Nama:Gilang Arya Dewa

NIM:2113010059

 WESTERN BLOT:

1. FUNGSI DAN KEGUNAAN

Western Blot adalah teknik penting yang digunakan dalam biologi sel dan molekular.
Western Blot seringkali digunakan dalam penelitian untuk memisahkan dan
mengidentifikasi protein. Pada teknik ini, kombinasi dari berbagai jenis protein
dipisahkan berdasarkan berat molekul, dan berdasarkan jenis melalui gel
electrophoresis. Hasil pemisahan ini kemudian dipindahkan/ transfer ke membran
yang memperlihatkan band dari setiap protein. Membran kemudian diinkubasi dengan
antibody berlabel yang spesifik untuk protein of interest/ protein target. Dengan
menggunakan Western Blot, peneliti dapat mengidentifikasi protein spesifik dari
kombinasi berbagai protein yang diekstrak dari sel.
Walau Western Blot merupakan Teknik yang penting, beberapa temuan terbaru
menunjukkan bahwa Western Blot mungkin tidak dapat diandalkan seperti yang
diasumsikan sebelumnya. Banyak laboratorium tidak menyadari keterbatasan Western
Blotting sehingga sangatlah penting untuk melakukan Western Blot dengan beberapa
strategi seperti yang dijelaskan oleh Ghosh, et al. pada penelitiannya. Strategi ini
termasuk memilih standar normalisasi terbaik, proses preparasi sampel yang tepat,
menentukan rentang linier untuk antibodi dan staining protein yang relevan sesuai
dengan sampel yang diinginkan, memastikan kualitas primary antibody, mencegah
saturasi sinyal, dan secara akurat mengukur intensitas sinyal dari protein target.

2.PROTOKOL

1.Persiapan Sample
Sebelum masuk tahap western blotting hal pertama yang harus dilakukan adalah
persiapan sampel. Persiapan sampel diawali dengan ekstraksi protein. Setelah proses
ekstraksi, perlu dilakukan pengukuran konsentrasi protein. Kandungan protein akan
ditentukan dengan membandingkan absorbansi sampel dengan koefisien absorbsi
yang ditentukan dari kurva standar. Kurva standar dibuat dengan memplot absorbansi
sampel yang mengandung konsentrasi protein standar yang diketahui. Produk kit
berikut dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi protein.
2.Elektroforesis
Tahap pertama western blot adalah elektroforesis yang memisahkan jenis protein. Gel
yang umum digunakan yaitu SDS PAGE. Preparasi gel SDS PAGE dilakukan dengan
mencampurkan buffer, Acrylamide, Ammonium Persulfate, dan TEMED. Untuk
mempersingkat proses dan mempermudah pengerjaan metode Western Blot ini,
Biosolar Life Science menyediakan pre-cast gel sehingga peneliti dapat langsung
menjalankan proses elektroforesis. Setelah gel siap, kemudian sampel  ditambahkan
dan gel dialiri listrik. Protein yang memiliki berat molekul yang kecil akan bergerak
lebih cepat dibandingkan protein yang memiliki berat molekul lebih tinggi.
3.Transfer Protein
Setelah memisahkan protein dengan elektroforesis, protein dipindahkan dari dalam
gel ke membran padat agar protein dapat diakses untuk deteksi antibodi. Metode
utama untuk mentransfer protein disebut electroblotting, yang menggunakan medan
listrik tegak lurus pada permukaan gel untuk menarik protein keluar dari gel dan
pindah ke membran. Berikut beberapa rekomendasi produk yang dapat membantu
dalam proses transfer protein.
4.Blocking
Blocking adalah langkah penting dalam western blot untuk mencegah antibodi
mengikat membran secara non-spesifik. Penghambat yang paling umum digunakan
adalah BSA dan non-fat dry milk. Ketika membran ditempatkan dalam larutan encer
protein, protein menempel ke semua tempat di membran di mana protein target belum
menempel. Dengan cara ini, “noise” pada produk akhir western blot dapat dikurangi
dan menghasilkan hasil yang lebih jelas.
5.Inkubasi Antibodi
Setelah blocking, antibodi primer mengikat protein target ketika antibodi primer
diinkubasi dengan membran. Pilihan antibodi primer tergantung pada antigen yang
akan dideteksi. Membran kemudian dicuci dengan larutan buffer antibodi untuk
menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Langkah selanjutnya yaitu menambahkan
antibody sekunder dan Kembali melakukan inkubasi. Saat inkubasi, antibodi sekunder
berlabel dapat berikatan dengan antibodi primer yang telah bereaksi dengan protein
target.
6.Deteksi
Substrat bereaksi dengan enzim yang terikat pada antibodi sekunder untuk
menghasilkan zat berwarna. Ini memungkinkan kita untuk mengetahui masa jenis dan
lokasi protein target. Dan perkiraan ukuran diambil dengan membandingkan pita
protein dengan marker. Ada beberapa sistem deteksi yang tersedia untuk visualisasi
protein, seperti deteksi kolorimetri, deteksi chemiluminescent, deteksi radioaktif, dan
deteksi fluoresen. Sistem yang paling umum digunakan adalah DAB
(diaminobenzidine) dan ECL (Enhanced chemiluminescence). DAB memiliki
kelebihan yaitu mudah digunakan dan cocok untuk mendeteksi sampel dengan tingkat
rekombinasi protein yang tinggi. Meskipun DAB mudah dalam penggunaan namun
DAB tidak terlalu sensitive. Kit dngan sistem ECL 10 kali lebih sensitif dibandingkan
DAB dan cocok digunakna untuk deteksi protein pada jaringan dan sel. Berikut
rekomendasi kit menggunakan sistem ECL.

 NORTHREN BLOT

1.FUNGSI DAN KEGUNAAN

Northern blotting merupakan salah satu teknik kunci dalam biologi molekuler, tujuan
utamanya adalah pengukuran messenger RNA (mRNA) yang spesifik. Northern
blotting memungkinkan pengamatan kontrol seluler terhadap struktur dan fungsi
dengan menentukan tingkat ekspresi gen tertentu saat diferensiasi, morfogenesis dan
juga kondisi abnormal atau sakit. 
Istilah Northern blot sebenarnya mengacu pada transfer kapiler RNA dari gel
elektroforesis menuju membran blotting, karenanya, keseluruhan proses yang
dilakukan biasa disebut dengan Northern blotting. Teknik Northern blot
dikembangkan pada 1977 oleh James Alwine, David Kemp dan George Stark di
Universitas Stanford. Teknik ini dinamai Northern blotting dikarenakan kemiripannya
terhadap teknik blotting pertama, yaitu Southern blot.

2.PROTOKOL
-1.Isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)
-2.Generasi Probe
-3.Denaturasi dan Elektroforesis gel agarose
-4.Transfer ke support solid dan imobilisasi
-5.Prehybridization dan hibridisasi dengan probe
-6.Pencucian
-7.Deteksi
-8.Pengupasan dan reprobing (opsional)

 PCR

1. FUNGSI DAN KEGUNAAN

Tes PCR (Polymerase chain reaction) adalah tes yang dilakukan untuk mendeteksi
dan menganalisis sebuah bakteri, sel, atau virus di dalam tubuh manusia. Tes PCR ini
pada umumnya dilakukan dengan cara mengambil sampel darah yang kemudian akan
di lakukan tes laboratorium.

2. PROTOKOL

-1.Denaturation / denaturasi (96°C) : Pada proses denaturasi, panas

mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-
stranded).

-2.Annealing / penempelan (55-65°C) : Pada tahap penempelan ini, suhu annealing

primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-
stranded DNA.

-3.Extension / elongasi (72°C) : Pada suhu ini Taq polymerase melakukan

pemanjangan membentuk strand DNA baru.

 ELEKTROFORESIS

1. FUNGSI DAN KEGUNAAN

Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan listrik

yang dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
memiliki muatan berupa kation ataupun anion.
Elektroforesis Gel berfungsi untuk beberapa keperluan, diantaranya :
1. Memisahkan fragmen DNA/RNA
2. Memisahkan nanopartikel
3. Analisis hasil isolasi gen dan protein

2. PROTOKOL:

1.Sampel DNA ditempatkan ke dalam kotak gel sebelum diletakkan di sumur. Ujung
gel dengan sumur diposisikan kea rah elektroda negative. Bagian ujung lainnya, tanpa
sumur (kea rah fragmen DNA bermigrasi) diarahkan ke elektroda positif.
2.Molekul bermuatan, bergerak melalui gel saat arus listrik melewatinya yang mana
arus listrik dialirkan ke seluruh gel. Molekul bermigrasi menuju muatan berlawanan.
Berikutnya yang dimaksud migrasi, yaitu pergerakan molekul.
3.Molekul yang lebih kecil, bemigrasi cepat serta bergerak lebih jauh dibandingkan
fragmen lebih besar. Karena itu, molekul dipisahkan berdasarkan ukuran.
4.Fragmen DNA bermigrasi melalui gel saat daya dihidupkan dan gel mengalir
kemudian fragmen dipisahkan berdasarkan ukurannya. Fragmen yang berukuran besar
berada di bagian atas gel (elektroda negative, tempat dimulainya) sedangkan fragmen
terkecil berada di dekat bagian bawah (elektroda positif).
5.Setelah fragmen dipisahkan, gel dapat diperiksa dan dilihat ukuran pita yang
ditemukan. Pita, yaitu garis DNA yang terdefinisi dengan baik pada gel. Tiap pita,
berisi sejumlah besar fragmen DNA yang berukuran sama serta berjalan ke posisi
yang sama.
6.Perbandingan pita dalam sampel dengan tangga DNA dapat diperkirakan
ukurannya. Penggunaan fluorescent dan pewarna memungkinkan DNA pada gel dapat
dilihat secara mudah setelah dipisahkan. Hal ini akan muncul sebagai pita pada gel.