukkan
profil transkripsi yang menggabungkan
tanda tangan ntFIB tikus. Selanjutnya, fibroblas manusia yang tidak ganas
bertransisi ke CAF awal tunggal, yang kemudian memunculkan CAF yang
diprogram TGFβ atau IL1. Namun, mengingat bahwa
jaringan manusia yang kami analisis tidak benar-benar normal, kami
tidak dapat mengesampingkan bahwa fibroblas nonmaligna telah
mengalami perubahan yang menutupi heterogenitas awal. Kami
juga menemukan bahwa CD74 dan HLA-DRA diekspresikan oleh semua
populasi CAF manusia, mengungkapkan
perbedaan fungsional yang berpotensi penting antara CAF manusia dan tikus.
Kami tidak mengamati populasi tertentu dengan
tanda tangan transkripsi yang mirip dengan "apCAF" atau sel mesothelial,
menunjukkan populasi ini tidak ada atau sangat jarang di TME
PDAC.
Kami mengidentifikasi populasi sel yang digerakkan oleh TGF sebagai CAF yang paling
umum pada tumor stadium akhir, dan menunjukkan bahwa
ekspresi permukaan LRRC15 memungkinkan isolasi eksperimental
dan manipulasi CAF ini pada model tikus
dan sampel pasien manusia. Lebih lanjut, kami menemukan bahwa tanda tangan
LRRC15
+
CAF berkorelasi dengan respons yang buruk terhadap
blokade pos pemeriksaan imun pada beberapa
jenis tumor manusia yang berbeda. Sel-sel ini memiliki sifat myofibroblastik dan
tanda tangan gen ECM yang dominan. Kami menemukan mereka merupakan
mayoritas CAF pada pasien dengan PDAC, yang didominasi
fenotipe imun-dikecualikan. Ini menunjukkan
peran imunoregulasi untuk sel-sel ini. Akan sangat berharga untuk
mengeksplorasi lebih lanjut apakah CAF awal dapat dicegah dari
mengadopsi nasib protumorigenik dari LRRC15
+ CAF
atau
apakah fenotipe LRRC15
+
CAF dapat dikembalikan untuk
meningkatkan kemanjuran imunoterapi.
Meskipun kami memilih untuk fokus pada LRRC15
+ CAF
karena
prevalensinya di PDAC, IL1 CAF memiliki
program transkripsi yang dengan jelas menunjukkan regulasi imun TME.
Penghambatan pensinyalan JAK di PDAC telah terbukti
terkait dengan pengurangan IL1 CAFs dan pengurangan
beban tumor (47), meskipun sulit untuk membedakan
efek langsung dari inhibitor ini pada sel tumor (28,
49-51) dari efek kehilangan IL1 CAF di TME. Penting
juga untuk dicatat bahwa meskipun kedua
tipe CAF ini memiliki banyak perbedaan transkripsi, keduanya juga
mengekspresikan gen yang terkait dengan karakteristik myofibroblast
dan keduanya mengekspresikan berbagai mediator regulasi imun dan bahkan
inflamasi. Jadi, kami menggambarkan mereka dengan karakteristik mereka yang paling lestari, pemrograman
transkripsi utama mereka ;
IL1 CAF dan TGFβ CAF. Untuk TGFβ CAF,
kami telah mengidentifikasi ekspresi LRRC15 sebagai proksi yang baik
di beberapa indikasi kanker.
Kami memilih untuk fokus pada fibroblas untuk menghasilkan kumpulan data yang kuat
yang akan menjadi representasi yang baik dari heterogenitas
populasi yang agak langka. Pekerjaan kami juga mengidentifikasi
populasi lain dengan sifat fibroblas: sel PDPN CD31 ,
yang diperkaya untuk perisit tetapi mengadopsi ekspresi beberapa gen CAF, serta dua populasi sel PDPN + , yang kami
klasifikasikan sebagai sel tumor yang menjalani EMT. Ada juga berbagai sel stroma dan nonstroma yang kami pilih untuk
dikecualikan dari fokus penelitian ini. Sel - sel ini semua adalah bagian dari TME, dan penelitian di masa depan tentang
fungsinya pasti akan menghasilkan pemahaman yang lebih lengkap tentang interaksi dan kontribusi mereka terhadap
perkembangan tumor dan respons terhadap terapi. METODE Tikus tikus WT B57BL/6 (koloni 000664) dan tikus albino WT
B6(Cg)-Tyr c-2J /J (koloni 000058) dibeli dari Laboratorium Jackson. Kami melisensikan KrasLSL G12D dari Tyler Jacks
(Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA), p16/p19 fl/fl dari Anton Berns (NKI, Amsterdam, Belanda), dan
Pdx1.Cre dari Andy Lowy (University of Ohio, Colombus, OH). Tikus KPP dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya
(12). Tikus yang cocok dengan usia dan jenis kelamin digunakan Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs in PDAC RESEARCH ARTICLE PENEMUAN KANKER FEBRUARI 2020 | 247
untuk percobaan. Tikus ditempatkan di Genentech di kandang mikroisolator hewan pengerat standar dan diaklimatisasi
untuk mempelajari kondisi setidaknya 3 hari sebelum implantasi sel tumor. Hewan berumur 6 sampai 12 minggu. Tikus
KPP GEMM di-eutanasia pada usia rata-rata 9 minggu. Usia ini mencerminkan keadaan penyakit dengan adenokar - cinoma
penetrasi tinggi dan di mana GEMM dengan tumor sedang dan besar diamati. Semua hewan dipantau sesuai dengan
pedoman dari Institutional Animal Care and Use Committee di Genentech, Inc. Cell Lines Garis sel adenokarsinoma
pankreas murine KPP14388 dihasilkan oleh kelompok Junttila di Genentech dari KPP GEMM. Garis transgenik dibuat
sebagai berikut: mApple MSCV retrovirus ditransfeksi ke KPP14388 dan satu klon ditumbuhkan; KPP-DTR diperoleh dengan
mentransduksi KPP14388 dengan DTR-efp lentivirus dan klon sel tunggal dipilih. Sel kanker dikultur dalam DMEM glukosa
tinggi ditambah 2 mmol/L l-glutamin dengan 10% FBS (HyClone). Semua garis sel diuji untuk Mycoplasma dengan qPCR.
Untuk semua tumor yang disuntikkan, sel digunakan dalam tiga bagian pertama. Pencernaan Jaringan, Isolasi Sel, dan
Aliran Sitometri Jaringan Murine Untuk mengisolasi pankreas, pertama-tama omentum diangkat dan kemudian pankreas
dikumpulkan dengan pengecualian yang hati-hati dari drainase kelenjar getah bening. Pankreas kemudian dicincang. Untuk
pengayaan sel bintang, jaringan dicerna seperti yang dijelaskan sebelumnya (11). Pencernaan enzimatik digunakan dengan
0,02% Pronase (katalog Roche no. 10165921001), 0,05% Collagenase P (Roche, katalog no. 11249002001), dan 0,1% DNase
(Roche, no katalog 10104159001) dalam larutan garam seimbang Gey (GBSS). ; Sigma, katalog no. G9779) selama 50
menit. Jaringan yang dicerna kemudian disaring melalui jaring nilon 100 m. Sel disentrifugasi pada 1.300 rpm selama 5
menit, dicuci, dan kemudian disuspensikan kembali dalam GBSS yang mengandung 0,3% BSA (Sigma Aldrich, katalog no.
