Metode Imunokimia

untuk analisis senyawa aktif

Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy
Institut Teknologi Bandung
Analisis Imunokimia
Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara
Antigen-Antibodi
Penggunaan senyawa penanda (label) untuk
visualisasi reaksi
Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia
Prinsip Reaksi : meniru reaksi
imunologi dalam tubuh
Reaksi imunologi di dalam mamalia :
Ag
Ab
Reaksi primer
Reaksi
sekunder
Reaksi tersier
(degranulasi,opsonisasi)
(Fiksasi komplemen,
aglutinasi, presipitasi)
memicu
Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?
Reaksi dan kekuatan
antibodi untuk specific
and reproducible protein
binding
Prinsip reaksi :
immunoassays
Antigen-Antibody Interaction for
analysis
SUBSRATE
PRODUCT
(visualized)
Complex
Ag-Ab-Label
Metode analisis berbasis
imunokimia
Imunopresipitasi
Imunoaglutinasi
Imunokimia berlabel :
EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay)
RIA (Radio ImmunoAssay)
IFA (ImmunoFluorescence Assay)
LIA (Luminescence Immuno Assay)
dll
Antigen (antibody generator)
Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat
menginduksi sistem imun mamalia
Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun
mamalia
Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi
Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000),
chemical structure Complex
Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan
antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein
untuk meningkatkan immunogenicity
Yang dapat menjadi antigen
Mikroba patogen dan atau toksin mikroba
Toksin tanaman, hewan
Protein spesifik atau senyawa lain yang
berstruktur spesifik
Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak
imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan
suatu protein carrier (contoh : BSA)
Senyawa pestisida, dll.
Apakah Antibodi?
Antibodi adalah protein yang disekresi oleh
sel plasma limfosit B akibat stimulasi
molekul asing (antigen) pada reseptor
antigen limfosit B
Spesifik terhadap antigen yang memicunya
Antibodi adalah molekul-molekul
glikoprotein yang dikenal sebagai
immunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG
SIFAT UMUM ANTIBODI
Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi
Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat
berikatannya antigen secara spesifik, disebut
sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding)
yang univalen, masing-masing memiliki satu situs
pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala
hal
Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable),
fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan
dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk
fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen
berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh
Struktur Antibodi
Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua
rantai ringan (light chain = L).
Rantai H IgG () memiliki massa molekul sekitar 50
55 kDa, sementara rantai H IgM () memiliki massa
molekul sekitar 65 70 kDa.
Rantai L (dengan massa molekul 20 25 kDa)
memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan
berikatan dengan seluruh kelas rantai H.
Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen
dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini
relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di
reduksi atau oksidasi.
Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat
berinteraksi dengan sel dan sistem efektor
dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya
dapat berinteraksi dengan antigen.
Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan
dengan antibodi disebut epitope atau disebut
antigenic determinant, sedangkan lokasi pada
struktur antibodi yang dapat berikatan dengan
antigen disebut paratop.
IgG and IgM
IgG IgM
Specificity and Selectivity
Monoclonal Antibody
Polyclonal Antibody
Recombinant Monoclonal Antibody
KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL
DIBANDINGKAN POLIKLONAL
Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang
dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi
secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah
diseleksi sebelumnya.
Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi non-
spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi
poliklonal.
Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi
monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan
antigen-antibodi poliklonal.
Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis
kandungan antibodinya.
Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk
perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ,
deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.
Teknik lain untuk produksi
antibodi monoklonal
Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi
cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau
murine
Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan
ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke
dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.
Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri,
skrining dengan western blot
Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan
antibodi Fab yang murni
Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan
modifikasi fungsi efektor
Penggunaan Prinsip reaksi
Antigen-Antibodi di bidang
Farmasi
Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosis
untuk Penyakit Infeksi
Drug Monitoring and Toxicology
Cancer Research
Proteomic Study
KINETIKA INTERAKSI
ANTIGEN-ANTIBODI
Antigen-Antibody Interaction
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)
Antigen
Antibodi
Kompleks Ag-
Ab
Konjugat
enzim pada
Ag-Ab
Substrat
Produk
berwarna
Reaksi
enzimatik
Kinetika reaksi Antigen-Antibodi
Reaksi reversibel
Ag + Ab Ag-Ab
k1
k2
k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi
Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :
d (Ag-Ab)
dt
= k1(Ag) (Ab) k2 (Ag-Ab)
k1/k2 =
(AgAb)
(Ag) (Ab)
= K (konstanta kesetimbangan)
Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi,
demikian sebaliknya
B (terikat)
B/F (rasio terikat
dan bebas)
0
5.00
5.00
Bila F adalah antigen bebas, dan B
adalah antigen yang terikat, Abx
adalah konsentrasi awal Ab,maka
pada kesetimbangan :
K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab)
= B / F [(Abx)-B]
Jadi B/F = K [(Abx)-B]
Slope = -K, potongan dgn
x adalah b, potongan dgn y
adalah Kb
Reaksi pada permukaan bahan padat
dan cair
Kebanyakan metode imunokimia yang ada
dibuat dalam media/fase padat (solid phase)
untuk memudahkan proses pemisahan dalam
percobaan yang heterogen
Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat,
ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan
ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2
dipengaruhi oleh interaksi sterik
Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi
intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil
dibandingkan reaksi di dalam larutan
Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padat-
cair secara praktis merupakan reaksi
irreversibel
Parameter analisis
Sensitivitas
Spesifisitas
Selektivitas
Hal yang mempengaruhi parameter :
Reaksi silang
Adanya senyawa yang mempengaruhi
aviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea
Bagaimana menentukan jenis
analisis imunokimia berlabel?
Reaktan apa yang akan diberi label, antigen
(analit) atau antibodi?
Apakah antigen atau antibodi yang akan
ditentukan?
Apakah analisis kompetitif atau non-
kompetitif?
Apakah sistem analisis homogen atau
heterogen?
Pengelompokkan jenis analisis
imunokimia
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan
analit yang diberi label
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan
antibodi yang diberi label
3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi
langsung kompleks imun
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan
reaksi khusus yang berlebih
5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi
spesifik
6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi
berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan
penguatan sinyal
1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten
dengan analit yang diberi label : Analisis ini
mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan
penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat
dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi,
luminesensi atau enzim.
2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten
dengan antibodi yang diberi label : analisis
ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel
memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya
kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam
reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah
tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung
pada afinitas antibodi berlabel
3. Analisis imunokimia yang tergantung
pada deteksi langsung kompleks imun:
analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi,
turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel
4. Analisis imunokimia dengan melibatkan
label dan reaksi khusus yang berlebih:
analisis sandwich seperti 2-site immunometric
assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan
antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi
yang tidak berikatan akan dibuang
1. Analisis imunokimia untuk mengukur
antibodi spesifik : analisis ini melibatkan
antigen amobil berlebih pada fase padat untuk
menangkap antibodi spesifik di dalam sampel.
2. Analisis imunokimia yang melibatkan
pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-
Ab merupakan penguatan sinyal: analisis
ini termasuk imunokimia homogen untuk
memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label
yang digunakan
Reaksi Imunokimia dengan jumlah
antibodi berlebih (tipe I)
Analit + antibodi kompleks Ag-Ab sisa antibodi
Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi
yang tidak terhingga
Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis)
Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi
reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih
Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi
oleh senyawa seperti garam atau urea
Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel
2-site immunometric sandwich assay
(non-kompetitif untuk Ag polivalen)
Ukur aktivitas labelnya
Ab1
Ag
pencucian
Ab2 berlabel
ditambahkan
berlebih
inkubasi
Pencucian
dan inkubasi
Analit + antibodi kompleks Ag-Ab sisa antigen
Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi
antibodi mendekati 0
Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan
Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas
antibodi
Sensitivitas maksimum 10
-14
mol/liter (teoritis)
