Prinsip pemeriksaan metode Prinsip pemeriksaan metode

Elisa, PCR dan

Elektroforese Elektroforese
Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K) S , Sp K(K)
Bagian Patologi Klinik
F k lt k d kt r USU/UISU Fakultas kedokteran USU/UISU
Medan
Prinsip pemeriksaan Imunologis Prinsip pemeriksaan Imunologis
Umumnya berdasarkan pada interaksi Umumnya berdasarkan pada interaksi
antigen(Ag) dan antibodi(Ab).
I t k i ti d tib di tb Interaksi antigen dan antibodi tba :
- Tingkat primer.
- Tingkat sekunder.
- Tingkat tertier Tingkat tertier.
Tingkat primer Tingkat primer
Merupakan awal reaksi ikatan
molekuler antara Ag dan Ab molekuler antara Ag dan Ab
Reaksi tidak terlihat dengan mata
telanjang(biasa)
Perlu indikator
indikator :
- Radioisotop
- Enzim atau Enzim atau
- zat warna flouresen.
Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.
Nama metode pemeriksaan untuk Nama metode pemeriksaan, untuk
menentukan interaksi antara Ag dan
Ab disesuaikan dengan nama Ab disesuaikan dengan nama
indikator diatas.
Ilmu yang mempelajari tentang reaksi Ilmu yang mempelajari tentang reaksi
Ag dan Ab serologi
Radioisotop Radio Immuno Assay Radioisotop Radio Immuno Assay
(RIA).
Enzim Enzyme Immuno Assay Enzim Enzyme Immuno Assay
(EIA) Elisa
Fl I fl i Flouresen Immunoflouresensi
Metode ini untuk menentukan kadar Ag
atau Ab yang rendah ng y g g
Tingkat sekunder Tingkat sekunder
Presipitasi Presipitasi
Aglutinasi.
Tingkat tertier Tingkat tertier
Interaksi antara Ag dan Ab terjadi Interaksi antara Ag dan Ab terjadi
dalam tubuh manusia/ invivo.
Teknik ELISA Teknik ELISA
Untuk menentukan kadar Ag atau Ab Untuk menentukan kadar Ag atau Ab.
Indikator berupa enzim dilenketkan
pada Ag atau Ab pada Ag atau Ab.
Ada beberapa metode.
Prinsip Metode Elisa Prinsip Metode Elisa
Bil kit dit k i ti (A ) Bila kita mau menditeksi antigen(Ag):
Ag(serum) + Ab
E
Ag- Ab
E
komplek
i cuci
Inkubasi dengan substrat kromogenik
( l t k b )b bil (semula tak berwarna)berwarna,bila
dihidrolisis oleh enzim intensitas
warna yang terjadidiukur dengan warna yang terjadidiukur dengan
fotometer/ spektrofotometer kadar
antigen. antigen.
Prinsip Metode Elisa[Sambungan]
Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam
waktu ttt. a tu ttt
Reaksi berhenti bila ditambahkan asam
atau basa kuat. a au basa ua
Reaksi harus berlangsung dalam
keaadan optimal dimana p
- kadar reaktan
- temperatur temperatur
- masa inkubasi yang telah ditentukan
secara eksperimental setiap reagen secara eksperimental setiap reagen
dari fabrik ber beda prosedur berbeda.
Reaksi optimal sudah ditentukan Reaksi optimal sudah ditentukan
secara eksperimental,dengan
penetapan penetapan
- kadar reaktan
t t - temperatur
- masa inkubasi
setiap reagen dari fabrik berbeda
prosedur berbeda. p
Metode Elisa Metode Elisa
Metode kompotitif Metode kompotitif
Non kompotitif [Langsung]
I di k t d i h Indirek atau sandwich
Metode kompotitif Metode kompotitif
Umumnya untuk menentukan Ag Umumnya untuk menentukan Ag.
Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag * /sumur ] dicampur bersama sama Ag *
tambahkan serum [Ag] yang akan
b i d A * t k ik t bersaing dengan Ag*untuk mengikat
Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag
Metode Elisa[sambungan] Metode Elisa[sambungan]
Non kompotitif[ menentukan Ab Non kompotitif[ menentukan Ab
atau Ag
Indirek/sandwich menentukan Ab Indirek/sandwich menentukan Ab
dan Ag
A Ab A tiAb* tib di - Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang
dicari
- Abs Ag Ab*Ag yang dicari
Elektroforese Elektroforese
Dikenalkan oleh Tiselius 1930 Dikenalkan oleh Tiselius,1930
berkembang menentukan protein
serumdan urin serum dan urin
Elektroforese merupakan teknik
pemeriksaan yang berguna untuk pemeriksaan yang berguna untuk
pemisahan dan mengukur kadar
makromolekul (protein) makromolekul (protein)
Komponen komponen
El kt f Elektroforese
Dapar/Buffer Dapar/Buffer
Media pendukung.
