Nama : Putri Wulandari Resky Ananda

Nim : N011191066
Kelas : Bioanalisis B

Tugas Review Jurnal

Judul Artikel Research Article A Miniaturized Ligand Binding Assay for EGFR
Penulis Jochen M. Schwenk, Oliver Poetz, Robert Zeillinger, and Thomas O.
Joos
Nama Jurnal Internasional Journal of Proteomics
Tahun, Halaman 2010, Halaman 1-5
Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk pengembangan uji pengikatan ligan
EGFR
Pendahuluan Sistem uji multikompleks saat ini memungkinkan dapat dilakukannya
analisis protein berbasis afinitas, namun saat ini pengukuran seperti
radioimmunoassay dari reseptor aktif pengikat ligan belum dapat
dilakukan untuk model mini. EGFR merupakan protein transmembran
dengan ikatan ligan ekstraseluler dan ligan utamanya adalah
polipeptida yang terdiri dari 53 asam amino yang mengikat domain I
dan III bagian ekstraseluler dari reseptor
Metode Penelitian Metode penelitian pada uji pengikatan ligan miniatur dilakukan pada
plat sumur mikrotiter 96 dengan membran filterbawah (Milipore) di BSB
dibawah pengadukan permanen pada 650 rpm dan pada suhu 230C
pada ruang yang gelap. Di setiap sumur, 30 L yang mengandung
manik-manik EGF-Biot (1000 per set) dan 30 L sampel dicampur dan
diinkubasi selama 2 jam. Manik-manik dicuci dengan buffer BSB 3 × 50
L pada manifold vakum (Millipore). Antibodi anti-EGFR (0,3 g/mL,
mAb11, LabVision) dipilih, dan 30 L ditambahkan ke setiap sumur.
Setelah itu diinkubasi lebih dari 60 menit dan manik manik dicuci
kembali. Antibodi berlabel R-fikoeritrin sekunder (2,0 g/mL, anti-tikus
kambing, Dianova) dengan volume 30 L/sumur diinkubasi selama 45
menit. Akhirnya, manik-manik dicuci, dan volume akhir 75 L BSB
ditambahkan ke masing-masing sumur. Untuk eksperimen kompetisi,
EGF terlarut (sEGF, Biomol) dicampur dengan sampel dan dikoinkubasi
dengan manik-manik berpasangan EGF-Biot yang diimobilisasi. Untuk
deteksi, antibodi anti EGFR mAb11 diterapkan pada 1,25 g/mL dan
 antibodi anti-tikus berlabel pada 5,0 g/mL
Hasil dan Pada percobaan pertama, dua konsentrasi EGF terbiotinilasi
Pembahasan diimobilisasi ke dalam manik-manik, dicampur, dan diterapkan pada
pengujian dengan jumlah protein total yang berbeda dari lisat sel. Pada
penelitian ini, sel BT-20, yang diketahui mengekspresikan EGFR pada
level 400 fmol/mg atau 1,5 × 106 salinan per sel dipilih. Untuk deteksi
selanjutnya dari EGFR terikat manik, antibodi anti EGFR dipilih yang
tidak mengganggu interaksi EGF EGFR. Tidak ada reaktivitas silang
antara EGF-biotin yang diimobilisasi, antibodi anti-EGFR, dan antibodi
deteksi anti-tikus berlabel yang dapat dideteksi.
Pada Gambar 1(a), terlihat bahwa baik jumlah lisat yang digunakan
maupun densitas ligan pada permukaan manik mempengaruhi
intensitas sinyal yang diukur dan tidak ada efek saturasi yang diamati
untuk konsentrasi protein lisat yang diuji. EGF yang digabungkan ke
manik-manik pada konsentrasi 1,2 M menunjukkan peningkatan
intensitas sinyal dibandingkan dengan ID manik-manik yang
digabungkan dengan konsentrasi ligan 4x lebih rendah, selain rentang
intensitas yang lebih luas untuk manik-manik EGF yang dimuat 1,2 M.
Karena sel BT-20 yang digunakan diketahui mengekspresikan tingkat
