Molecular mechanism underlying the pharmacological interactions of the

protein kinase C-β inhibitor enzastaurin and erlotinib in non-small cell

lung cancer cells

Mekanisme molekuler yang mendasari farmakologis interaksi dari protein

kinase C-β inhibitor enzastaurin dan erlotinib dalam non-kecil sel kanker
paru-paru
Abstrak

Erlotinib umumnya digunakan sebagai pengobatan lini kedua pada pasien kanker
paru-paru non-sel kecil dengan mutasi EGFR peka. Pada pasien tipe EGFR-liar, namun
hasilnya terbatas. Oleh karena itu kami mengevaluasi apakah kombinasi dari inhibitor Protein
kinase C-β enzastaurin dengan erlotinib dapat meningkatkan efek dalam garis sel A549 dan
H1650. Sitotoksisitas erlotinib, enzastaurin dan kombinasi simultan 72 jam dinilai dengan uji
MTT. Interaksi farmakologis dipelajari menggunakan metode Chou dan Talalay, gangguan
siklus sel dinilai dengan flow cytometry dan modulasi ERK1 / 2 dan fosforilasi AKT
ditentukan dengan ELISA. Untuk fosforilasi protein GSK3β kami melakukan analisis
Western Blot dan susunan fosforilasi Pamgene, sementara RT-PCR digunakan untuk
menyelidiki ekspresi VEGF dan VEGFR-2 sebelum dan sesudah perawatan obat. Interaksi
sinergis ditemukan di kedua garis sel dengan rata-rata CI 0,58 dan 0,63 dalam sel A549 dan
H1650, masing-masing. Enzastaurin sendiri dan dalam kombinasi dengan erlotinib
meningkatkan persentase sel dalam fase S dan G2M, sebagian besar dalam sel H1650,
sementara fosforilasi AKT, ERK1 / 2 dan GSK3β berkurang di kedua garis sel. Ekspresi
VEGF menurun 5,0 dan 6,9 kali lipat dalam sel A549 setelah enzastaurin saja dan dengan
erlotinib, masing-masing, sementara di H1650 hanya enzastaurin yang menyebabkan
penurunan yang relevan dalam ekspresi VEGF. Array menunjukkan fosforilasi diferensial
EGFR, GSK3β, EphA1 dan MK14. Kesimpulannya, enzastaurin adalah penghambat protein
kinase Cβ, bekerja pada beberapa jalur pensinyalan seluler yang terlibat dalam proliferasi,
apoptosis, dan angiogenesis. Fitur ini menjadikannya senyawa yang baik untuk terapi
kombinasi. Dalam penelitian ini, kombinasi enzastaurin dan erlotinib memberikan hasil
sinergis, yang membutuhkan penyelidikan lebih lanjut.

Kanker paru-paru sel non-kecil (NSCLC) saat ini penyebab utama kejadian kanker
dan kematian di seluruh dunia. Sekitar 70% pasien didiagnosis dengan NSCLC stadium
lanjut. Pengobatan lini pertama standar mereka untuk pasien ini adalah rejimen berbasis
platinum-doublet, kecuali profil molekuler menunjukkan adanya mutasi / penataan ulang gen
yang dapat ditindaklanjuti.

Dalam hal mutasi EGFR atau penataan ulang ALK, Inhibitor EGFR- atau ALK- telah
disetujui. Namun, subkelompok ini terbatas pada histologi adenokarsinoma dan masing-
masing terdiri sekitar 8% dan 3% dari populasi pasien ini. Jalur pensinyalan EGFR adalah
jalur pengemudi penting yang mengatur pertumbuhan, proliferasi, diferensiasi, dan
kelangsungan hidup dalam sel mamalia. Reseptor EGF berisi domain ekstra selular yang
terlibat dalam pengikatan ligan dan dimerisasi reseptor, domain hidrofobik, yang terlibat
dalam interaksi antara reseptor dan membran sel, dan intraseluler domain dengan aktivitas
enzim tirosin kinase. Stimulasi oleh ligan EGF atau faktor pertumbuhan terkait menyebabkan
reseptor homodimerisasi atau hetero-dimerisasi dan dengan demikian mengaktifkan
pensinyalan hilir, yang melibatkan jalur Ras dan Phosphatidyl Inositol 3 Kinase (PI3K)
antara lain (Gambar 1) [5]. Erlotinib adalah agen berbasis quinazoline dengan berat molekul
rendah, yang bertindak sebagai inhibitor kinase selektif dan reversibel dari reseptor faktor
pertumbuhan epidermal (EGFR) selektif dan dapat digunakan untuk mengobati pasien
NSCLC dengan mengaktifkan mutasi EGFR [2], sehingga menghambat pensinyalan ke hilir. .
Meskipun erlotinib saat ini digunakan dalam pengobatan beberapa kanker yang berbeda, dari
minoritas pasien yang mengalami mutasi kepekaan EGFR, 70-80% sensitif terhadap obat ini.
Secara khusus, Ras [6], mutasi EGFR T790M [7] dan amplifikasi cMET [8] telah dikaitkan
dengan resistensi primer dan didapat terhadap erlotinib.

