NI WAYAN WADINI

2106541093
RESUME TEKNIK APLIKASI BIOTEKNOLOGI

Western Blotting
Western blot adalah teknik analitik yang digunakan untuk mendeteksi
protein spesifik dalam sampel homogenat atau ekstrak jaringan tertentu.
Dengan menggunakan teknik western blot, peneliti dapat mengidentifikasi
protein spesifik dari campuran kompleks protein yang diekstraksi dari sel.
Western blot yang digunakan untuk protein dikembangkan oleh George Stark
dengan penggunaan antibodi untuk menemukan protein. Dalam teknik ini
campuran protein dipisahkan melalui elektroforesis gel berdasarkan berat
molekul dan menurut jenisnya, kemudian ditransfer ke membran yang
menghasilkan pita untuk setiap protein. Membran tersebut diinkubasi dengan
label antibodi khusus untuk protein yang diinginkan.
Sebelum melakukan western blotting, sample harus dipersiapkan. Untuk
memisahkan protein, umumnya menggunakan metode elektrolisis protein,
seperti Elektroforesis Gel Poliakrilamida dengan Natrium Dodesil Sulfat
(SDS-PAGE) atau Elektroforesis Gel Poliakrilamida biasa (Native PAGE).
Dengan SDS-PAGE, protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekulnya
sedangkan dengan Native PAGE, protein dapat dipisahkan berdasarkan
muatan listriknya. Jenis gel yang akan dipergunakan mengacu dan tergantung
pada sasaran tujuan analisis yang ingin dicapai. Western blot menggunakan
dua jenis gel agarosa: stacking gel dan separating gel. Protein dengan
demikian dipisahkan berdasarkan ukurannya lebih dalam gel ini, karena
protein yang lebih kecil bergerak lebih mudah dan lebih cepat dibanding
protein yang lebih besar. Protein ketika dimuat pada gel memiliki muatan
negatif, karena telah didenaturasi oleh pemanasan dan akan bergerak menuju
elektroda positif ketika dialiri muatan listrik.
Campuran protein yang telah dipisahkan selanjutnya dipindahkan ke dalam
membran. Pemindahan dilakukan dengan menggunakan medan listrik yang
berorientasi tegak lurus terhadap permukaan gel, menyebabkan protein
bergerak keluar dari gel menuju membran. Gel ditindihkan pada membran lalu
diapitkan dengan kertas filter. Kemudian arus listrik dilewatkan melalui
tumpukan berlapis ini dan protein akan bermigrasi dari dalam gel ke arah
kutub positif. Protein tersebut akan kemudian tertangkap oleh membran di
tengah perjalanan migrasinya dan akan melekat pada permukaan membran.
Jenis transfer ini disebut transfer elektroforesis, dan dapat dilakukan dalam
kondisi semi kering atau basah.
Pemblokiran adalah langkah yang sangat penting dari western blotting,
karena mencegah antibodi mengikat membran secara tidak spesifik.
Pemblokiran sering dilakukan dengan BSA 5% atau susu kering tanpa lemak
yang diencerkan dalam TBST untuk mengurangi hal yang tidak diinginnkan
ikut melekat pada membran seperti antibodi pendeteksi. Antibodi dapat
diencerkan dalam buffer pencuci, seperti PBS atau TBST. Proses pencucian
sangat penting karena menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Namun,
membran tidak boleh dibiarkan terlalu lama untuk dicuci, karena juga dapat
mengganggu hasil akhir yang akan dibaca. Membran kemudian dideteksi
menggunakan antibodi label, biasanya dengan enzim seperti horseradish
peroxidase (HRP), yang dideteksi oleh sinyal yang dihasilkannya sesuai
dengan posisi protein target. Sinyal ini ditangkap pada film yang biasanya
dikembangkan di ruangan gelap. data yang dihasilkan dengan western blot
biasanya dianggap semi-kuantitatif. Hal ini karena memberikan perbandingan
relatif kadar protein, tetapi bukan ukuran kuantitas absolut.
Metode pendeteksian and visualisasi protein pada western blot sangat
bergantung dengan jenis molekul yang dikonjugasikan pada antibodi pelapor
yang digunakan. Adapun metode yang biasanya dipergunakan adalah metode
pendeteksian secara kemiluminesensi (menggunakan antibodi yang
terkonjugasi dengan enzim.), secara fluoresensi (mengunakan antibodi yang
terkonjugasi dengan fluorofor di mana ketika molekul ini dipaparkan dengan
cahaya pada panjang gelombang tertentu akan tereksitasi dan memancarkan
cahaya dengan panjang gelombang tertentu yang berbeda dengan cahaya yang
dipaparkan.), atau secara radioaktif mengunakan antibodi yang terkonjugasi
dengan molekul mengandung radioisotop.)
The Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
Adalah uji imunologi yang biasa digunakan untuk mengukur antibodi,
antigen, protein dan glikoprotein dalam sampel biologis. Dalam ELISA,
antigen diimobilisasi diatas plate, lalu dikonjugasikan dengan antibody
spesifik yang berikatan dengan enzim. Proses deteksi dilakukan dengan
melihat perubahan warna akibat aktivitas enzim terhadap substrat. ELISA
dikembangkan untuk menggantikan metode RIA (radio immuno assay) yang
menggunakan radioaktif untuk deteksinya.
ELISA dimulai dengan proses coating, antigen atau antibody diimobilisasi
dalam 96-well polystyrene plate. Lalu dilanjutkan dengan proses blocking,
dimana bagian yang tidak ada antibody/antigen ditutupi dengan reangent
blocking. Plate diinkubasi dengan antibody yang terkonjugasi dengan enzim.
Lalu, plate dicuci untuk menghilangkan antibody yang tidak berikatan.
Substrat ditambahkan ke dalam plate yang akan menghasilkan perubahan
warna, lalu dibaca menggunakan microplate reader. Label enzim yang paling
banyak digunakan dalam ELISA adalah horseradish peroxidase (HRP) and
alkaline phosphatase (AP). Enzim lain yang digunakan juga diantaranya :
β-galactosidase, acetylcholinesterase, and catalase. Substrat kolorimetrik yang
dipakai untuk horseradish peroxidase adalah TMB, OPD dan ABTS,
sedangkan untuk alkaline phosphatase adalah PNPP. Pemilihan substrat
tergantung pada sensitivitas pengujian yang diperlukan dan instrument yang
tersedia untuk deteksi sinyal (spectrophotometer, fluorometer atau
luminometer).
Direct ELISA dilakukan dengan antigen diimobilisasi pada well plate, lalu
antigen tersebut langsung dideteksi menggunakan antibodi yang terkonjugasi
dengan enzim yang sudah memiliki substrat, seperti HRP. Kelebihannya yakni
cepat, karena hanya menggunakan 1 antibody dan tidak banyak proses
pencucian; cross-reactivity dengan secondary antibodi tidak terjadi
Kekurangannya adalah eaktifitas antibodi mungkin terpengaruh oleh adanya
enzim; dibutuhkan pewarnaan setiap jenis antibodi; sinyal kurang kuat dan
kemungkinan ada background.
 Indirect ELISA dilakukan dengan antigen diimobilisasi pada well plate,
lalu antinbodi utama yang tidak berlabel menempel pada antigen spesifik,
kemudian antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan enzim menempel pada
antibodi utama. Kelebihannya yakni ensitifitas tinggi, karena ada 2 jenis
antibody yang digunakan; fleksibel, karena karena satu antibody sekunder
berlabel dapat digunakan untuk beberapa jenis antibodi primer;
imunoreaktifitas antibodi primer lebih tinggi, karena tidak berlabel enzim
Kekurangannya adalah memiliki kemungkinan cross-reactivity dengan
antibodi sekunder, sehingga bisa muncul sinyal non spesifik; waktunya lebih
lama, karena ada tambahan proses pencucian dan inkubasi.
Pada sandwich ELISA, dibutuhkan pasangan antibodi yang cocok (capture
and detection antibody), setiap antibodi harus memiliki lokasi atau epitope
yang spesifik dan tidak overlapping pada antigen. Kelebihannya yaitu
spesifisitas tinggi, antigen/analyte dapat di tangkap secara spesific oleh
capture antibody; cocok untuk sample kompleks dan tidak murni, antigen
tidak harus dimurnikan dahulu sebelum analisi; sensitivitas tinggi.
Competitive ELISA dilakukan dengan antigen diimobilisasi pada well
plate, lalu ditambahkan antibodi anti-A yang sudah terkonjugasi dengan ezim
(sebagai inhibitor antigen). Sampel yang berisi antibodi anti-A dimasukkan ke
dalam well. Kedua antibodi tersebut akan berkompetisi untuk berikatan
dengan antigen. Semakin tinggi konsentrasi protein target, semakin kecil
sinyal yang terbaca oleh alat.
ELISA dapat diaplikasikan pada deteksi keberadaan patogen penyebab
penyakit (virus, bakteri, parasit, dan fungi), pengujian titer antibodi, deteksi
alergen dalam makanan, pegujian hormon, deteksi penanda tumor (CA-9,
CA19, CA242, Ferritin) serta pengujian obat-obatan dan bahan kimia,
diagnosis infeksi HIV, tes kehamilan, dan pengukuran sitokin atau reseptor
terlarut dalam supernatan sel atau serum.