A2153). Suspensi sel disentrifugasi, dituang, dan disuspensikan kembali ke dalam 8 mL 28,7% (berat/vol) larutan Nycodenz
(Sigma, tidak lagi tersedia; juga menggunakan 16,7% Optiprep; Sigma-Aldrich D1556) yang dilapisi dengan 6 mL 0,3% BSA
GBSS, kemudian disentrifugasi pada 1.400 × g tanpa istirahat selama 20 menit. Sel-sel yang diinginkan dipisahkan menjadi
pita fuzzy tepat di atas antarmuka bantalan Nycodenz dan GBSS. Pita ini dipanen dan sel-selnya dicuci dan disuspensikan
kembali dalam buffer MACS. Untuk digest baru kami, yang dimodifikasi dari Fletcher dan rekan (52), 20 g/mL anti-tripsin
(Sigma Aldrich, katalog no. 10109886001) digunakan pada putaran pertama inkubasi digest, yang disiapkan sebagai
berikut. Pankreas dicerna secara enzimatik menggunakan 800 g/mL Dispase, 400 g/mL kolagenase P, dan 100 g/mL
DNase I pada suhu 37°C. Fraksi dikumpulkan ke dalam buffer MACS dan media digest disegarkan 2 kali lagi setelah
inkubasi 15, 10, dan 5 menit . Pada titik ini baik: (i) untuk perbandingan dengan pengayaan sel stellata, suspensi sel
disentrifugasi pada 1.300 rpm selama 5 menit, dituang, dan mengalami sentrifugasi gradien kepadatan seperti dijelaskan di
atas atau (ii) untuk mencerna berikutnya tanpa gradien pengayaan, sampel menjalani lisis RBC dan dipintal selama 4 menit
pada 50 × g menjadi puing-puing pelet, supernatan dikumpulkan, dipintal dan disuspensikan kembali dalam media, dan sel
dihitung menggunakan Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Tumor pankreas diperlakukan sama dengan penambahan 2 U/mL
hyaluronidase (Worthington, katalog no. LS002592) dan 20 U/mL kolagenase murni (Worthington, katalog no. LS005273)
dan 100 g/mL Collagenase P. Dalam percobaan PDAC, kontrol pankreas normal dicerna menggunakan koktail enzimatik
yang sama seperti tumor. Tumor juga sering membutuhkan 1 hingga 2 inkubasi pencernaan tambahan untuk memecah
jaringan. Tumor subkutan dikumpulkan dengan hati-hati untuk menghindari pengeringan kelenjar getah bening dan
epidermis. Tumor subkutan ditimbang dan dicerna secara enzimatik menggunakan campuran enzim yang sama seperti
sampel pankreas normal yang dijelaskan sebelumnya, tanpa penambahan inhibitor tripsin. Sel diberi label dengan mAbs
yang dibeli dari eBioscience, Bio- Legenda, atau BD Biosciences pada 1:200 selama 20 hingga 30 menit, kecuali dinyatakan
lain. Sebelum pewarnaan permukaan sel dengan antibodi berlabel fluoresensi berikut, sel diblokir dengan blok Fc (2,4G2;
1:500). Pewarnaan permukaan untuk eksperimen dilakukan dengan menggunakan antibodi yang dijelaskan dalam Tabel
Tambahan S8 selama 25 menit pada suhu 4°C, dicuci 2,5 kali dengan buffer MACS, kemudian difiksasi (BioLegend, katalog
no. 420801) atau disuspensikan kembali dalam 7-AAD (1: 50; BD Biosciences, katalog no.559925) dan Calcein Blue
(1:1.000; Inv- itrogen, no katalog C1429) untuk analisis sitometri. Untuk pewarnaan intraseluler , permukaan sel diwarnai
seperti di atas, dicuci, dan kemudian difiksasi dan ditembus menggunakan Kit ICS FoxP3 (eBioscience, katalog no. 00-5523-
00) sesuai petunjuk pabrik. Sel kemudian diinkubasi dengan antibodi yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan S8 selama 1
jam dalam buffer permeabilisasi. Data diperoleh pada Fortessa, Symphony, atau LSR II (BD Biosciences) dan dianalisis
menggunakan FlowJo (Tree Star). Sel Uji Aldefluor diisolasi seperti di atas. Setelah suspensi sel tunggal diperoleh, sel
dilapisi dan disuspensikan kembali dalam buffer uji Aldefluor, sebagai bagian dari Kit Aldefluor (StemCell Technologies,
katalog no. 01700) dalam tabung FACS (500 L) atau pelat U-bottom 96-sumur ( 200 L) dengan blok Fc. Kemudian, 10 L
(tabung FACS) atau 4 L (pelat 96-sumur) dari buffer assay dimasukkan ke dalam tabung pendinginan. 2,5 L (tabung FACS)
atau 1 L (pelat 96-sumur) buffer DEAB dimasukkan ke dalam tabung pendinginan. Lima mikroliter (tabung FACS) atau 2 L
(96-well plate) reagen Aldefluor kemudian ditambahkan ke sel secepat mungkin. Sel kemudian dicampur, dan setengah dari
volume ditambahkan ke tabung pendinginan dengan DEAB. Sampel diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 hingga 20 menit,
kemudian dipintal dan diwarnai permukaannya seperti di atas di atas es selama 20 hingga 30 menit sebelum analisis FACS.
Anti-LRRC15 Antibodi untuk Aliran Sitometri dan Pencitraan Murine Sintesis dan kloning gen dilakukan setelah terjemahan
terbalik dan optimasi kodon untuk sel ovarium hamster Cina (CHO) dari urutan asam amino yang mengkode variabel berat
(VH) dan variabel ringan (VL) domain klon anti-LRRC15 huM25 (flow) dan huAD208.4.1 (pencitraan), sebagaimana
dipublikasikan melalui paten 10195209 (53). Untuk huM25, konstruksi ekspresi antibodi chimeric manusia-tikus dihasilkan
dengan mensubkloning urutan VL dan VH ke dalam vektor ekspresi mamalia yang masing-masing mengandung kerangka
rantai ringan kappa tikus dan kerangka rantai berat IgG2a tikus. Untuk huAD208.4.1, konstruksi ekspresi antibodi manusia
dihasilkan dengan mensubkloning urutan VL dan VH ke dalam vektor ekspresi mamalia yang masing-masing mengandung
kerangka rantai ringan kappa manusia dan kerangka rantai berat IgG1 manusia. Kedua antibodi diproduksi oleh sel CHO
yang ditransfusikan secara transien dan dimurnikan menggunakan metode pemurnian antibodi standar dan dikonfirmasi
sebagai reaksi silang LRRC15 manusia/tikus oleh resonansi plasmon permukaan (data tidak ditampilkan).
Imunofluoresensi dan Analisis Gambar Jaringan Tikus Pankreas tikus, jaringan tumor PDAC, dan tumor KPP subkutan
difiksasi semalaman dalam 1% paraformaldehyde (PFA), tertanam dalam media suhu pemotongan optimal (Sakura Diunduh
dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article -pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Dominguez dkk. ARTIKEL PENELITIAN 248 | PENEMUAN KANKER FEBRUARI 2020 AACRJournals.org Finetek) dan
dibekukan untuk disimpan pada suhu −80°C. Bagian setebal lima hingga 12 m dikrioeksi, diwarnai dengan kekebalan, dan
dicitrakan dengan mikroskop confocal Leica TCS SP8. Gambar diproses dengan perangkat lunak Fiji (ImageJ v2.0.0-rc-
69/1.52i). Untuk pewarnaan, slide difiksasi selama 5 menit dalam 4% PFA, diblokir, dan ditembus dalam buffer noda (2%
BSA, 5% serum kambing dalam PBS) dengan 0,3% Triton selama 1 jam. Antibodi primer ditambahkan selama 1 jam pada
suhu kamar hingga semalam pada suhu 4°C, sekunder ditambahkan selama 30 menit hingga 2 jam pada suhu kamar; slide
dipasang di media pengerasan (Dako S3023). Rincian antibodi yang digunakan dapat ditemukan di Tabel Tambahan S8.
Implantasi Tumor Sel antara bagian 1 dan 2 ditripsinisasi, disaring, dihitung, dan disuspensikan kembali dalam 50% PBS
dan 50% Matrigel (Corning, katalog no. 356231) pada konsentrasi 1 × 106 sel /mL untuk disuntikkan ke tikus. Tikus
ditempatkan di Genentech di kandang mikroisolator hewan pengerat standar dan diaklimatisasi untuk mempelajari kondisi
setidaknya 3 hari sebelum implantasi sel tumor. Hewan berumur 6 sampai 10 minggu. Hanya hewan yang tampak sehat
dan bebas dari kelainan yang jelas digunakan untuk penelitian. Tikus diinokulasi di sayap kanan dengan 1 × 105 sel kanker
dalam 100 L PBS:Matrigel (1:1). Enam belas sampai 24 hari setelah injeksi tumor, tikus di-eutanasia dan tumor
dikumpulkan untuk analisis imunofluoresensi atau aliran sitometri . Kultur Spheroid Tikus donor B6 disuntik dengan sel
kanker KPP-DTR seperti dijelaskan di atas. Tumor dikumpulkan dan dicerna. Suspensi sel tunggal diputar pada 1.300 rpm
selama 3 menit, dituang, dan disuspensikan kembali dalam media fibroblas [10% FBS MEM, dilengkapi dengan 1× L-
glutamin, 1× penisilin/streptomisin, dan 1× HEPES (semua dari Gibco) dan 10% batch diuji IgG FCS (Gemini) rendah].