Enzastaurin adalah bisindolylmaleimide asiklik oral, yang menghambat Protein

Kinase C β2, oleh kompetisi ATP [9, 10]. Rangkaian enzim protein kinase C terdiri dari 11
isoform protein kinase serin / treonin yang berperan dalam memberi isyarat kaskade beberapa
fungsi seluler, termasuk pertumbuhan sel, proliferasi dan apoptosis serta pertumbuhan kanker
[11]. Dalam NSCLC, peningkatan fosforilasi dan ekspresi diferensial dari isoform PKC telah
dijelaskan [12]. Peningkatan kadar PKC ini telah menyebabkan ekspresi berlebih dan
peningkatan sekresi faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) yang terlibat dalam neo-
angiogenesis [13]. Awalnya, enzastaurin dievaluasi pada tikus yang mengandung xenograft
tumor manusia untuk aktivitas anti-angiogeniknya. Karena penghambatan PKCβ, penurunan
kadar VEGF plasma dan penurunan kepadatan pembuluh darah pada tumor ditunjukkan [14].
Namun, mekanisme molekuler lainnya juga terlibat dalam aktivitas enzastaurin, seperti
penindasan PI3K / AKT, Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) dan protein ribosomal S6
[9].

Baik erlotinib dan enzastaurin secara selektif dapat bekerja pada pensinyalan kanker
yang menyimpang. Karena hanya sebagian kecil pasien NSCLC yang mengalami mutasi aktif
EGFR yang sensitif untuk erlotinib, menggabungkannya dengan enzastaurin dapat
meningkatkan efeknya. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki
apakah kombinasi erlotinib dan enzastaurin dapat memiliki efek sinergis dalam sel NSCLC,
dan untuk mengevaluasi mekanisme molekuler yang mendasari interaksi farmakologis. Untuk
tujuan ini kami menggunakan sel NSCLC A549 dan H1650, yang ditandai dengan mutasi
Kras dan mutasi aktif EGFR, yang masing-masing mengurangi dan meningkatkan sensitivitas
terhadap erlotinib. Kombinasi dengan enzastaurin dapat menghambat jalur yang terlibat,
meningkatkan apoptosis dan mengurangi proliferasi. Sebagian kecil pasien NSCLC yang
mengalami mutasi pengaktif EGFR sensitif terhadap erlotinib, menggabungkannya dengan
enzastaurin dapat meningkatkan efeknya. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah
untuk menyelidiki apakah kombinasi erlotinib dan enzastaurin dapat memiliki efek sinergis
dalam sel NSCLC, dan untuk mengevaluasi mekanisme molekuler yang mendasari interaksi
farmakologis. Untuk tujuan ini kami menggunakan sel NSCLC A549 dan H1650, yang
ditandai dengan mutasi Kras dan mutasi aktif EGFR, yang masing-masing mengurangi dan
meningkatkan sensitivitas terhadap erlotinib. Kombinasi dengan enzastaurin dapat
menghambat jalur yang terlibat, meningkatkan apoptosis dan mengurangi proliferasi.
Sebagian kecil pasien NSCLC yang mengalami mutasi pengaktif EGFR sensitif terhadap
erlotinib, menggabungkannya dengan enzastaurin dapat meningkatkan efeknya. Oleh karena
itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki apakah kombinasi erlotinib dan
enzastaurin dapat memiliki efek sinergis dalam sel NSCLC, dan untuk mengevaluasi
mekanisme molekuler yang mendasari interaksi farmakologis. Untuk tujuan ini kami
menggunakan sel NSCLC A549 dan H1650, yang ditandai dengan mutasi Kras dan mutasi
aktif EGFR, yang masing-masing mengurangi dan meningkatkan sensitivitas terhadap
erlotinib. Kombinasi dengan enzastaurin dapat menghambat jalur yang terlibat, meningkatkan
apoptosis dan mengurangi proliferasi.

Bahan dan metode

Obat-obatan dan bahan kimia

Erlotinib (N- (3-ethynylphenyl) -6,7-bis (2 methoxyethoxy0- 4-quinazolinamine)

adalah hadiah dari Roche Pharmaceuticals, sementara enzastaurin hydrochloride (1H-Pyrrole-
2,5-dione, 3- (1-methyl 1Hindol- 3-yl) -4- [1- [1- (2-pyridinylmethyl) -4-piperidinyl] - 1H-
indol-3-yl] adalah hadiah dari Eli Lilly. Obat-obatan dilarutkan dalam DMSO dan diencerkan
dalam media kultur sebelum digunakan. Media RPMI, serum sapi janin (FBS), penisilin (50
IU / ml) dan streptomisin (50 ug / ml) diperoleh dari Gibco (Gaithersburg, MD). bahan kimia
lain diperoleh dari Sigma (St. Louis, MO).

Garis sel

Garis sel NSCLC manusia A549 dan H1650 diperoleh dari American Type Culture
Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) dan dibiakkan di RPMI (Flow Laboratories Irvine,
Skotlandia) dengan 10% panas FBS yang tidak aktif dan 1% penisilin dan streptomisin Gibco
Paisley, Inggris). Garis sel dipertahankan sebagai kultur monolayer dalam labu 75 cm2
(Costar, Cambridge, MA), pada suhu 37 ° C dan 5% CO2. Sel dipanen dengan trypsin-EDTA
(Invitrogen, Paisley, UK) ketika mereka berada dalam pertumbuhan eksponensial dan labu
adalah 75% pertemuan.

Uji sitotoksisitas

Penghambatan pertumbuhan diuji seperti yang dijelaskan sebelumnya [15].

Singkatnya, 5000 sel / sumur disepuh di piring 96-sumur dan dibiarkan melekat selama 24
jam. Sel-sel dirawat selama 72 jam dengan berbagai konsentrasi (0,1-50 μM atau 1-50 μM)
dari obat yang diteliti. Setelah perawatan, medium dihilangkan dan diganti dengan 50 μL /
sumur (3- (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5 diphenyltetrazolium bromide) larutan MTT (final
konsentrasi 0,42 mg / ml). Sel-sel diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 ° C. Kristal
formazan yang terbentuk dilarutkan dalam 150 μL / well DMSO, sambil dikocok selama 10-
20 menit. Absorbansi diukur pada 540 nm menggunakan pembaca lempeng mikro
spektrofotometri (Tecan Spectrafluor, Salzburg, Austria). Penghambatan pertumbuhan
dinyatakan sebagai persentase of control (kendaraan dirawat). Konsentrasi penghambatan
pertumbuhan sel (IC50) 50% diperkirakan dari kurva penghambatan pertumbuhan.
Studi kombinasi obat

Untuk mengevaluasi kemungkinan efek sinergis dari kedua obat, sel (5000 sel / baik)
diobati dengan rasio konstan yang dihitung sehubungan dengan nilai IC50 obat. Sitotoksisitas
kombinasi dibandingkan dengan sitotoksisitas masing-masing obat menggunakan indeks
kombinasi (CI) seperti yang dijelaskan oleh Chou dan Talalay [16]. Jika CI lebih rendah dari
0,8, obat bekerja secara sinergis, 0,8 <CI <1,2 berarti aditif, dan CI> 1,2 menunjukkan efek
antagonis [17]. Nilai tengah CI dihitung dari titik data FA> 0,5, karena nilai yang lebih
rendah tidak dianggap relevan untuk penghambatan pertumbuhan [18]. Data diproses
menggunakan Perangkat Lunak Calcusyn (Biosoft, Oxford, UK).

Analisis siklus sel

Flow cytometry digunakan untuk menentukan distribusi siklus sel dan kematian sel
dalam garis sel yang berbeda diobati dengan erlotinib, enzastaurin, kombinasi atau kendaraan
selama 72 jam. 500.000 sel dilapisi dalam plat 6 sumur (Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen, Jerman), dan pengobatan dimulai 24 jam setelah pelapisan sel. Setelah 72 jam
mengambang dan sel-sel yang melekat dikumpulkan dan dipindahkan ke dalam tabung
FALCON bulat-bawah (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Setelah sentrifugasi pelet sel
diselesaikan dalam 1 ml larutan hipotonik propidium iodida (PI) (50 mg / ml PI, 0,1%
natrium sitrat, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg / ml ribonuklease A) dan disimpan selama 30
menit di atas es . Analisis aliran cytometry dilakukan menggunakan FACScan

Tabel 1. Sensitivitas A549 dan H1650 Sel NSCLC terhadap erlotinib dan enzastaurin dan
kombinasi keduanya.

(BD Biosciences, Mount View, CA, USA), sementara analisis data dilakukan dengan
CELLQuest ™ perangkat lunak, menggunakan gerbang pada histogram DNA untuk
perkirakan jumlah sel dalam G1, S, dan Fase G2 / M, serta sel apoptosis dalam wilayah sub-
G1.
Tes ELISA

Untuk mempelajari aktivasi AKT dan ERK1 / 2, 500.000 sel terpapar dengan nilai
IC50 dari enzastaurin, erlotinib dan kombinasi enzastaurin-erlotinib selama 72 jam. Protein
diisolasi dan tes ELISA (Biosource International, Camarillo, CA, USA) untuk total AKT,
fosfo-AKT pada residu serine 473 (AKT [pS473]), total ERK1 / 2 dan ERK1 dual-
terfosforilasi ganda pada threonine 202 dan tyrosine 204 ( ERK1 [pTpY 202/204]) dan ERK2
berfosforilasi ganda pada threonine 185 dan tyrosine 187 (ERK2 [pTpY-185/187]) digunakan
untuk analisis aktivasi AKT dan ERK1 / 2. Analisis dilakukan sesuai dengan protokol
pabrikan. Semua hasil dinormalisasi untuk kandungan protein dan rasio fosforilasi / total
dihitung [19].

Level VEGF dalam medium ditentukan dengan R&D VEGF ELISA (R&D R&D,
Minneapolis, USA), sesuai dengan protokol pabrikan. Dari masing-masing sampel, 200 μl
media diambil, disentrifugasi selama 20 menit pada 1000 g. Garis kalibrasi dimasukkan
dalam setiap pelat.

QRT-PCR real-time

Untuk mempelajari ekspresi gen diferensial, sel diobati dengan kombinasi

enzastaurin, erlotinib dan enzastaurin-erlotinib selama 72 jam. Ekstraksi RNA dilakukan
dengan menggunakan TRI REAGENT LS (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Belanda) dan secara
terbalik ditranskripsi menggunakan kit sintesis cDNA DyNAMO untuk qRT-PCR (Thermo
Fisher Scientific, Landsmeer, Belanda).

Primer dan probe untuk VEGF dan VEGFR-2 (Hs00173626_m1 dan

Hs00176676_m1, masing-masing) dan untuk EGFR diperoleh dari Applied Biosystems. Data
dinormalisasi menjadi β-aktin dan kuantisasi gen target dilakukan dengan menggunakan
kurva standar yang diperoleh dengan pengenceran cDNA dari Total-RNA Referensi
Manusia-kuantitatif PCR (Stratagene, La Jolla, CA, USA) [19].

Western blot

Untuk mengevaluasi efek obat pada konsentrasi protein kami melakukan analisis
Western Blot. Sel diperlakukan selama 72 jam dengan nilai enzastaurin dan erlotinib
kendaraan (IC50 atau nilai-nilai tunggal). Sel dipanen dan di redisolasikan dalam buffer lisis
(0,1% (v / v) Triton X-100, 10% gliserol, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL pH 7,6, 50 mM
β-gliserofosfat, dan 5 mM EDTA) dan protein konsentrasi ditentukan oleh uji Biorad. Sampel
didenaturasi dalam buffer sampel yang mengandung SDS dan β-mercaptoethanol dan jumlah
protein yang sama dimuat dan dipisahkan pada 8 15% SDS-PAGE gel dan dipindahkan ke
membran odyssey polyvinylidene fluoride [20]. Selanjutnya, membran diblokir dengan 5%
susu kering tanpa lemak / TBST dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dengan antibodi
primer diencerkan dalam 5% BSA / TBST. Setelah dicuci, membran diinkubasi dengan
antibodi sekunder (1: 1 Li-Cor: PBS) dalam gelap selama 1 jam dan dicuci lagi. Deteksi
dilakukan pada mesin Odyssey menggunakan Li-Cor.
Antibodi primer berikut digunakan: GSK3β 1: 1000, phospho-GSK3β (Ser9) 1: 1000 (dari
Cell Signaling Technology); Cdc25C 1: 1000, phospho-Cdc25C (Ser 216) 1: 1000, CDK2 1:
500, phospo-CDK2 (Thr160) 1: 500, CHK2 1: 1000, dan, sebagai kontrol pemuatan, β-aktin
1: 10000 ( Sigma Aldrich). Antibodi sekunder fluoresens adalah kambing anti-kelinci-
IRDye800Cw (Westburg 926-32210D) dan kambing anti-tikus-IRDye680 (Westburg 926-
32220D) 1: 10000.

Array PAMgene

Array PAMchip digunakan untuk menganalisis efek obat pada aktivitas tirosin kinase
(PAMgene, Hert s Hertogenbosch, Belanda). Pamchip mengandung 136 situs fosforilasi dari
144 peptida yang masing-masing terdiri dari 15 asam amino. 13 asam amino-karboksilat (R-
COOH) dari masing-masing peptida sesuai dengan situs fosforilasi yang diketahui atau
diduga dari tirosin kinase. Eksperimen dilakukan dan dianalisis seperti yang dijelaskan
sebelumnya [21]. Secara singkat, sel A549 (107 sel / ml) distimulasi dengan faktor
pertumbuhan epidermal (50 μg / ml) selama 5 menit dan kemudian terpapar selama 2 jam
hingga 4,6 μM erlotinib, 10 μM enzastaurin atau kombinasinya. Sel dipanen, dibekukan dan
disimpan pada -80 ° C sampai analisis. Pelet sel dilisiskan selama 20 menit pada suhu 4 ° C
dengan Reagen Ekstraksi Mammalian Protein (M-PER), fosfatase dan protease inhibitor
(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Selanjutnya, lisat disentrifugasi (15 menit pada
10000g). 40 μl campuran sampel selanjutnya disiapkan menggunakan buffer reaksi 1 × ABL
buffer (Westburg), 100 μM ATP (Sigma-Aldrich), antibodi berlabel fluorescent PY20
(Exalpha, Maynard, MA), 5 μg protein (lisat) dan DMSO. Array diblokir menggunakan 2%
BSA dan campuran sampel dimuat. Setelah inkubasi pada 30 ° C, analisis dimulai selama 60
siklus menggunakan instrumen Pamstation 96 (Pamgene International). Pencitraan fluoresen
berulang terjadi sepanjang analisis dengan kamera 12-bit charge-coupled device (CCD)
sehingga pemantauan fluoresensi waktu-nyata. Intensitas titik dikoreksi untuk latar belakang
lokal dan laju fosforilasi awal (Vini) dihitung menggunakan perangkat lunak Bionavigator
5.1 (Pamgene International).
Hasil

Penghambatan pertumbuhan dan studi interaksi farmakologis

Percobaan sebelumnya menunjukkan penghambatan tergantung dosis pertumbuhan

sel dengan erlotinib dalam sel A549 dan H1650 [19]. Untuk sel A549 penghambatan dosis
tergantung pertumbuhan sel juga diamati setelah pengobatan enzastaurin dalam sel A549
dengan nilai rata-rata IC50 ± SEM 8,83 ± 0,05 SEM [10] (Tabel 1). Penghambatan
pertumbuhan sel tergantung dosis diamati pada sel H1650 yang diobati dengan enzastaurin,
dengan rata-rata IC50 ± SEM 18,83 ± 2,05 μM (Gambar 2). Ketika memperlakukan kedua
garis sel dengan rasio konstan dari kedua obat secara bersamaan, efek sinergis diperoleh pada
garis sel A549 dan H1650, dengan rata-rata ± SEM CI masing-masing 0,58 ± 0,24 dan 0,63 ±
0,03 (Tabel 1).

Modulasi siklus sel dan induksi apoptosis

Flow cytometry dengan PI dilakukan untuk mengevaluasi efek pada distribusi siklus
sel dan untuk menentukan tingkat pembunuhan sel (Gambar 3). Dalam A549 sel erlotinib
meningkatkan fase G1 dari 66,2% menjadi 71,3%, sementara enzastaurin dan kombinasi
meningkatkan fase S dari 9,8% menjadi 11,9% dan 10,8%, masing-masing. Dalam sel
H1650, pengobatan dengan enzastaurin dan kombinasi secara signifikan meningkatkan fase S
dari 4,9% menjadi 21,3% dan 21,0%, masing-masing, serta fase G2M dari 17,0% menjadi
36,4% dan 35,9%. Sebaliknya, fase G1 menurun dari 78,0% menjadi 42,3% dan 43,1%.
Erlotinib sendiri tidak menyebabkan penghentian siklus sel dalam sel H1650. Dalam sel
A549 hanya peningkatan kematian sel yang diamati setelah pengobatan dengan enzastaurin
atau kombinasi dari 3,4% menjadi 6,9% dan 4,7%, masing-masing. Namun, pada H1650,
enzastaurin dan kombinasinya menginduksi pembunuhan sel yang ditandai masing-masing
dari 3,5% menjadi 18,8% dan 18,7% (Gambar 3). Untuk menentukan bagaimana perubahan
dalam distribusi siklus sel diatur, kami mengukur beberapa protein spesifik siklus sel.
Pertama, baik ekspresi maupun fosforilasi dari cdc25c, regulator utama dari pos pemeriksaan
G2 / M, ditentukan. Enzastaurin saja sudah cukup untuk menurunkan regulasi baik ekspresi
maupun fosforilasi cdc25c, efek yang sama dapat diamati setelah pengobatan kombinasi.
CDK2 berperan selama fase G1 dan S-dari siklus sel. CDK2 memiliki ekspresi keseluruhan
yang lebih rendah dalam sel A549 dibandingkan dengan sel H1650, tetapi di kedua lini sel
enzastaurin menyebabkan penurunan fosforilasi, yang bahkan ditingkatkan setelah
pengobatan kombinasi dengan erlotinib (Gambar 3).

Modulasi fosforilasi AKT, ERK1 / 2 dan GSK3β

Pensinyalan EGFR terutama ditransduksi melalui jalur AKT dan ERK1 / 2. Untuk
menyelidiki apakah menggabungkan erlotinib dengan enzastaurin mengurangi sinyal ini,
kami mengevaluasi fosforilasi protein ini. Sedangkan ekspresi total kedua protein tetap stabil
setelah perlakuan yang berbeda, kami menemukan penurunan rasio p-AKT / total AKT dalam
sel A549. Enzastaurin atau erlotinib dalam monoterapi menurunkan rasio ini sebesar 40%,
sementara kombinasi obat-obatan ini bahkan menunjukkan penurunan 60%. Sebaliknya,
hanya modulasi 20% pada p-AKT / total AKT yang diamati pada sel H1650 setelah
pengobatan kombinasi (Gambar 4C).

Mengenai rasio fosfo-ERK / total ERK, penurunan 20% setelah monoterapi

enzastaurin diamati pada sel H1650, sementara erlotinib mengurangi rasio ini dengan 30%
dan kombinasi kedua obat sebesar 40%. Demikian pula, dalam sel A549 pengurangan
masing-masing 20, 15 dan 30% diamati setelah enzastaurin, erlotinib dan pengobatan
kombinasi masing-masing (Gambar 4F).

Karena enzastaurin mempengaruhi beberapa jalur pensinyalan seluler, kami juga

fokus pada fosforilasi GSK3β, yang dipelajari dengan analisis western blot. Hasil ini
menunjukkan bahwa fosforilasi GSK3β sudah sangat dihambat di kedua jalur sel dengan
pengobatan dengan enzastaurin saja. Demikian pula, kombinasi simultan dari kedua obat
mengurangi fosforilasi GSK3β ke tingkat tidak terdeteksi (Gambar 4G).
Modulasi ekspresi mRNA VEGF dan VEGFR-2

Karena enzastaurin dikenal karena efek anti-angiogeniknya dan jalur PKC terlibat
dalam angiogenesis, kami melakukan qRT-PCR untuk mengevaluasi modulasi ekspresi
VEGF dan VEGFR-2.

Sel A549 yang diobati dengan enzastaurin atau kombinasi enzastaurin dan erlotinib
masing-masing menunjukkan penurunan 5,0 dan 6,9 kali lipat dalam ekspresi VEGF. Di sisi
lain, erlotinib saja tidak menunjukkan penurunan yang relevan dalam ekspresi VEGF.
Penurunan 2,4 kali lipat diamati pada sel H1650 yang diobati dengan enzastaurin, sementara
pengobatan dengan erlotinib dan kombinasi kedua obat tidak mengubah ekspresi VEGF
dalam sel H1650 (Gambar 5A). Meskipun penurunan kuat dalam ekspresi VEGF, sekresi
VEGF hampir tidak terpengaruh oleh obat; hanya dalam sel A549 enzastaurin mengurangi
sekresi VEGF sebesar 15%, sedangkan kombinasi menurunkan sekresi 30%. Pengobatan
Erlotinib saja tidak menyebabkan perubahan sekresi VEGF (Gambar 5A).