EGFR yang lebih tinggi, konsentrasi protein sampel 500 g/mL, yang
mencerminkan 15 g protein total per sumur, dipilih untuk studi berikut
guna juga memfasilitasi deteksi EGFR dalam spesimen dengan tingkat
ekspresi yang lebih rendah. Untuk memvalidasi spesifisitas pengujian,
yang berarti bahwa EGF menangkap EGFR, lisat sel BT-20
dikoinkubasi dengan EGF larut nonbiotinilasi (sEGF).
Selanjutnya, uji pengikatan ligan EGFR diterapkan dalam studi bukti
konsep untuk profil EGFR pada 46 sampel tumor yang berasal dari
pasien kanker payudara. Lisat jaringan diukur secara acak pada
konsentrasi protein total 0,5 mg/mL dengan protokol yang ditetapkan.
Sampel yang dianalisis dikelompokkan berdasarkan cut off level yang
relevan secara klinis sebesar 10 fmol/mg, yang sebelumnya telah
ditentukan dalam eksperimen pengikatan ligan radio. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 2, 15 dari 17 sampel (88%) dari kelompok A
 dengan EGFR 10 fmol/mg diukur dengan LKM 25 AU, sedangkan
sampel dengan LKM 50 AU tidak berafiliasi dengan kelompok ini. Untuk
sampel dalam kelompok B dengan EGFR >10 fmol/mg, 52% memiliki
nilai MFI 50 AU, dan, untuk sisa 48% dengan LKM 50 AU, nilai EGFR
tertinggi adalah 42 fmol/mg. Sampel yang mengandung 600 fmol/mg
EGFR (tidak diperlihatkan pada Gambar 2) diukur dengan LKM >1000
AU sehingga berfungsi sebagai kontrol. Antara grup A dan B, nilai P
2.6e-11 dihitung dan menunjukkan bahwa uji pengikatan ligan dilakukan
dengan baik untuk memberikan bukti pelengkap untuk memisahkan
sampel dengan nilai EGFR tinggi dan rendah.
Kesimpulan Uji pengikatan ligan mini, seperti yang dijelaskan pada penelitian ini
untuk EGF dan EGFR, menawarkan alat bebas radiasi untuk membuat
profil dan mempelajari molekul target melalui mitra interaksi in vivo
mereka dibandingkan dengan radioimmunoassay konvensional atau
metode berbasis antibodi lainnya. Dalam pendekatan yang disajikan,
diselidiki potensi ligan reseptor imobilisasi EGF untuk menangkap
EGFR dalam format uji berbasis manik miniatur di mana EGF
diimobilisasi ke manik-manik berlapis avidin melalui modifikasi biotin N-
terminal. Strategi imobilisasi yang dipilih memungkinkan untuk
mempertahankan sifat pengikatan EGF dan untuk mencapai intensitas
sinyal yang tinggi. Keduanya, konsentrasi kopling EGF serta jumlah
sampel yang diterapkan memengaruhi intensitas sinyal. Seperti yang
dijelaskan di tempat lain, domain ekstraseluler EGFR mengalami
perubahan konformasi pada pengikatan ligan pada permukaan sel dan
sepertinya perubahan tersebut harus terjadi bahkan ketika EGFR diikat
oleh ligan penangkap yang tidak bergerak. Meskipun interaksi EGF-
EGFR berlangsung dengan pengikatan EGF bebas ke EGFR berlabuh
atau larut in vivo, menempelkan EGF ke dukungan padat tidak
menghalangi kedua protein untuk mengikat satu sama lain.
Keunggulan Keunggulan dari jurnal ini adalah menjelaskan secara lengkap terkait
setiap tahapan yang dilakukan untuk proses analisis ligan
Kekurangan Kekurangan dari jurnal ini yaitu menggunakan bahasa yang cukup sulit
untuk diartikan serta tidak adanya kesimpulan yang jelas terkait dengan
penelitian yang dilakukan