Antigen yang dapat bereaksi silang akan
menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada
laju konstanta kesetimbangan antara analit dan
antigen cross-reactant tersebut
Reaksi dalam percobaan lambat karena
kesetimbangan harus tercapai
Reaksi Imunokimia dengan jumlah
antigen berlebih (tipe II)
Imunokimia kompetitif dengan
analit berlabel
+ +
Ag
Ag-berlabel Ab
+
Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk
berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel
yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit
bebas
Sensitivitas metode
Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira
17%
Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira
10
-11
liter/mol
Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira
10
-13
mol/liter (kira-kira 10
8
molekul per mL)
ANALISIS
IMUNOKIMIA
DENGAN LABEL
NON-RADIOAKTIF
Karakteristik suatu label untuk
analisis imunokimia
Memiliki aktivitas spesifik
Mudah dideteksi
Tidak berbahaya
Aktivitas spesifik label
berhubungan dengan :
Fraksi pada label yang akan digunakan untuk
deteksi
Derajat amplifikasi
Efisiensi deteksi
Syarat Enzim yang ideal
sebagai label
Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km
rendah)
Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)
Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi
lanjutan atau dalam penyimpanan
Tersedia dalam keadaan murni (high purity)
Harga murah
Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana
Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang
akan diuji
Contoh enzim sebagai label
Enzim dan
sumber
pH optimum Aktiv.spes
(U/mg, 37 C)
BM
Alkalinfosfatase
(usus sapi)
8-10 1000 100.000
-galaktosidase
(E.coli)
6-8 600 540.000
HRP (lobak) 5-7 4500 40.000
Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin
deaminase, invertase, -laktamase, dll.
Enzim dan sumbernya
B-galaktosidase
Peroksidase
Glukosa oksidase
A-amilase
G6PDH
MDH
Heksokinase
Propionil-CoA-karboksilase
Lisozim
Escherichia coli
Lobak
Aspergillus sp.
Bacillus subtilis
Leoconostoc mesenteroides
Lactobacillus arabinosus
Saccharomyces sp.
Saccharomyces sp.
Egg-white
Senyawa berfluoresensi
sebagai label
Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar
terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi
tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama
proses eksitasi
Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi
dan sinyal semakin kecil
Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang
terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi,
lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan
polarisasi meningkat
Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label
bebas menjadi hal yang penting, karena akan
mempengaruhi polarisasi label yang terikat
Syarat ideal Senyawa
Fluoresensi sebagai label
Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi
(absorptivitas molar tinggi)
Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi
pengaruh latar belakang (background)
akibat scattering
Larut dalam air
Mudah dikonjugasi dengan molekul lain
Harga murah
Contoh label fluoresensi
Fluorofor Quantum
yield
Lifetime (ns) Emisi/eksita
si (nm)
Absorptivitas
(liter/mol)
Dansil
klorida
0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3
Fluoresein
isotiosianat
0,85 4,5 520/492 7x10 4
Rhodamin B
isotiosianat
0,7 3,0 585/550 1,2x10 4
Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini
banyak digunakan untuk label fluoresensi
Europium, terbium, samarium, memiliki emisi
fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai
milidetik)
Dapat menghilangkan pengaruh background
Reaksi silang (cross-reaction)
Ketepatan suatu analisis tergantung pada
spesifisitas nya
Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik,
namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu
reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur
kimia dari analit lain
Reaksi silang dievaluasi dengan cara
membandingkan kemampuan masing-masing
analit terhadap ikatan dengan label
B (%)
Cross-reactant
Std
x1 x2
100
50
Log konsentrasi
% reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%
Perkembangan metode
Imunokimia
Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik
pada Ag virus
Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia
menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan
Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan
menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor
berikatan dengan ligand yang dilabel dengan
radioaktif (
3
H atau
125
I)
Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif
untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil
Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay
Metode Scintillation Proximity
FI A + L*
FI A
L*
sinar
Radiasi
Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A)
yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi
akan memancarkan sinar
Metode Idiometrik
Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis
antibodi anti-idiotipik (anti-idiotypic antibody) selain
antibodi utama
Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta
Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel
Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau
tidaknya analit pada situs ikatannya
Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian
paratop (daerah ikatan Ag pada Ab)
Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya
estradiol
Ultrasensitive two-site enzyme
immunoassay
Untuk mengukur kadar antigen yang sangat
kecil :
Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma
(pada kasus tumor)
Thyrotropin dalam serum darah
Luteinizing hormon dalam serum darah anak-
anak
Growth hormon