M di l - Media gel agarosa
- Media selulosa asetat
Power suply unit
Pewarna Protein Pewarna Protein
Densitometer
Power suply unit
Menghasilkan energi pada kedua
elektroda pergerakan dan p g
pemisahan molekul protein.
Tegangan dan besar arus dapat Tegangan dan besar arus dapat
dikendalikan.
Pewarna Protein Pewarna Protein
Panceou red Panceou red
amino black
C i bl Coomassie blue
Densitometer Densitometer
Alat pengukur kuantitas berdasarkan
intensitas warna pita pada intensitas warna pita pada
elektroforese, saat media pendukung
melalui sistemoptik yang bekerja melalui sistem optik yang bekerja
seperti fotometer
Prinsip Dasar Elektroforese Prinsip Dasar Elektroforese
Tergantung pada : Tergantung pada :
A. Muatan partikel
B K t i i B. Kecepatan migrasi.
A. Muatan : A. Muatan
Partkel bermuatan, dalam media pendukung
nya bila terpapar dengan medan listrik akan nya, bila terpapar dengan medan listrik, akan
bergerak kearah elektroda yang berlawanan.
Molokul protein bersifat ampoter Bila protein Molokul protein bersifat ampoter. Bila protein
berada pada lingkungan pH dibawah titik iso
elektrisnyaprotein akan bermuatan neto y p
positip dan sebaliknya
Pada pH isoelektrik protein tidak bermuatan
listrik atau muatannya nol
B. Kecepatan Migrasi. B. Kecepatan Migrasi
Kecepatan migrasi protein tergantung
pada :
1.Kekuatan medan listrik.
Makin besar perbedaan muatan
neto makin cepat gerakan. neto makin cepat gerakan.
2.Ukuran molekul :
Makin kecil mol makin cepat Makin kecil mol makin cepat
gerakan
3.Media pendukung : 3.Media pendukung :
Pori pori media bersifat filter.
4 Viscositas media 4.Viscositas media
Makin tinggi viscositas makin lambat
gerakan gerakan
5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik
besarmigrasi cepat besarmigrasi cepat.
6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan
arah dalammedia pendukung arah dalam media pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion
rendah migrasi cepat rendah migrasi cepat
8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.
6.Endoosmosis:
yaitu gerakan berlawanan arah dalam
media pendukung. p g
7.Kadar ion dalam dapar:
kadar ion rendah migrasi cepat kadar ion rendah migrasi cepat
8.Suhu:
suhu tinggi migrasi cepat.
Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis
Dengan gel agarosa :
Prealbumin - Prealbumin
- Albumin
- Alfa 1 globulin
- Alfa 2 globulin g
- Beta globulin
Gama globulin - Gama globulin
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
it ifik l t k d pita yang spesifik letaknya dan
digambarkan densitometer berupa kurva
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita yang spesifik letaknya.
Densitometer menghasilkan fraksi Densitometer menghasilkan fraksi
protein berupa kurva
Berdasarkan Pergerakan SPE Berdasarkan Pergerakan SPE
Prealbumin
F k i t i b i i li - Fraksi protein yang bermigrasi paling
dekat ke anoda.
Albumin,
- Fraksi protein terbanyak. p y
- Fungsi mempertahankan tekanan
osmotik osmotik
Alfa1 globulin Alfa1 globulin
Alfa 2 globulin.
B t 1 l b li Beta1globulin.
Beta 2 globulin.
Gamma globulin migrasi terdekat ke
katoda.
Polymerase Chain Reaction(PCR). ym ( ).
Metode yang cepat dan sederhana Metode yang cepat dan sederhana,
untuk mengkopi dan memperbanyak
urutan DNA spesifik yang dinginkan urutan DNA spesifik yang dinginkan
dan divisualisasikan sebagai pita yang
jelas pada agarose gel jelas pada agarose gel.
Scara mendasar sebenarnya PCR Scara mendasar sebenarnya PCR
mengulangi siklus :
Denaturasi - Denaturasi
- Hibridasi dari DNA yang dinginkan
d b t DNA i dengan bantuan DNA primer
- Extensi regio DNA tsb oleh enzim
DNA polymerase.
Pada PCR konvensional Pada PCR konvensional
- Target amplifikasi adalah asam
nukleat harus dilakukan terlebih nukleat harus dilakukan terlebih
dahulu sampai selesai
B didit k i - Baru diditeksi.
Pada PCR yang baru amplifikasi
dilakukan terhadap sinyal sedangkan
target asam nukleat tidak diamplifikasi.
Pada PCR yang baru Pada PCR yang baru
Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.
T t kl t tid k di Target asam nukleat tidak di
amplifikasi.
Prinsip PCR
1 Ekstraksi DNA 1. Ekstraksi DNA
2. Alat PCR
a. Target DNA g
b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA
danTaq DNA polymerase
c Denaturasi DNA c. Denaturasi DNA
Initial denaturation : 5 menit,t 94 C
Denaturation : 1 menit 94 C
Primer annealing : 1 menit 50 C
Copying of DNA by DNA polymerase
fi l l ti 10 it 72 C final elongation 10 menit ,72 C
Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus g