Elektroforesis

Chemistry Department
Faculty Science and Technology
Universitas Airlangga
 Elektroforesis
 Teknik pemisahan komponen/ molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik
 Electro-phoresis  “ being carried “
 “ Electrically Induced Movement of Particle “ 
gerakan partikel yang bermuatan di dalam suatu
media yang diberi arus listrik
 Digunakan untuk pemisahan suatu campuran
senyawa yang bermuatan, seperti protein dan
DNA
 Elektroforesis
 Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya
pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada
kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif
(-) pada kutub positif (+).
 Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik".
 Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalah
elektroforegram yang memberikan informasi
mengenai seberapa cepat perpindahan komponen
(tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi.
 Besaran yang digunakan sama dengan pada proses
kromatografi.
 Elektroforesis
 Medan listrik dialirkan pd suatu medium yg
mengandung sampel yg akan dipisahkan
 Digunakan dgn memanfaatkan muatan listrik yg
ada pada makromolekul (mis. DNA yg bermuatan
negatif)
 Jika molekul yg bermuatan negatif dilewatkan
melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dr suatu kutub ke kutub yg berlawanan
muatannya maka molekul tersebut akan bergerak
dr kutub negatif ke kutub positif
 Elektroforesis
 Kecepatan gerak molekul tergantung pada
nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada ukuran & bentuk
molekulnya.
 Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz yang berkaitan dengan sifat-sifat dasar
elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan.

q = muatan yg di bawa oleh objek

E = medan listrik
 Elektroforesis
 Berdasarkan bentuk alat, eketroforesis dibagi
menjadi 2, yaitu:

1. Elektroforesis Planar
2. Elektroforesis Kolom / Kapiler
 Elektroforesis
 Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus
DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt.
 Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan
terjadi efek pemanasan pada media gel.
 Efek pemanasan tersebut disebut "efek Joule"
yang disebabkan karena adanya tumbukan
partikel elektron.
 Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua
cara, yakni dengan pendinginan dan efek konveksi
(mengganti bentuk planar menjadi kolom/ kapiler).
 Elektroforesis
 Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi
oleh ukuran, bentuk, serta muatan dari
masing-masing komponen.
 Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi
jika komponen memiliki muatan tinggi dan
ukuran rendah, dengan kata lain memiliki
densitas muatan yang tinggi.
 Densitas muatan sendiri adalah
perbandingan antara muatan dengan ukuran
yang dimiliki oleh suatu komponen.
 Aplikasi Elektroforesis
1. Pemisahan ion Li+ dan Na+
Kedua kation ini, Li+ dan Na+ sama-sama
memiliki muatan +1, namun memiliki
ukuran berbeda. Ion Li+ memiliki ukuran
yang lebih kecil dari Na+. Ion Li+ akan lebih
tersolvasi dengan air sehingga akan
mengikat banyak molekul air. Akibatnya
mobilitas Li+ akan menjadi kecil dan ion
Na+ akan lebih dahulu keluar dari kapiler.
 Aplikasi Elektroforesis
2. Pemisahan NO2- dan NO3- menggunakan EOF (electroosmotic
flow). HNO3 merupakan asam kuat, dalam air akan terurai
sempurna menjadi H+ dan NO3-, sedangkan HNO2 merupakan asam
lemah, dalam air akan terdisosiasi sebagian.
Pada pH 7, HNO2 akan terdisosiasi sebagian, menyisakan spesi
HNO2. Hal ini tidak baik untuk pemisahan karena tidak semua
HNO2 berada dalam spesi NO2-. Untuk melakukan pemisahan
dengan baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga
kedua spesi tersebut dapat berada dalam bentuk anionnya. Namun
ketika pH sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak
pada elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan
menuju pada kutub yang sama. Pemisahan dapat tetap dilakukan
dengan baik asalkan muatan detektor diatur menjadi positif dan
muatan injektor diatur menjadi negatif.
Sistem yang berdasarkan pada
skema (a) hanya akan
menghasilkan satu puncak,
artinya pemisahan tidak
berlangsung dengan baik.
Pada skema (b) akan muncul
dua puncak, artinya pemisahan
NO3- dan NO2- terjadi dengan
baik.
Hal ini disebabkan karena nilai
mobilitas elektroforetik (μep) NO3-
lebih kecil dibanding μep NO2-,
akibatnya mobilitas total (μt) NO2-
menjadi lebih besar dari μt NO3-.
Hal ini akan berakibat NO2- akan
keluar terlebih dahulu dibanding
NO3-.
 Aplikasi Elektroforesis
 Metode pemisahan untuk menentukan
komponen protein/ asam nukleat setiap
individu.
 Uji paternitas dan identifikasi pelaku
kejahatan (DNA fingerprinting)
 Human genome project
 Elektro Osmotik Flow (EOF)
 Jika kapiler pada elektroforesis diberi
tegangan, maka akan terjadi perpindahan
muatan ke arah kutub negatif (-).
 Perpindahan yang terjadi
disebut "electroosmotic flow (EOF)".
 Pergerakan elektrolit yang tidak
dipengaruhi oleh EOF
disebut "elektroforetik".
Skema Elektro Osmotik Flow
 Skema Elektro Osmotik Flow
 Dari gambar tampak bahwa terjadi pemisahan antara
muatan positif dgn muatan negatif akibat adanya lapis
rangkap listrik.
 Lapis rangkap listrik terjadi akibat pemberian tegangan
yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler.
 Sebelum diberi tegangan, permukaan kapiler akan
bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion
negatif akan menempel pada permukaan sebagai lapis
pertama.
 Ion positif akan mengikuti ion negatif membentuk lapisan
pada permukaan, dalam hal ini ion positif akan
membentuk lapisan kedua.
 Sistem ini disebut lapis rangkap listrik
 Jenis Elektroforesis