Deplesi manik dilakukan dengan anti-CD45- biotin, anti-CD24-biotin, dan anti-CD31-biotin dalam hubungannya dengan
EasySep Biotin Selection Kit (StemCell Technologies, katalog no. 17655). Sel kemudian disortir untuk LRRC15 + CAF dan
LRRC15 Ly6C + CAF , karena pankreas normal kontrol diurutkan untuk ENG + Ly6C dan ENG LY6C + fibroblas seperti yang
dijelaskan dalam panel flow cytometry . Sel yang telah disortir dikultur dalam media fibroblas, dan 25 ng toksin difteri (DT;
Katalog Enzo no. BML-G135-0001) ditambahkan untuk membunuh sel tumor; ini dilakukan pada piring yang diberi kultur
jaringan 100 mm dengan media 20 mL. Pelat dibilas keesokan harinya dengan PBS dan media dengan DT diganti. Sel
dikultur selama 7 sampai 10 hari, dengan satu bagian pada pertemuan, untuk memperluas fibroblas . Sel fibroblas yang
dikultur di-tripsinisasi, dihitung, dan kemudian digabungkan dengan sel kanker KPP-mApple. Untuk spheroids, 2.000 sel
kanker KPP-mApple diunggulkan dalam 100 L Matrigel (Corning, katalog no. 356231) dengan atau tanpa populasi fibroblas
yang berbeda (15K). Sebelum sel pelapisan, 100 L Matrigel disebarkan pada setiap sumur dari pelat dasar kaca 24-sumur
(Mattek) dan dibiarkan berpolimerisasi, untuk menjaga agar sel-sel tidak langsung menjajah kaca. Dua mililiter media
fibroblas ditambahkan ke masing-masing sumur. Pelat dicitrakan 2 hingga 4 kali seminggu dengan tujuan 4× Plan Fluor
(NA: 0,13, Nikon) pada mikroskop terbalik Nikon Ti-E yang dilengkapi dengan kamera Neo scMOS (Andor, Oxford
Instruments), tahap otomatis yang disandikan linier ( Instrumentasi Ilmiah Terapan), ruang lingkungan 37°C/5% CO2 (
Okolab), semuanya dijalankan oleh perangkat lunak NIS Elements (Nikon). Kumpulan gambar dalam TRITC dan bidang
terang dari gelembung Matrigel dijahit dan difokuskan menjadi satu proyeksi gambar dengan modul kedalaman fokus yang
diperluas (EDF; Nikon). Gambar TRITC EDF yang dihasilkan dianalisis di Matlab (vR2018a, Mathworks) untuk mengukur
total area spheroid mApple. Pencernaan Jaringan, Isolasi Sel, dan Sitometri Aliran Jaringan Manusia Sampel tumor PDAC
manusia diperoleh dan dicerna menggunakan protokol yang diterbitkan sebelumnya (9). Sampel PDAC dipecah menjadi
potongan-potongan kecil (sekitar 1 mm 3 ) dan dicerna dalam medium bebas-CO 2 (Gibco, katalog no. 18045-054) yang
dilengkapi dengan 5% FBS ( PAA, no katalog A11-151), 2 mg/ mL kolagenase I (Sigma-Aldrich, katalog no. C0130), 2 mg/mL
hyaluronidase (Sigma-Aldrich, katalog no. H3506), dan 25 mg/mL DNase I (Roche, katalog no. 11284932001) selama 45
menit pada 37°C dengan pengocokan (180-200 rpm). Setelah pencernaan jaringan, sel disaring menggunakan saringan sel
(40 mm, Thermo Fisher Scientific, katalog no. 223635447) dan disuspensikan kembali dalam larutan PBS+ yang dilengkapi
dengan 2 mmol/L EDTA dan 1% serum manusia (Sigma P2918) hingga konsentrasi akhir pada sekitar 5 × 10 5 sel dalam 50
L. Suspensi sel tunggal jaringan diwarnai dengan koktail antibodi yang dijelaskan dalam Tabel Tambahan S8. IHC dan
Analisis Gambar Jaringan Manusia Jaringan difiksasi dalam formalin buffer netral 10% selama 24 jam, kemudian
didehidrasi dan ditanamkan parafin, dan dipotong menjadi irisan 4 m. Slide dideparafinisasi dan antigen diambil dalam
buffer CC1 (TRIS-EDTA pH 8.1) pada 95 ° C selama 64 menit. Pewarnaan berurutan dengan langkah elusi setelah deteksi
antibodi pertama selesai. Antibodi pertama adalah anti-LRRC15 (Abcam ab150376) yang digunakan pada 2,5 g/mL. Elusi
dilakukan dengan buffer CC2 (berbasis sitrat-asetat dengan SDS 0,3%; pH 6,0; waktu: 8 menit pada suhu 100 °C). Antibodi
kedua adalah anti- CD8 (Abcam ab101500) yang digunakan pada 1:200 dan kontrol isotipe untuk keduanya adalah antibodi
monoklonal kelinci naif (Teknologi Pensinyalan Sel , katalog no. 3900S). Sistem pendeteksi yang digunakan adalah
OmniMap-Rbt -HRP dengan DAB untuk CD8 dan OmniMap-Rbt-HRP dengan Discovery purple untuk LRRC15. Slide pasien
diimunisasi oleh ahli patologi yang ahli di bidangnya (H. Koeppen). Gambar Brightfield diperoleh oleh platform pemindaian
slide otomatis Hamamatsu Nanozoomer pada perbesaran akhir 200×. Gambar dianalisis dengan versi 2019a dari paket
perangkat lunak Matlab (MathWorks). LRRC15 + fibroblas dan inti sel CD8 tersegmentasi oleh ambang intensitas dan
penyaringan morfologi sederhana dari gambar. Generasi RNA-seq Terurut Massal Suspensi sel tunggal diisolasi seperti
dijelaskan di atas. Untuk penyortiran yang dijelaskan pada Gambar 1, 4 individu hewan/kelompok diurutkan dari berikut ini:
pankreas sehat albino B6, KPP pankreas dengan tumor <4 mm, atau KPP pankreas dengan tumor > 10 mm. Sampel
diwarnai dan disortir untuk EPCAM , CD45 , TER119 , ITGA6 , CD31 , viabel ( Life Technologies) dan kemudian populasi
PDPN + PDGFRa + , atau PDPN disortir langsung ke dalam TRIzol

dan kemurnian dinilai pada alikuot kecil yang diurutkan ke dalam PBS sebagai 95%
atau lebih tinggi. RNA diisolasi menurut Universal RNeasy Kit
(Qiagen). RNA diprofilkan dengan Bioanalyzer Pico RNA Kit
(Agilent Technologies). Kit RNA input rendah (ClonTech) digunakan
untuk menghasilkan pustaka cDNA. Pustaka RNA-seq dimultipleks dan diurutkan menggunakan HiSeq 4000 untuk
menghasilkan 30 juta pembacaan 50-bp
ujung tunggal per pustaka. Generasi Perpustakaan Sekuensing Sel Tunggal Untuk pengurutan sel tunggal, tikus yang cocok
dengan usia dan jenis kelamin albino B6 dan KPP dikorbankan untuk masing-masing dari dua ulangan; 5 pankreas B6
albino digunakan untuk "normal"; 5 hewan KPP digunakan untuk sampel lain dengan jaringan yang dibagi menjadi
"berdekatan" (tidak ada massa), "tumor kecil" (tumor <4 mm), dan "tumor besar" (tumor 5-10 mm). Suspensi sel tunggal
diisolasi seperti dijelaskan di atas. Sampel diwarnai dan disortir untuk CD45 , TER119 , CD24a , CD31 , Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs di PDAC ARTIKEL PENELITIAN PENEMUAN KANKER FEBRUARI 2020 | 249
7AAD , Calcein Violet + , PDPN + . Suspensi sel tunggal yang diurutkan diubah menjadi pustaka scRNA-seq berkode dengan
menggunakan Pustaka Chromium Single Cell 3′, Kit Gel Bead & Multiplex, dan Kit Chip (10x Genomics), memuat sekitar
6.000 sel per pustaka dan mengikuti instruksi pabrik. Sampel diproses menggunakan kit yang berkaitan dengan kimia
pengkodean batang V2 dari 10x Genomics. Sampel tunggal diproses dalam satu sumur pelat PCR, memungkinkan semua
sel dari sampel diperlakukan dengan campuran induk yang sama dan dalam wadah reaksi yang sama. Untuk setiap
ulangan, semua sampel (non -maligna dan tumor) diproses secara paralel dalam siklus termal yang sama . Pustaka akhir
diprofilkan menggunakan Kit DNA Sensitivitas Tinggi Bioanalyzer (Agilent Technologies) dan dihitung menggunakan Kit
Kuantifikasi Perpustakaan Kapa (Kapa Biosystems). Setiap perpustakaan RNA-seq sel tunggal diurutkan dua kali dalam dua
jalur HiSeq 4000 (Illumina) untuk mendapatkan ujung tunggal, 98 bp, sekitar 500 juta bacaan per perpustakaan.