Ekspresi VEGFR-2 dalam sel A549 meningkat 1,7 dan 3,0 kali lipat setelah
perawatan dengan kombinasi atau enzastaurin, masing-masing, sedangkan erlotinib tidak
mengubah ekspresinya. Dalam H1650 sel ekspresi VEGFR-2 turun setelah perawatan dengan
enzastaurin, erlotinib dan kombinasi dibandingkan dengan kontrol (Gambar 6A). Tidak ada
perbedaan signifikan dalam ekspresi VEGFR-2 antara sel yang diobati dengan erlotinib,
enzastaurin atau kombinasinya.

Tingkat EGFR dari kontrol dalam sel H1650 adalah 7 kali lipat lebih tinggi bila
dibandingkan dengan A549. Namun demikian, di kedua garis sel erlotinib, enzastaurin dan
kombinasinya semuanya menurunkan ekspresi EGFR, dengan penurunan yang lebih nyata
pada sel H1650. Level EGFR terendah diperoleh setelah perawatan dengan kombinasi kedua
obat (Gambar 6B).

Modulasi aktivitas protein tirosin kinase oleh enzastaurin dan erlotinib

Susunan Pamgene terdiri dari 144 peptida yang mewakili situs fosforilasi yang
diketahui dan diasumsikan. Dengan uji ini, aktivitas dan penghambatan tirosin kinase dalam
sel yang terpapar dapat ditentukan secara waktu nyata (Gambar 7). Dari peptida ini, intensitas
sinyal dari 50 situs dianggap terlalu rendah untuk dievaluasi. Enzastaurin atau erlotinib
monoterapi menyebabkan pengurangan 11 dan 15% dalam kecepatan fosforilasi EGFR,
masing-masing, sedangkan kombinasi menyebabkan pengurangan 55%. Pada peptida yang
tersisa, erlotinib menyebabkan penurunan keseluruhan aktivitas tirosin kinase sebesar 20%.
Penurunan kuat pada fosforilasi MK14 (MAPK14) dan RBL2 (seperti retinoblastoma)
diamati, sedangkan efek ini dibatalkan setelah menggabungkan erlotinib dengan enzastaurin.
Monoterapi Erlotinib hanya menyebabkan penurunan fosforilasi EGFR 20%. Pengobatan
Enzastaurin menghasilkan pengurangan keseluruhan kecepatan fosforilasi 20%, sedangkan
kombinasi erlotinib dan enzastaurin, menyebabkan penurunan keseluruhan 60%, dengan
pencabutan total fosforilasi EPHA1. Selanjutnya, enzastaurin menginduksi penurunan
fosforilasi MK14 dan RBL2 dibatalkan setelah terapi kombinasi. Sebaliknya, fosforilasi
SRC8 (CTTN, Cortactin) dan PLCG1 meningkat dibandingkan dengan peptida lain,
sedangkan ini tidak terjadi setelah pengobatan dengan erlotinib atau enzastaurin saja.

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan interaksi sinergis dari inhibitor PKCβ
enzastaurin dan EGFR inhibitor erlotinib pada A549 dan garis sel H1650 NSCLC. Telah
ditunjukkan bahwa kepekaan mutasi pada EGFR adalah biomarker yang baik untuk efisiensi
erlotinib [4]. Untuk enzastaurin, tidak ada biomarker yang jelas telah ditemukan, meskipun
bukti menunjukkan bahwa protein yang terkait dengan jalur JAK / STAT mungkin berfungsi
sebagai prediktor untuk aktivitas [22]. Di sini kami menyelidiki apakah kombinasi kedua obat
ini sinergis dalam garis sel dengan mutasi EGFR kepekaan (H1650), serta garis sel tanpa
Mutasi EGFR (A549).

Beberapa penelitian telah menunjukkan pentingnya memodulasi siklus sel dalam efek
kombinasi obat [23]. Obat yang bekerja pada berbagai tahap siklus sel mungkin
mempotensiasi efek satu sama lain. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa PKC dapat
memediasi transisi siklus sel [24]. Dalam sel A549 efek pada penangkapan siklus sel
minimal, tetapi pada H1650 bagian sel yang meningkat berada di S- atau G2 / Mphase setelah
pengobatan dengan enzastaurin sendiri atau dalam kombinasi. Erlotinib dengan sendirinya
tidak menghasilkan penghentian siklus sel di kedua sel.

CDK2 memainkan peran aktif dalam transisi antara fase S- dan G2, dikendalikan oleh
fosforilasi di Thr160 [25]. Western Blotting mengungkapkan bahwa fosforilasi pada situs
CDK2-Thr160 sangat menurun setelah terapi kombinasi dan pada tingkat yang lebih rendah
setelah pengobatan enzastaurin. Penurunan ini dapat menyebabkan penangkapan fase-S.