1. Elektroforesis Kertas
2. Elektroforesis Gel
3. Elektroforesis Kapiler
 Elektroforesis Kertas
 Terdiri dr kertas sebagai fase diam dan
partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase
gerak.
 Pemisahan terjadi karena gradasi konsentrasi
sepanjang sistem pemisahan
 Pergerakan tergantung pada valensi zat
terlarut, luas penampang, tegangan yg
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan
ion, pH, viskositas, & adsorpsivitas zat terlarut
 Elektroforesis Gel

 Gel sbg fase diam

 Awalnya digunakan
kanji  agarosa &
poliakrilamida sebagai
gel media.
 Elektroforesis Gel
Fase Diam Fase Gerak

Membawa objek yang

Menyaring objek yang
dipisahkan
dipisahkan

Ditambahkan larutan penyangga pada fase gerak

untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel
Kapan Kita Menggunakan
Elektroforesis Gel?
Jenis-Jenis Elektroforesis Gel
 Elektroforesis DNA/RNA :
 Elektroforesis gel agarose : horizontal
 Elektroforesis gel poliakrilamida : vertikal

 Elektroforesis Protein :
 PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis)
Sistem yang digunakan dalam PAGE
- Flat Bed
- Rod atau Column
- Vertical Slab
- Capillary
 SDS PAGE
 Blue Native PAGE (BN-PAGE)
 Zymogram PAGE
 Isoelectric Focusing (IEF)
 2-D Electrophoresis
Komponen
Elektroforesis Gel
Bahan Penyangga  Elektroforesis Gel

 Berupa Gel (sediaan semisolid

transparan)
 Untuk pemisahan protein  gel
polyacrylamide
 Untuk pemisahan DNA  gel agarose
Agarose Gel
1. Dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla.
2. Gelidian dan Glaucaria adalah komponen yang
dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam
hubungan dengan polisakarida, agropefin
dibentuk agar.
3. Agarose larut pada buffer (TAE) yang mendidih
dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada
cetakan gel yang ditempatkan pada suhu ruang.
 Struktur Agarose Gel

Fig.3
Gambar SEM struktur agarose gel 2%
(a) 70 oC (b) 40 oC (c) 30 oC (d) 20 oC
Resolusi Gel Agarose

Resolusi : kemampuan memisahkan molekul

sehingga dapat terbaca dengan jelas
 Gel Poliakrilamida

Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methyle-

bis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksi
polimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate
dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED).
TEMED adalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas
ion perisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.

Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang

netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika
dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi
Polimerisasi Akrilamida
Hasil SEM polyacrilamide gel
From :Journal of material chemistry website
Buffer
• Fungsi : menjaga kesetimbangan pH,
memberikan ion untuk konduktivitas,
• Elektroforesis DNA :
Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atau
TBE (Tris-borate-EDTA )
Loading buffer

• Elektroforesis Protein :
Buffer Tris
Bagaimana caranya?

Visualisasi
(staining)
Proses
elektroforesis

Membuat
matriks gel
Gel Documentation System
 Visualisasi Elektroforesis DNA
 Etidium Bromida  disinari lampu UV 
berpendar
Seperti apa hasilnya?
 Elektroforesis DNA (EtBr Staining)
 elektroforesis protein
Elektroforesis protein

 Silver staining
 Migrasi Molekul DNA Pada Gel
 Molekul DNA yang bermuatan
negatif karena adanya gugus fosfat
akan bergerak menuju anode
(elektrode bermuatan positif) saat
dipisahkan dengan elektroforesis
 Fragmen DNA yang memiliki ukuran
molekul yang sama akan memiliki
elektromobilitas yang sama dan
menempuh jarak migrasi yang sama
 Topologi DNA yang dipisahkan
menentukan elektromobilitas DNA.
DNA yang mengalami supercoil akan
bermigrasi lebih cepat karena Topologi molekul DNA
strukturnya sangat kompak. hasil Elektroforesis.
 Elektroforesis Gel
 Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-
kolom (disebut well atau "sumur") pada sisi elektrode
negatif.
 Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron
dan zat objek akan bergerak dari elektrode negatif ke
arah sisi elektrode positif.
 Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung
dari muatan dan berat molekul sampel.
 Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang
berberat molekul lebih besar akan lebih lambat
berpindah.
 Jenis Gel pada Elektroforesis DNA
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk
memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk
memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi
untuk menyediakan sistem elektroforesis yang
digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran
standar.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA

1. Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat
bergerak melewati gel karena hambatan yang akan
dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul
berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel
yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-
molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA

3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih
cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk
bulat.
4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume
molekul.
Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak
lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas
muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin
lambat pergerakan molekul DNA.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA

6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan,
semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7. Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan
konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi
DNA.
 Faktor yang mempengaruhi pemisahan
komponen pada elektroforesis protein

 Densitas molekul : berbeda diantara pH

media dan pl molekul
 Pengaruh buffer
 Bentuk dan ukuran molekul
 Media pendukung:
 Restriksi pada mobilitas
 Pengaruh difusi
 Elektroendosmosis
 Mikro-heterogenitas molekuler spesies
ELEKTROFORESIS
KAPILER
Elektroforesis Kapiler
 Elektroforesis yang berlangsung pada tabung
kapiler, dikenal sebagai capillary electroporesis
(CE)
 Gabungan GC dengan elektroforesis
 Metode alternatif untuk kromatografi
Elektrokromatografi
 Tabung kapiler Kolom pada kromatografi
gas
 Ukuran tabung: panjang 10-100 cm; diameter
internal 25-100 m
Instrumentasi

Kolom kapiler
Pada elektroforesis kapiler, komponen dalam
campuran ditransport melalui tabung kapiler
horizontal oleh potensial dc yang tinggi di sepanjang
tabung.