Pemrosesan Bioinformatika Data scRNA-seq Mouse Data RNA-seq sel tunggal untuk setiap ulangan diproses dengan
jumlah cellranger (CellRanger 2.1.0; 10x Genomics) menggunakan paket referensi khusus berdasarkan genom referensi
mouse GRCm38 dan model gen GENCODE. Tabel hitungan individu digabungkan menggunakan cellranger aggr untuk
mengurangi efek batch. Analisis data selanjutnya dilakukan pada R 3.5.1 dan paket Seurat (v 2.3.4). Dari set awal 14.916
sel, jumlah transkrip yang diukur sebagai pengidentifikasi molekuler unik (UMI) di setiap sel dinormalisasi dan log diubah
menjadi log (CPM/100+1; CPM = UMI count per million. Sel dengan setidaknya 1.200 terukur ditranskripsikan gen per sel
dipertimbangkan untuk analisis. Untuk menghilangkan noise dari tetesan yang mengandung lebih dari satu sel, kami fokus
pada sel dengan paling banyak 5.000 gen yang diukur. Sel mati dikeluarkan dengan mempertahankan sel dengan
pembacaan mitokondria kurang dari 3%, meninggalkan 13.454 sel untuk final Gen yang diinduksi karena stres disosiasi sel
tunggal yang diterbitkan sebelumnya (54) digunakan untuk menilai stres disosiasi di setiap sel dengan fungsi
AddModuleScore di Seurat (lihat bagian "Penghitungan Skor Sel Tunggal" di bawah untuk detailnya). - secara berurutan,
data yang dinormalisasi diskalakan untuk mengurangi jumlah UMI yang berbeda dan skor tanda tegangan. Sebelum
pengurangan dimensi, kami melakukan koreksi batch dengan Harmony (55) versi 0. 0.0.9000 seperti yang dijelaskan dalam
tutorial di http://htmlpreview.github.io/?https://github.com/immuno genomics/harmony/blob/master/docs/SeuratV2.html.
Kami menyesuaikan parameter penalti keanggotaan cluster theta menjadi 1, untuk memberikan kekuatan yang kurang kuat
dalam menggabungkan sel di seluruh ulangan. Pengurangan dimensi dilakukan dengan paket Seurat (56). Sebelum PCA,
kami mengidentifikasi 1.000 gen paling variabel (Seurat, FindVariableGenes menggunakan rata-rata nilai yang
ditransformasikan log dan varians ke rasio rata-rata dalam non-logspace) dan menerapkan PCA ke sel-sel dalam ruang gen
ini. Komponen utama 1 sampai 20 disediakan sebagai masukan untuk pengurangan dimensi melalui t-SNE dan UMAP
dengan parameter default di Seurat. Cluster sel diidentifikasi berdasarkan grafik tetangga terdekat bersama antara sel dan
algoritma smart moving (SLM) (k = 40, resolusi = 0,7). Penanda untuk setiap cluster diidentifikasi dengan mengurangi
jumlah gen kandidat menjadi gen yang (i) setidaknya log (0,25) kali lipat lebih tinggi diekspresikan dalam cluster yang
dipertimbangkan dibandingkan dengan semua cluster lain dan (ii) diekspresikan dalam setidaknya 10% sel dalam cluster
yang sedang dipertimbangkan. Untuk gen yang melewati kriteria tersebut, signifikansi antara sel dalam cluster versus
semua sel lain dihitung menggunakan uji jumlah peringkat Wilcoxon dan disesuaikan dengan metode Benjamini-Hochberg.
Perhitungan Skor Sel Tunggal Skor untuk sel tunggal dihitung sebagai ekspresi relatif rata-rata dari satu set gen yang
diinginkan, dikurangi ekspresi relatif rata-rata dari set gen kontrol untuk menjelaskan perbedaan teknis antar sel, seperti
yang dijelaskan oleh Tirosh dan rekan (57) dan diimplementasikan dalam fungsi Seurat AddModuleScore. Untuk
mendapatkan gen untuk garis keturunan P3 dan P4, kami menggunakan 20 gen yang paling diregulasi secara signifikan (P
adj <0,00001, diurutkan berdasarkan logFC rata-rata) di masing-masing dari dua populasi normal untuk menilai semua sel
untuk dua program ekspresi ini. Untuk mendapatkan tanda tangan Kolagen, kami menggunakan semua gen penyandi
Kolagen yang diekspresikan dalam kumpulan data lengkap untuk menilai setiap sel. Rekonstruksi Pseudotime Lintasan
pseudotime sel tunggal dibangun dengan Monocle versi 2.8.0 independen untuk masing-masing dari dua garis keturunan
fibroblas, karena Monocle 2 tidak mendukung lintasan dengan banyak akar. Untuk setiap lintasan, kami mengumpulkan
satu set 400 gen pengurut yang mendefinisikan perkembangan CAF dengan menguji setiap gen untuk ekspresi diferensial
antara fibroblas normal dari garis keturunan masing-masing dan fibroblas dari tumor stadium akhir (P adj <0,001, diurutkan
berdasarkan logFC, 200 paling upregulated dan 200 gen downregulated). Profil ekspresi direduksi menjadi dua dimensi
menggunakan algoritme DDRTree yang disertakan dengan Monocle 2 melalui metode reduceDimension dan sel yang
diurutkan di sepanjang lintasan menggunakan metode orderCells, keduanya dengan parameter default. Jalur Analisis
Pengayaan dan Pengayaan Ontologi Gen untuk gen spesifik klaster dihitung masing-masing menggunakan
ConsensusPathDB (58) dan DAVID (59). Gen dengan P adj <0,00001, log (0,25) lipat lebih tinggi yang diekspresikan dalam
cluster dan diekspresikan dalam> 10% sel berfungsi sebagai input untuk analisis. Pengayaan situs pengikatan faktor
transkripsi (TFBS) dihitung menggunakan layanan web OPOSSUM (60). Jalur dengan P adj <0,05 dianggap diperkaya secara
signifikan untuk analisis jalur; Motif TF dengan z-score >10 dianggap diperkaya. Perhitungan z-score di OPOSSUM
menggunakan pendekatan normal pada distribusi binomial untuk membandingkan tingkat kemunculan TFBS dalam
kumpulan gen target dengan tingkat perkiraan yang diperkirakan dari kumpulan latar belakang yang telah dihitung
sebelumnya. Pemrosesan Bioinformatika Data Massal RNA-seq Data RNA-seq massal dari GEMM dan model tikus
subkutan diproses seperti yang dijelaskan sebelumnya (32). Secara singkat, pembacaan disejajarkan dengan genom
referensi tikus (mm10) menggunakan versi GSNAP “2013-10-10,” memungkinkan maksimum dua ketidakcocokan per 75
urutan dasar (parameter: “-M 2 -n 10 -B 2 - i 1 -N 1 -w 200000 -E 1 –pairmax-rna = 200000 –clip-overlap”). Untuk mengukur
tingkat ekspresi gen , jumlah pembacaan yang dipetakan ke ekson masing-masing gen dihitung dengan cara khusus untai
menggunakan fungsionalitas yang disediakan oleh paket R GenomicAlignments. Untuk visualisasi peta panas, jumlah per
gen dinormalisasi ke Baca Per Kilobase Juta (RPKM) dalam setiap sampel untuk memperhitungkan perbedaan panjang
transkrip dan kedalaman pengurutan. Gen yang diekspresikan secara berbeda antar kelompok ditentukan menggunakan
paket R limma (61) setelah dipangkas rata-rata normalisasi nilai-M, yang menerapkan pendekatan Bayesian empiris untuk
memperkirakan perubahan ekspresi gen menggunakan uji t yang dimoderasi. Pemrosesan Bioinformatika Data PDAC
scRNA-seq Manusia Data dari 24 pasien dengan PDAC dan 11 jaringan pankreas kontrol diperoleh dari Arsip Urutan Genom
di bawah proyek PRJCA001063 dalam format FASTQ. Data RNA-seq sel tunggal untuk setiap pasien diproses dengan
jumlah cellranger (Cell Ranger 3.0.2; 10x Genomics) menggunakan parameter standar dan menyediakan paket referensi
khusus berdasarkan genom referensi manusia model gen GRCh38 dan GENCODE. Sampel dari 22 pasien dan 11 jaringan
kontrol yang bahan kimianya benar terdeteksi oleh Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-
pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022 Dominguez dkk. PASAL PENELITIAN 250 | CANCER
DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org Cell Ranger dari data sekuensing digunakan untuk analisis hilir. Analisis
data selanjutnya dilakukan pada R 3.5.1 dan paket Seurat (v 3.0.2). Sel dengan setidaknya 300 gen transkripsi terukur per
sel dipertimbangkan untuk analisis. Untuk menghilangkan noise dari tetesan yang mengandung lebih dari satu sel, kami
memfokuskan pada sel dengan paling banyak 6.000 gen yang diukur. Sel-sel mati dikeluarkan dengan mempertahankan
sel-sel dengan pembacaan mitokondria kurang dari 15% meninggalkan 84.276 sel untuk analisis akhir. Selanjutnya, data
dinormalisasi menjadi log (CPM/100+1) dan diskalakan dengan menurunkan jumlah UMI yang berbeda dan fraksi
pembacaan mitokondria selama penskalaan. Pengurangan dimensi dilakukan dengan paket Seurat . Sebelum PCA, kami
mengidentifikasi 2.000 gen paling bervariasi dan menerapkan PCA ke sel dalam ruang gen ini. Komponen utama 1 hingga
20 disediakan sebagai input untuk pengurangan dimensi melalui UMAP dengan parameter default. Cluster sel diidentifikasi
berdasarkan grafik tetangga terdekat bersama antara sel dan algoritma smart moving (SLM) (resolusi = 0,1). Penanda
untuk setiap cluster diidentifikasi dengan mengurangi jumlah gen kandidat menjadi gen yang (i) setidaknya log (0,25) kali
lipat lebih tinggi diekspresikan dalam cluster yang dipertimbangkan dibandingkan dengan semua cluster lain dan (ii)
diekspresikan dalam setidaknya 10 % sel dalam cluster yang sedang dipertimbangkan . Untuk gen yang melewati kriteria
tersebut, signifikansi antara sel dalam cluster versus semua sel lainnya dihitung menggunakan uji jumlah peringkat
Wilcoxon dan disesuaikan dengan metode Benjamini-Hochberg (62). Ekspresi rata-rata dalam kelompok individu dihitung
dengan fungsi AverageExpression di Seurat dan selanjutnya z-score ditransformasikan untuk setiap gen. Rentang minimum
untuk menyimpulkan struktur garis keturunan global CAF dihitung menggunakan Slingshot (19) dengan parameter default
dan mendefinisikan fibroblas normal ( populasi paling kiri dari PC1) sebagai awal dan TGFβ CAF (populasi paling kanan dari
PC1) sebagai titik akhir. Mutasi KRAS G12X di setiap sel diidentifikasi secara manual dari pembacaan individu dalam file
penyelarasan BAM yang divisualisasikan melalui Integrative Genomics Viewer (63) dan ditetapkan ke sel melalui tag CB
dalam file BAM. Perubahan jumlah salinan disimpulkan dari data RNA-seq sel tunggal dengan paket CONICS R (64)
menggunakan sel asinar nonmaligna sebagai sel referensi. Prosedur penyaringan dan normalisasi default diikuti,
sebagaimana diuraikan dalam https://goo.gl/tFYLEh. Pemrosesan Bioinformatika Data scRNA-seq HNSCC Manusia Data
yang dinormalisasi dari 18 pasien dengan HNSCC (43) diperoleh dari Gene Expression Omnibus (GEO; GSE103322) sebagai
log(CPM/10+1) yang mengubah matriks jumlah gen-demi-sel. Anotasi tipe sel (ganas/ nonmaligna , serta tipe sel imun dan
stroma untuk sel nontumor) untuk setiap sel diunduh dari repositori GEO yang sama. Data diskalakan dengan mengurangi
jumlah UMI yang berbeda dan penggunaan enzim yang berbeda untuk persiapan perpustakaan scRNA-seq selama
penskalaan. Pengurangan dimensi dilakukan dengan paket Seurat. Sebelum PCA, kami mengidentifikasi 2.000 gen paling
bervariasi dan menerapkan PCA ke sel dalam ruang gen ini. Komponen utama 1 sampai 30 disediakan sebagai masukan
untuk pengurangan dimensi melalui UMAP dengan parameter default di Seurat (v3.0.2). Kelompok sel diidentifikasi
berdasarkan grafik tetangga terdekat bersama antara sel dan algoritma smart moving (SLM) (resolusi = 0,4). Pemrosesan
Bioinformatika Data KPC scRNA-seq Mouse Data yang diperkaya fibroblast yang dinormalisasi dari 4 tikus KPC (36)
diperoleh dari GEO (GSE129455) sebagai log (jumlah UMI di setiap sel sama dengan jumlah UMI median di seluruh dataset)
gen yang ditransformasi -matriks jumlah sel. ID Ensembl diubah menjadi nama gen menggunakan paket biomart R (65).
Data diskalakan, mengurangi jumlah UMI yang berbeda selama penskalaan. Pengurangan dimensi dilakukan dengan paket
Seurat . Sebelum PCA, kami mengidentifikasi 3.000 gen paling bervariasi dan menerapkan PCA ke sel dalam ruang gen ini.
Komponen utama 1 sampai 20 disediakan sebagai masukan untuk pengurangan dimensi melalui UMAP dengan parameter
default di Seurat (v3.0.2). Kelompok sel diidentifikasi berdasarkan grafik tetangga terdekat bersama antara sel dan
algoritma smart moving (SLM) (resolusi = 0,2). Pemrosesan Bioinformatika Data Massal RNA-seq Manusia Perbandingan
tingkat LRRC15 yang dinormalisasi antara tumor dari TCGA dan jaringan inangnya dari GTEx diambil dari platform web
GEPIA (66) dan disaring untuk jenis tumor dengan perbedaan yang signifikan antara jaringan normal dan tumor. Jumlah
ekspresi mentah per sampel stroma mikrodiseksi (n = 122) dan sampel tumor (n = 65) (42) diunduh dari GEO (GSE93326).
Jumlah ekspresi mentah per sampel RNA-seq pankreas normal (n = 247) diunduh dari GTEx (67). Kedua set data
dinormalisasi ke Log 2 (CPM+1) dan peta panas dihasilkan menggunakan paket pheatmap R (https://cran.r-
project.org/web/packages/pheatmap/) menggunakan pengelompokan tautan lengkap dan dengan jarak Euclidean sebagai
pengukur jarak . Untuk analisis data TCGA pan-kanker, efek batch TCGA Pan-Cancer (PANCAN) data mRNA yang
dinormalisasi diunduh dari UCSC XenaBrowser (https://xenabrowser.net) yang menyediakan gen dengan matriks sampel
log 2 (norm_value+1) menghitung tabel dan metadata pasien. Dari set awal n = 11.060 sampel, kami hanya menggunakan
sampel yang dianotasi sebagai "Tumor Primer" atau "Tambahan - Primer Baru" dalam tabel metadata yang menghasilkan
9.712 sampel dari 31 jenis kanker yang berbeda. Analisis Data Percobaan Imunoterapi Seluruh data transkriptom dari
pasien yang terdaftar dalam percobaan imunoterapi anti-PD-L1 (atezolizumab) IMvigor210 (NCT02951767, NCT02108652;
ref. 68), dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (32). Data dari percobaan imunoterapi anti-PD-L1 (atezolizumab)
PCD (NCT01375842) dihasilkan seperti yang diberikan dalam ref. 69. Untuk perhitungan skor LRRC15 CAF dari data
ekspresi, tanda tangan dihitung dengan menggunakan metode eigenWeightedMean dari paket MultiGSEA R
(https://github.com/lianos/multiGSEA). Secara singkat, ekspresi setiap gen dalam tanda tangan pertama kali
ditransformasikan skor-z. Kemudian, PCA dilakukan; bobot untuk gen dihitung dengan persentase yang mereka
kontribusikan pada komponen utama pertama yang ditunjukkan oleh eigenene. Akhirnya, rata-rata tertimbang per sampel
dihitung sebagai skor akhir. Pendekatan ini memiliki keuntungan dalam memfokuskan skor untuk himpunan pada blok
terbesar dari gen yang berkorelasi baik (atau antikorelasi) dalam himpunan, sementara menurunkan bobot kontribusi dari
gen yang tidak dilacak dengan anggota himpunan lainnya. Untuk analisis kelangsungan hidup, pasien dibagi menjadi
kelompok ekspresi rendah dan tinggi berdasarkan median. Kurva Kaplan–Meier dihasilkan menggunakan paket RMS R
(http://biostat.mc.vanderbilt.edu/wiki/Main/ Rrms). Ketersediaan Data Data RNA-seq sel tunggal dari mouse PDAC KPP
GEMM tersedia dari database ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/ arrayexpress) dengan nomor aksesi E-MTAB-8483.
Pengungkapan Potensi Konflik Kepentingan Semua penulis kecuali C. Klijn adalah karyawan Genentech. C. Klijn adalah
karyawan Genmab. Kontribusi Penulis Konsep dan desain: CX Dominguez, SJ Turley Pengembangan metodologi: CX
Dominguez, H. Koeppen Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh
tamu pada 26 September 2022 Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15 + CAFs di PDAC ARTICLE PENELITIAN FEBRUARI
2020 PENEMUAN KANKER | 251 Akuisisi data (hewan yang disediakan, pasien yang diperoleh dan dikelola, fasilitas yang
disediakan, dll.): CX Dominguez, S. Keerthivasan, H. Koeppen, S. Gierke, B. Breart, O. Foreman, TW Bainbridge, A. Castiglioni,
Z. Madrusan, Y. Liang, MR Junttila Analisis dan interpretasi data (misalnya, analisis statistik, biostatistik, analisis
komputasi): CX Dominguez, S. Muller, S. Keerthivasan, H. Koeppen, J. Hung, S. Gierke, O. Foreman, Y. Senbabaoglu, MR
Junttila, R. Bourgon, SJ Turley Penulisan, review, dan/atau revisi naskah: CX Dominguez, S. Muller, S. Keerthivasan, H.
Koeppen, J. Hung, A. Castiglioni, MR Junttila, C. Klijn, R. Bourgon, SJ Turley Dukungan administratif, teknis, atau material
(yaitu, pelaporan atau pengorganisasian data, pembuatan database): S. Keerthivasan, A. Castiglioni Pengawasan studi: MR
Junttila, C. Klijn , SJ Turley Ucapan Terima Kasih Kelompok inti aliran sitometri kami melakukan semua penyortiran sel yang
dijelaskan dalam penelitian ini. Kelompok inti teknologi genotipe dan reproduksi murine internal kami sangat berharga
untuk pekerjaan yang dilakukan dalam penelitian ini. Terima kasih kepada Alex T. Ritter atas sarannya tentang konstruksi
retrovirus yang digunakan dalam proyek ini. Terima kasih kepada Jeffrey Eastham- Anderson atas keahlian dan sarannya
dalam kuantifikasi otomatis data pencitraan. Terima kasih kepada anggota laboratorium Turley atas masukan dan diskusi
ilmiah mereka. Biaya publikasi artikel ini sebagian dibiayai oleh pembayaran biaya halaman. Oleh karena itu, artikel ini harus
dengan ini ditandai sebagai iklan sesuai dengan 18 USC Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Diterima 5
Juni 2019; direvisi 24 September 2019; diterima 4 November 2019; diterbitkan pertama 7 November 2019. REFERENSI 1.
Stark AP, Sacks GD, Rochefort MM, Donahue TR, Reber HA, Tomlinson JS, et al. Kelangsungan hidup jangka panjang pada
pasien dengan adenokarsinoma duktus pankreas. Bedah 2016;159:1520–7. 2. Kraman M, Bambrough PJ, Arnold JN,
Roberts EW, Magiera L, Jones JO, dkk. Penekanan kekebalan antitumor oleh sel stroma yang mengekspresikan protein
aktivasi fibroblas-α. Sains 2010;330: 827–30. 3. Lo A, Wang L-CS, Scholler J, Monslow J, Avery D, Newick K, dkk.
Desmoplasia yang memicu tumor terganggu dengan menipisnya sel stroma yang mengekspresikan FAP. Kanker Res
2015;75:2800–10. 4. zdemir BC, Pentcheva-Hoang T, Carstens JL, Zheng X, Wu CC, Simpson TR, dkk. Penipisan fibroblas
dan fibrosis terkait karsinoma menginduksi imunosupresi dan mempercepat kanker pankreas dengan penurunan
kelangsungan hidup. Sel Kanker 2015;28: 831–3. 5. Santos AM, Jung J, Aziz N, Kissil JL, Puré E. Menargetkan protein
aktivasi fibroblast menghambat stromagenesis tumor dan pertumbuhan pada tikus. J Clin Invest 2009;119:3613–25. 6.