Cdc25C tidak aktif ketika terfosforilasi pada residu Ser216 dan berperan dalam
transisi G2 / M dari siklus sel [26]. Telah ditunjukkan bahwa cdc25C mempromosikan
transisi fase-M dengan memfosforilasi dan mengaktifkan cdc2 [27]. Studi sebelumnya
menunjukkan bahwa PKC menginduksi fosforilasi CDC25C, sehingga mempromosikan
transisi G2 ke M. Ketika menghambat PKC dengan antibodi atau DNA antisense,
penangkapan fase G2 / M telah ditunjukkan [28]. Hasil kami memang menunjukkan
penurunan yang kuat pada kedua level total CDC25C, dan fosforilasi CDC25C-Ser216,
setelah pengobatan dengan enzastaurin atau dalam kombinasi, sehingga menjelaskan
penangkapan fase G2 / M.

Dalam penelitian ini, tidak ada induksi apoptosis yang diamati, berbeda dengan
penelitian yang menggabungkan erlotinib atau enzastaurin dengan pemetrexed [10, 19].
Karena kedua erlotinib dan enzastaurin tidak dikenal sebagai obat sitotoksik dan sitostatik, ini
mungkin menjelaskan kurangnya induksi apoptosis dibandingkan dengan kombinasi dengan
pemetrexed antimetabolit. Oleh karena itu kombinasi enzastaurin dan erlotinib dapat
meningkatkan penangkapan di beberapa pos pemeriksaan siklus sel, tanpa menginduksi
apoptosis.
 Mengenai efektor hilir pensinyalan PKCβ dan EGFR, terjadi penurunan fosforilasi
AKT, ERK1 dan GSK3β diamati. Karena AKT adalah efektor hilir PKCβ dan EGFR [29,
30], kadar fosfot AKT menurun setelah semua perawatan di kedua jalur sel. Dalam sel A549
penurunan rasio fosfo-AKT / total AKT paling menonjol.

Target hilir lainnya dari pensinyalan PKCβ dan EGFR [31, 32], ERK1 / 2
menunjukkan penurunan fosforilasi pada semua kondisi perawatan. Selain itu, rasio fosfo-
ERK1 / 2 dibandingkan total ERK1 / 2 menurun di kedua lini sel setelah pengobatan. Karena
GSK3β adalah efektor dari PKCβ [33] tetapi bukan EGFR, penurunan fosforilasi hanya
diamati setelah pengobatan dengan enzastaurin atau kombinasi, yang dilaporkan sebelumnya
untuk enzastaurin dalam garis sel yang berbeda [9, 10, 34, 35] yang mendorong penurunan
dalam p-AKT selama 24 jam [10]. Hasil ini menunjukkan bahwa mereka dapat digunakan
sebagai penanda farmakodinamik dari aktivitas enzastaurin.

Meskipun enzastaurin memiliki efek langsung pada beberapa sel kanker manusia [10],
enzim ini awalnya dikembangkan sebagai senyawa anti-angiogenik. Enzastaurin menurunkan
kepadatan pembuluh intratumoral dan ekspresi VEGF dalam beberapa xenografts manusia
dan garis sel NSCLC [10, 14], dan sel A549 dalam penelitian ini. Namun, kombinasi obat
tidak berpengaruh pada ekspresi VEGF dalam sel H1650, menunjukkan bahwa beberapa
mekanisme mungkin terlibat dalam regulasi ekspresi VEGF. Meskipun percobaan in vitro
menunjukkan pengurangan VEGF dalam medium [10], dalam studi klinis enzastaurin
meningkatkan kadar plasma VEGF yang selanjutnya meningkat dengan kombinasi
enzastaurinpemetrexed [36, 37]. Namun, uji klinis lain pada pasien NSCLC lanjut yang
diobati dengan enzastaurin tidak menunjukkan perubahan yang konsisten dalam kadar plasma
VEGF, tetapi dapat mengaitkan kadar VEGF awal yang rendah dengan kelangsungan hidup
bebas perkembangan yang lebih lama [36]. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
mengklarifikasi hasil ini.

Akhirnya, kami juga mempelajari ekspresi VEGFR-2, yang meningkat setelah

pengobatan dengan enzastaurin di kedua garis sel. Ini mungkin dijelaskan oleh pengurangan
ekspresi VEGF, menginduksi mekanisme umpan balik pada ekspresi VEGFR-2 dalam sel.
Dalam hal VEGFR-2 yang sangat teraktivasi, akan berguna untuk menggunakan kombinasi
dengan obat yang aktif melawan VEGFR-2 (yaitu). Oleh karena itu, data ini menunjukkan
hasil yang menjanjikan, yang perlu diselidiki lebih lanjut, mungkin juga dalam kombinasi
dengan senyawa target lainnya.

Ketika membandingkan data aktivitas kinase dari analisis Pamgene, beberapa tren
dapat dilihat. Fosforilasi EGFR di Tyr1110 dikaitkan dengan aktivasi [38]. Fosforilasi
Tyr1110 dipengaruhi oleh pengobatan erlotinib, dan telah dikorelasikan dengan mutasi EGFR
[38].