Migrasi ~ mobilitas elektroforesis

Ukuran dan bentuk molekul analat akan
berpengaruh terhadap mobilitas elektroforetik
 Kolom kapiler Biasanya digunakan fused silika baik
yang dimodifikasi maupun tidak.
Permukaan bermuatan negatif (Si2O- atau silanol)
O O O O O O O O O
Si Si Si Si Si Si Si Si Si
OH OH O OH O OH OH O OH
Na Na Na

Na Cl
Cl Na
Cl
Na
Na Na Na Na
O OH O OH O OH OH O OH

O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O

Pada CE diameter kolom kecil, luas area kecil, sehingga

resistensi listrik tinggi. Pada kondisi ini pelebaran kurva
karena termal minimum.
 Elektroda Platinum foil
 Potensial dc supply 20-30 kV (high voltage)

 Detektor: Pada dasarnya detektor yang semua detektor

yang digunakan pada HPLC dapat juga diaplikasikan pada
CE dan HPCE .Detektor tersebut meliputi: UV, dioda array,
fluorescence, refraktif indeks, elektrokimia dan lainnya.
 Injeksi: beberapa L (atau nL untuk elektrooresis kapiler
kinerja tinggi/HPCE) ke bagian ujung kapiler yang
bermuatan + (positif) dibantu dengan gravitasi

Sistem injeksi:
a. Injeksi hidrodinamik: pada sistem ini digunakan bantuan
tekanan saat menginjeksikan sampel pada kolom
kapiler.
b. Injeksi elektrokinetik: digunakan bantuan arus listrik saat
sampel diinjeksikan pada kolom kapiler.
volume sampel yang diinjeksikan pada sistem injeksi
hidrodinamik dihitung dengan persamaan

ΔP adalah perbedaan tekanan (Pa)

d adalah diameter kapiler bagian dalam (m)
t adalah waktu menggunakan (det)
η adalah viskositas buffer (kg m–1s–1),
L panjang tabung kapiler. The fact (m)
103 merupakan faktor konfersi m3 ke liter.
mol solut yang diinjeksikan pada sistem injeksi
elektrokinetik dihitung dengan persamaan

C adalah konsentrasi solut

t adalah waktu medan listrik diaplikasikan
r adalah jari-jari kapiler
µep adalah mobilitas elektroforetik solut µeof adalah
mobilitas elektroosmotik
E adalah medan listrk yang digunakan
Kbuf adalah konduktivitas buffer
.
Perhatikan:
µeof : mobilitas Elektroosmotik (EOF) yang bertambah
secara vektorial
µep: mobilitas analat atau mobilitas elektroforetik (EMF)
µeap: mobilitas aktual= µep + µeof
 ε* = konstanta dielektrik buffer Fm-1=CV-1m-1
 *
 eo  ξ = potensial zeta (V)
4
η = viskositas larutan (dyn S cm-2)

q q = muatan solut
 ep  η
6r = viskositas larutan (dyn S cm-2)

µeap= µep + µeof vtot = moblitas total

vep = mobilitas analat
vtot= vep + veof veof = mobilitas elektroforetik
Pada prakteknya:
Spesi bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat
karena EOF & EMF arahnya sama
Spesi netral bergerak ke katoda dengan kecepatan
ditentukan oleh aliran elektroosmotik
Spesi bermuatan (-) bergerak paling lambat karena
EOF & EMF berbeda arah
Sehingga elektroforesis kapiler dapat memisahkan
spesi bermuatan (+), (-), dan netral dalam satu kali
injeksi/analisis

Analisis dapat dibantu dengan menggunakan marker

yang netral dan dapat dideteksi.