Wang L-CS, Lo A, Scholler J, Sun J, Majumdar RS, Kapoor V, dkk. Menargetkan protein aktivasi fibroblas dalam stroma
tumor dengan sel T reseptor antigen chimeric dapat menghambat pertumbuhan tumor dan meningkatkan imunitas inang
tanpa toksisitas berat. Kanker Immunol Res 2014;2: 154–66. 7. LeBleu VS, Kalluri R. Mengintip fibroblas terkait kanker: asal,
fungsi, dan dampak translasi. Dis Model Mech 2018; 11:dmm029447. 8. Avery D, Govindaraju P, Jacob M, Todd L, Monslow
J, Pure E. Matriks ekstraseluler mengarahkan heterogenitas fenotipik fibroblas yang diaktifkan . Matriks Biol 2018;67:90–
106. 9. Costa A, Kieffer Y, Scholer-Dahirel A, Pelon F, Bourachot B, Cardon M, dkk. Heterogenitas fibroblas dan lingkungan
imunosupresif pada kanker payudara manusia. Sel Kanker 2018;33: 463–79. 10. Feig C, Jones JO, Kraman M, Wells RJ,
Deonarine A, Chan DS, dkk. Menargetkan CXCL12 dari fibroblas terkait karsinoma yang mengekspresikan FAP bersinergi
dengan imunoterapi anti-PD-L1 pada kanker pankreas Proc Natl Acad Sci USA 2013;110:20212–7. 11. Apte M, Haber P,
Applegate T, Norton I, McCaughan G, Korsten M, dkk. Sel berbentuk bintang periacinar di pankreas tikus: identifikasi, isolasi,
dan kultur. Gut 1998;43:128–33. 12. Aguirre AJ, Bardeesy N, Sinha M, Lopez L, Tuveson DA, Horner J, dkk. Defisiensi Kras
dan Ink4a/Arf yang diaktifkan bekerja sama untuk menghasilkan adenokarsinoma duktus pankreas metastatik. Gens Dev
2003;17: 3112–26. 13. Chung WJ, Daemen A, Cheng JH, Long JE, Cooper JE, Wang B, dkk. Model tikus rekayasa genetika
mutan Kras dari kanker manusia secara genomik heterogen. Proc Natl Acad Sci USA 2017; 114:E10947–55. 14. Hruban RH,
Adsay VN, Albores-Saavedra J, Anver MR, Biankin AV, Boivin GP, ​dkk. Patologi model tikus rekayasa genetika kanker
eksokrin pankreas: laporan konsensus dan rekomendasi. Kanker Res 2006;66:95–106. 15. Erkan M, Reiser-Erkan C,
Michalski CW, Deucker S, Sauliunaite D, Streit S, dkk. Interaksi sel kanker-bintang mengabadikan siklus hipoksia-fibrosis
pada adenokarsinoma duktus pankreas. Neoplasia 2009; 11:497–508. 16. Buechler MB, Kim KW, Onufer EJ, Williams JW,
Little CC, Dominguez CX, dkk. Ceruk stroma yang ditentukan oleh ekspresi faktor transkripsi WT1 memediasi pemrograman
dan homeostasis makrofag penghuni rongga. Imunitas 2019;51:119–30. 17. Cremasco V, Astarita JL, Grauel AL,
Keerthivasan S, MacIsaac KD, Woodruff MC, dkk. FAP menggambarkan sel stroma yang heterogen dan berbeda secara
fungsional pada tumor payudara yang dikecualikan dari kekebalan Kanker Immunol Res 2018;6:1472–85. 18. Xie T, Wang Y,
Deng N, Huang G, Taghavifar F, Geng Y, dkk. Dekonvolusi sel tunggal dari heterogenitas fibroblas pada fibrosis paru tikus.
Perwakilan Sel 2018;22:3625–40. 19. Jalan K, Risso D, Fletcher RB, Das D, Ngai J, Yosef N, dkk. Katapel: garis keturunan sel
dan inferensi waktu semu untuk transkriptomik sel tunggal. BMC Genomics 2018;19:477. 20. Kalluri R. Membran basement:
struktur, perakitan dan peran dalam angiogenesis tumor. Kanker Rev Nat 2003; 3:422–33. 21. Groulx JF, Gagné D, Benoit YD,
Martel D, Basora N, Beaulieu JF. Kolagen VI adalah komponen membran basal yang mengatur interaksi sel-fibronektin
epitel. Matrix Biol 2011;30:195–206. 22. Steele CW, Karim SA, Leach J, Bailey P, Upstill-Goddard R, Rishi L, dkk.
Penghambatan CXCR2 sangat menekan metastasis dan meningkatkan imunoterapi pada adenokarsinoma duktus
pankreas. Sel Kanker 2016;29:832–45. 23. Sano M, Ijichi H, Takahashi R, Miyabayashi K, Fujiwara H, Yamada T, dkk.
Memblokir sumbu CXCLs-CXCR2 dalam interaksi tumor-stroma berkontribusi pada kelangsungan hidup pada model tikus
adenokarsinoma duktus pankreas melalui pengurangan invasi/migrasi sel dan pergeseran lingkungan mikro inflamasi
imun. Onkogenesis 2019;8:8. 24. Long KB, Gladney WL, Tooker GM, Graham K, Fraietta JA, Beatty GL. IFNγ dan CCL2
bekerja sama untuk mengarahkan kembali monosit yang menginfiltrasi tumor untuk menurunkan fibrosis dan
meningkatkan kemanjuran kemoterapi pada karsinoma pankreas. Cancer Discov 2016;6:400–13. 25. Jackson HW, Defamie
V, Waterhouse P, Khokha R. TIMPs: regulator ekstraseluler serbaguna pada kanker. Nat Rev Kanker 2017;17:38. 26. Goel H,
Mercurio AM. VEGF menargetkan sel tumor. Kanker Rev Nat 2013;13:871–82. 27. Liang M, Ma Q, Ding N, Luo F, Bai Y, Kang
F, dkk. IL-11 penting dalam mempromosikan osteolisis pada metastasis tulang kanker payudara melalui aktivasi
osteoklastogenesis yang tidak bergantung pada RANKL. Kematian Sel Dis 2019;10:353. Diunduh dari
http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26 September 2022
Dominguez et al. PASAL PENELITIAN 252 | CANCER DISCOVERY FEBRUARI 2020 AACRJournals.org 28. Shi Y, Gao W, Lytle
NK, Huang P, Yuan X, Dann AM, dkk. Menargetkan interaksi parakrin yang dimediasi LIF untuk terapi dan pemantauan
kanker pankreas . Alam 2019;569:131–5. 29. Pietras K, Sjöblom T, Rubin K, Heldin CH, reseptor stman A. PDGF sebagai
target obat kanker. Sel Kanker 2003; 3:439–43. 30. D'Costa Z, Jones K, Azad A, van Stiphout R, Lim SY, Gomes AL, dkk.
TIMP1 yang diinduksi Gemcitabine melemahkan respons terapi dan mendorong pertumbuhan tumor dan metastasis hati
pada kanker pankreas. Kanker Res 2017;77:5952–62. 31. Costa-Silva B, Aiello NM, Ocean AJ, Singh S, Zhang H, Thakur B,
dkk. Eksosom kanker pankreas memulai pembentukan niche pra-metastasis di hati. Nat Cell Biol 2015;17:816–26. 32.
Mariathasan S, Turley SJ, Nikel D, Castiglioni A, Yuen K, Wang Y, dkk. TGFβ melemahkan respon tumor terhadap blokade PD-
L1 dengan berkontribusi pada eksklusi sel T. Alam 2018;554:544.

33. Ling J, Kang Y, Zhao R, Xia Q, Lee DF, Chang Z, dkk. Aktivasi
IKK2/β/NF-κB yang diinduksi KrasG12D oleh IL-1α dan
loop feedforward p62 diperlukan untuk perkembangan adenokarsinoma duktus pankreas
. Sel Kanker 2012;21:105–20.
34. Schmid MC, Avraamides CJ, Foubert P, Shaked Y, Kang S, Kerbel RS,
dkk. Gabungan blokade integrin-β1 plus sitokin SDF-1α atau
IL-1β berpotensi menghambat peradangan dan pertumbuhan tumor. Kanker Res
2011;71:6965–75.
35. Tjomsland V, Bojmar L, Sandström P, Bratthäll C, Messmer D,
Spångeus A, dkk. Ekspresi IL-1α pada adenokarsinoma duktus pankreas
mempengaruhi migrasi sel tumor dan diatur oleh
jalur pensinyalan p38MAPK. PLoS One 2013;8:e70874.
36. Elyada E, Bolisetty M, Laise P, Flynn WF, Courtois ET, Burkhart RA,
dkk. Analisis sel tunggal lintas spesies dari adenokarsinoma duktus pankreas
mengungkapkan fibroblas terkait kanker yang menyajikan antigen.
Cancer Discov 2019;9:1102–23.
37. Calon A, Espinet E, Palomo-Ponce S, Tauriello D, Iglesias M, Céspedes
M, dkk. Ketergantungan kanker kolorektal pada program yang digerakkan oleh TGF-β
dalam sel stroma untuk inisiasi metastasis. Sel Kanker 2012;22:
571–84.
38. Purcell JW, Tanlimco SG, Hickson JA, Fox M, Sho M, Durkin L,
dkk. LRRC15 adalah protein mesenchymal baru dan target stroma
untuk konjugat antibodi-obat. Kanker Res 2018;78:4059–72.
39. Bausch-Fluck D, Hofmann A, Bock T, Frei AP, Cerciello F, Jacobs A,
dkk. Atlas protein permukaan sel yang diturunkan dari spektrometri massa. PLoS
One 2015;10:e0121314.
40. hlund D, Handly-Santana A, Biffi G, Elyada E, Almeida AS,
Ponz-Sarvise M, dkk. Populasi yang berbeda dari fibroblas inflamasi
dan miofibroblas pada kanker pankreas. J Exp Med 2017;
214:579–96.