GSK3β adalah target hilir dari enzastaurin [9] dan erlotinib [39] melalui AKT.
GSK3β aktif menginduksi degradasi cyclin-D1, sehingga menghambat transisi sel G1. Pada
gilirannya, GSK3β dihambat oleh AKT dalam kondisi normal melalui fosforilasi pada posisi
Ser9 yang resmi. Penurunan kecepatan fosforilasi juga diamati di residu Tyr216 situs aktif
baik setelah enzastaurin (19%) dan pengobatan erlotinib (16%). Kombinasi kedua inhibitor
ini bahkan menyebabkan 57% penurunan fosforilasi. GSK3β berperan dalam jalur Wnt jika
fosforilasi β-catenin, sehingga menargetkannya untuk degradasi [40]. Dengan memfosforilasi
β-catenin, target hilir Wnt ini tidak akan berpindah ke nukleus untuk mengerahkan fungsi
transkripsi aktivatornya [41]. Ketika GSK3β difosforilasi di Tyr216, itu di mana-mana oleh
β-TrCP dan ditandai untuk degradasi, sehingga mempromosikan stabilitas β-catenin dan
pensinyalan Wnt. Jadi, ketika Tyr216-fosforilasi GSK3β berkurang, ini mungkin juga
menurunkan pensinyalan melalui jalur Wnt onkogenik [40].

EphA1 (Ephrin Receptor A1) adalah anggota superfamili Eph. Reseptor-reseptor ini
terutama memainkan peran dalam interaksi dan migrasi sel-sel, dengan ligan dan reseptor
berada pada membran sel yang berlawanan dari sel-sel yang saling berhubungan. Beberapa
ligan Ephrin A dapat mengaktifkan pensinyalan dua arah, dengan pensinyalan ke depan di
bagian hilir reseptor dan pensinyalan terbalik di ligan [42]. Reseptor dan ligan ini telah
dikaitkan dengan pertumbuhan dan penekanan tumor [43-47]. Faktor mana yang
mempengaruhi hasil belum dijelaskan. Selain itu, beberapa proses tampaknya tidak
tergantung pada aktivitas kinase dari reseptor [48]. Kami melihat penurunan regulasi
fosforilasi yang kuat di situs Y781 dari reseptor EphA1 setelah perawatan dengan enzastaurin
atau erlotinib dan bahkan pencabutan total fosforilasi setelah perawatan dengan kombinasi.
Penjelasan yang mungkin adalah bahwa downregulation dari adhesi integrin disebabkan
dalam cara yang bergantung pada kinase [49].

MK14 mengkodekan untuk p38 MAPK [50]. Protein ini diaktifkan ketika difosforilasi
dua kali di Thr180 Tyr182 dan terletak di persimpangan beberapa jalur pensinyalan, mis.
JNK dan Rho. Aktivasi p38 MAPK sangat menurun setelah pengobatan erlotinib, dengan
efek yang lebih rendah setelah enzastaurin atau pengobatan kombinasi. p38 MAPK adalah
target hilir PKCβ. Pada karsinoma hepatoseluler, fosforilasi MAPK p38 telah berkorelasi
dengan potensi metastasis sel. Enzastaurin menghambat aktivasi PKCβ dan mengurangi
fosforilasi pAP MAPK, sehingga mempengaruhi potensi invasi dan migrasi sel [51]. P38
MAPK terfosforilasi juga telah terbukti berperan dalam jalur pensinyalan EGFR. Khususnya
itu menurunkan MDM2, sehingga mencegah degradasi p53. Selanjutnya p53 mentranslokasi
ke nukleus dan mengatur transkripsi EGFR [52]. Ketika erlotinib memblokir pensinyalan
EGFR, kecepatan fosforilasi p38 MAPK sangat menurun. Telah ditunjukkan bahwa EGFR-
TKI menekan internalisasi EGFR [53]. Ini mungkin menghasilkan umpan balik ke p38
MAPK, mengurangi fosforilasi dan aktivitasnya.

Studi in vitro kami yang luas sangat penting untuk pemilihan yang bijaksana dari
kombinasi terbaik dan model yang akan diuji di masa depan dalam model tumor in vivo, serta
untuk mengevaluasi peran biomarker potensial yang dapat memprediksi aktivitas obat. Studi
in vivo sebelumnya dalam pengembangan enzastaurin menunjukkan efek pada angiogenesis,
seperti tingkat VEGF [9, 54], yang juga ditemukan dalam studi klinis [37]. Lebih lanjut, pada
kedua sel tumor yang dikultur dan dalam jaringan tumor xenograft dari garis sel yang sama,
enzastaurin menghambat fosforilasi pGSK3β [9, 54], dan penghambatan ekspresi protein
yang lebih kuat diamati ketika dikombinasikan dengan EGFR-TKI lain, gefitinib [54].
Beberapa penelitian in vivo lainnya menunjukkan bahwa baik enzastaurin dan erlotinib
mempengaruhi jalur Akt [9, 10, 19]. Oleh karena itu, penelitian in vivo di masa depan
mengenai kombinasi erlotinib dan enzastaurin harus menyelidiki efek antitumor keseluruhan,
dan apakah mekanisme tersebut akan mencakup efek pada pensinyalan dan angiogenesis.

Kesimpulannya enzastaurin adalah inhibitor PKCβ, bekerja pada beberapa jalur

pensinyalan seluler yang terlibat dalam proliferasi, apoptosis, dan angiogenesis. Fitur-fitur ini
menjadikannya senyawa yang baik untuk digabungkan dengan senyawa lain dalam terapi
kombinasi. Meskipun tidak lagi dalam pengembangan klinis untuk NSCLC, penelitian
tentang enzastaurin dan senyawa terkait masih berlangsung pada jenis kanker lainnya
(misalnya glioblastoma [55] dan kanker kolorektal [56]) dan penyakit terkait non-kanker
(kondisi kardiovaskular, diabetes, bipolar gangguan dan transplantasi) [57].