Syarat marker: inert terhadap dinding dalam kapiler,

molekul contoh, dan terhadap komponen buffer.
Cntoh markker:metanol, aseton, mesitil oksida.
EOF berpengaruh secara nyata terhadap pelebaran
zona ~ Atraksi elektrostatik

~ Elektrik double layer

kromatografi

Flat flow
profile HPCE
Aliran elektroosmosis
 Parameter Identifikasi
 Analisis kualitatif: Waktu migrasi (tM atau Mt)
tM = L L= panjang tabung kapiler
v tot v tot = mobilitas total
= (µep + µeof) x E
E = medan listrik

tM = l L L= panjang tabung kapiler

µep V l = panjang kapiler efektif
V = Tegangan listrik

Catatan: jangan tertukar v (mobilitas) dengan V

(tegangan)
 Analisis kuaantitatif: Luas area di bawah kurva
 Elektroforesis kapiler kinerja tinggi
(HPCE)
 Konsentrasi sampel yang dibutuhkan rendah
 Bentuk kurva berkaitan dengan diffusi/dispersi
elektromigrasi
 Lebih ditentukan oleh kecepatan gerak dari
partikel
 Kelebihan HPCE dari CE terhadap efek
termal
HPCE rasio permukaan-volume > CE
 Temperatur gradien pada kolom/kapiler dapat
terjadi karena kalor diproduksi di sepanjang
kapiler. Tetapi konduksi hanya terjadi pada
dinding kapiler
 Upaya mengurangi efek termal:
 Mengurangi diameter kapiler
 Mengurangi kekuatan medan listrik
 Mengubah komposisi buffer dengankekuatan ionik
yang lebih rendah
 Menggunakan sistem kontrol suhu yang efisien.
Problem instrumentasi ~ timbulnya kalor

interaksi analat-dinding kapiler

a.l. Turbulensi lokal

Adsorpsi analat pada dinding
kapiler

pelebaran kurva
Adsorpsi reversibel efek <<<
Adsorpsi irreversible efek >>>
Upaya mengurangi interaksi:
 Penggunaan buffer dengan pH ekstrem
 Penggunaan buffer dengan konsentrasi tinggi
 Penambahan zat aditif pada buffer, seperti: ion
zwitter, surfaktan, garam alkali, amina kation
divalen, etilena glikol,derivatif selulosa.
 Kapiler yang dilapisi (coated capillary, static
couting).
Upaya-upaya tersebut dapat mengurangi EMF
Panjang plug injeksi dan pengaruh zona detektor
 Injeksi sampel pelebaran zona

Gunakan volume kecil

Bila plug injeksi lebih panjang dari dispersi yang
diakibatkan oleh diffusi pelebaran zona
mengurangi efisiensi pemisahan
 Panjang zona detektor harus sependek mungkin
adanya pelebaran kurva
 Perlu optimasi antara: efisiensi dan sensitivitas
Efisiensi
Dicirikan oleh jumlah pelat teoritis N (analog dengan
GC dan HPLC)
Pada CE atau HPCE nilai N dihitung dengan
persamaan
D=koef. diffusi

Selektivitas
Dihitung berdasarkan rasio dari faktor kapasitas
 Resolusi
Pemisahan/separasi antara 2 solut

µavg adalah mobilitas elektroforetik rata-rata dari 2 buah solut

Elektroforesis Kapiler Gel Capillary Gel
Electrophoresis (CGE)

 Tabung kapiler yang digunakan diisi dengan gel

polimer
 Karena gel memiliki matriks berpori, maka solut
bermigrasi pada sel dengan kecepatan yang
ditentukan oleh mobilitas elektroforetik maupun
ukurannya
 Pemisahan yang dipengaruhi ukuran ini berguna
terutama apabila solut yang berbeda memiliki
mobilitas elektroforetik yang sama.
Contoh,
Fragmen DNA dengan panjang yang berbeda-beda
memiliki ratio muatan:ukuran yang sama. Pemisalah
fragmen DNA tersebut dengan CE cukup sulit, CZE
dapat mengatasi hal ini karena memisahkan
berdasarkan bobot milekul.