41. Peng J, Sun BF, Chen CY, Zhou JY, Chen YS, Chen H, dkk. RNA- seq
sel tunggal menyoroti heterogenitas intra-tumor dan
perkembangan ganas pada adenokarsinoma duktus pankreas. Res Sel 2019;
29:725–38.
42. Maurer C, Holmstrom SR, He J, Laise P, Su T, Ahmed A, dkk. Mikrodiseksi
eksperimental memungkinkan harmonisasi fungsional
subtipe kanker pankreas. Usus 2019;68:1034.
43. Puram SV, Tirosh I, Parikh AS, Patel AP, Yizhak K, Gillespie S, dkk.
Analisis transkriptomik sel tunggal dari ekosistem tumor primer dan metastatik
pada kanker kepala dan leher. Sel 2017;171:1611–24.
44. Principe DR, Park A, Dorman MJ, Kumar S, Viswakarma N, Rubin
J, dkk. Blokade TGFβ menambah penghambatan PD-1 untuk mempromosikan
regresi kanker pankreas yang dimediasi sel-T. Kanker Mol Ada
2018;18:613–20.
45. Moffitt RA, Marayati R, Flate EL, Volmar KE, Loeza GS, Hoadley KA,
dkk. Mikrodiseksi virtual mengidentifikasi
subtipe spesifik tumor dan stroma dari adenokarsinoma duktus pankreas. Nat Genet
2015;47:1168.
46. ​Thorsson V, Gibbs DL, Brown SD, Wolf D, Bortone DS, Yang TH,
dkk. Lanskap kekebalan kanker. Kekebalan 2018;48:812–30.
47. Biffi G, Oni TE, Spielman B, Hao Y, Elyada E, Park Y, dkk.
Pensinyalan JAK/STAT yang diinduksi IL-1 dilawan oleh TGF-beta untuk membentuk
heterogenitas CAF pada adenokarsinoma duktus pankreas. Cancer
Discov 2018;9:282–301.
48. Koopmans T, Rinkevich Y. Transisi mesotel ke mesenkim sebagai
pemain perkembangan dan patologis utama dalam organ batang dan
rongganya. Biologi Komunitas 2018;1:170.
49. Corcoran RB, Contino G, Deshpande V, Tzatsos A, Conrad C, Benes
CH, dkk. STAT3 Memainkan Peran Penting dalam
tumorigenesis pankreas yang diinduksi KRAS. Kanker Res 2011;71:5020–9.
50. Shien K, Papadimitrakopoulou VA, Ruder D, Behrens C, Shen L,
Kalhor N, dkk. Aktivasi JAK1/STAT3 melalui
jalur sitokin proinflamasi menyebabkan resistensi terhadap
terapi yang ditargetkan secara molekuler pada kanker paru-paru non-sel kecil. Kanker Mol Ada 2017;16:
2234–45.
51. Grivennikov SI, Karin M. Penghubung berbahaya:
kolaborasi STAT3 dan NF-κB dan crosstalk pada kanker. Faktor Pertumbuhan Sitokin Rev
2010;21:11-9.
52. Fletcher AL, Malhotra D, Acton SE, Lukacs-Kornek V, Bellemare-
Pelletier A, Curry M, dkk. Isolasi sel stroma kelenjar getah bening yang dapat direproduksi mengungkapkan perbedaan yang
bergantung pada lokasi dalam sel
retikuler fibroblastik .
Depan Immunol 2011;2:35.
53. Morgan-Lappe S, Gish KC, Hickson JA, Purcell JW, penemu. Konjugat obat antibodi anti
-huLRRC15 dan metode penggunaannya.
54. van den Brink SC, Sage F, Vertesy , Spanjaard B, Peterson-Maduro
J, Baron CS, dkk. Sekuensing sel tunggal mengungkapkan
ekspresi gen yang diinduksi disosiasi dalam subpopulasi jaringan Metode Nat 2017; 14:
935–6.
55. Korsunsky I, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, Baglaenko Y,
dkk. Integrasi data sel tunggal yang cepat, sensitif, dan akurat
dengan Harmony. Metode Nat 2019 Nov 18 [Epub depan
cetak].
56. Stuart T, Butler A, Hoffman P, Hafemeister C, Papalexi E, Mauck WM,
dkk. Integrasi komprehensif data sel tunggal. Sel 2019;177:
1888–902.
57. Tirosh I, Venteicher AS, Hebert C, Escalante LE, Patel AP, Yizhak K,
dkk. RNA-seq sel tunggal mendukung hierarki perkembangan pada
oligodendroglioma manusia Alam 2016;539:309.
58. Herwig R, Hardt C, Lienhard M, Kamburov A. Menganalisis dan menafsirkan
data genom di tingkat jaringan dengan ConsensusPathDB.
Nat Protoc 2016;11:1889–907.
59. Huang D, Sherman BT, Tan Q, Collins JR, Alvord GW, Roayaei J,
dkk. Alat klasifikasi fungsional gen DAVID:
algoritme sentris modul biologis baru untuk secara fungsional menganalisis daftar gen besar.
Genom Biol 2007;8:R183.
60. Sui SJ, Mortimer JR, Arenillas DJ, Brumm J, Walsh CJ, Kennedy BP,
dkk. oPOSSUM: identifikasi
situs pengikatan faktor transkripsi yang terwakili secara berlebihan dalam gen yang diekspresikan bersama. Asam Nukleat
Res 2005;33:
3154–64.
61. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Hukum CW, Shi W, dkk. limma
memperkuat analisis ekspresi diferensial untuk studi sekuensing RNA dan
microarray. Asam Nukleat Res 2015;43:e47.
62. Benjamini Y, Hochberg Y. Mengontrol tingkat penemuan palsu: pendekatan
praktis dan kuat untuk beberapa pengujian. J Roy Stat Soc B
Methodol 1995;57:289–300.
63. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, Guttman M, Lander
ES, Getz G, dkk. Penampil genomik integratif. Nat Bioteknologi 2011;
29:24.
64. Müller S, Cho A, Liu SJ, Lim DA, Diaz A. CONICS mengintegrasikan scRNA-
seq dengan sekuensing DNA untuk memetakan ekspresi gen ke subklon tumor
. Bioinformatika 2018;34:3217–9.
65. Durinck S, Spellman PT, Birney E, Huber W. Pemetaan pengidentifikasi untuk
integrasi dataset genomik dengan paket R/Bioconductor
biomaRt. Nat Protoc 2009;4:1184.
66. Tang Z, Li C, Kang B, Gao G, Li C, Zhang Z. GEPIA: server web untuk
kanker dan profil ekspresi gen normal dan analisis interaktif.
Asam Nukleat Res 2017;45:W98–102.
67. Konsorsium GTEX, Laboratorium, Analisis Data &
Pusat Koordinasi (LDACC)—Kelompok Kerja Analisis, Metode Statistik
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022
Karakterisasi TGFa-Activated LRRC15
+ CAFs
di PDAC
ARTIKEL PENELITIAN
PENEMUAN KANKER FEBRUARI 2020 | 253
grup—Analisis Working Group, Enhancing GTEx (eGTEx) groups,
NIH Common Fund, NIH/NCI, dkk. Efek genetik pada ekspresi gen
di seluruh jaringan manusia. Alam 2017;550:204.
68. Rosenberg JE, Hoffman-Censits J, Powles T, van der Heijden
MS, Balar AV, Necchi A, dkk. Atezolizumab pada pasien dengan
karsinoma urothelial stadium lanjut dan metastasis lokal yang telah
berkembang setelah pengobatan dengan kemoterapi berbasis platinum
: percobaan fase 2 lengan tunggal, multisenter. Lancet 2016;387:
1909–20.
69. Kowanetz M, Zou W, Geter SN, Koeppen H, Kockx M, Schmid
P, dkk. Regulasi diferensial ekspresi PD-L1 oleh sel imun
dan sel tumor di NSCLC dan respons terhadap pengobatan dengan
atezolizumab (anti-PD-L1). Proc Nl Acad Sci USA 2018;115:
201802166.
Diunduh dari http://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-pdf/10/2/232/1804634/232.pdf oleh tamu pada 26
September 2022