Teknik blot

Prepared by : TS
Definisi

• Blot adalah suatu teknik memindahkan

bagian protein yang telah dipisahkan, RNA
atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau
matriks membran, agar bagian protein
tersebut mengalami imobilisasi.
 Keuntungan teknik blot
• Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah
terikat ke permukaan lembaran dibandingkan
kepada molekul yang masih berada di dalam gel
atau matriks.
• Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan.
• Waktu untuk melakukan staining dna destaining,
inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat.
• Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan
disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis.
• Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk
memungkinkan banyak metode analisis yang
dipakai
Matriks yang digunakan dalam Metode Blot

• Matriks yang biasa dipakai dapat berupa

nitroselulosa (NC). Namun NC juga
memiliki kekurangan, yaitu beberapa
komponen yang memiliki afinitas lemah
dapat hilang selama pemrosesan. Matriks
lain yang dapat digunakan untuk menutupi
kekurangannya yaitu kertas
diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula
kertas lain, yaitu iazophenylthioeter (DPT).
Macam-macam Metode Bloting
• Southern Blot
• Western Blot
• Northern Blot
• Eastern Blot
1. Southern Blot
• Dinamai sesuai penemunya, ahli biologi
Edwin Southern.
• Southern Blot adalah metode untuk
menyelidiki keberadaan sekuens DNA
tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel
sebelum atau setelah pencernaan enzim
restriksi dipisahkan dengan elektroforesis
gel dan kemudian ditransfer ke membran
dengan blotting melalui aksi kapiler.
• Membran tersebut kemudian terkena
probe DNA berlabel yang memiliki urutan
basa pelengkap untuk urutan DNA.
Kebanyakan protokol asli yang digunakan
label radioaktif, namun non-radioaktif
alternatif yang sekarang juga tersedia.
• Southern blotting kurang umum digunakan
dalam ilmu laboratorium karena kapasitas
teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi
urutan DNA spesifik dari sampel DNA.
Tetapi masih digunakan untuk beberapa
aplikasi, seperti mengukur jumlah salinan
transgen pada tikus transgenik, atau
rekayasa gen sel induk garis keturunan
embrio.
• Southern blot pertama kali dikemukakan
oleh Southern (1975). Teknik ini
mentransfer DNA ke kertas NC dengan
menggunakan prosedur aliran pelarut.
Caranya yaitu dengan menempatkan gel
elektroforesis ke kertas matriks yang
direndam buffer dan berada di atas sesuatu
seperti spons yang telah dibasahi dengan
buffer. Membran tersebut diletakkan di atas
gel dan ditumpuk pula beberapa kertas
peresap di atasnya.
• Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan
ke membran, demikian pula dengan gel yang
membawa molekul ke kertas membran,
sementara gelnya diserap oleh kertas
peresap. Fragmen DNA yang spesifik
dideteksi dengan menggunakan pelacak.
Pelacak biasanya merupakan DNA yang
dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas
spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang
terlihat setelah autoradiografi membuat kita
dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA
tersebut.
• Southern blot. DNA genom diisolasi dan
digesti dengan enzim restriksi. DNA
kemudian dirun pada gel agarose dan
ditransfer ke membran di mana DNA
kemudian diikatkan secara kovalen. DNA
selanjutnya dihibridisasi menggunakan
probe yang dilabel 32P. Interaksi antara
DNA dan probe yang dilabel dideteksi
dengan cara memajankan DNA-membran
ke film autoradiografi
 Keuntungan Sourthern Blot
• Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke
permukaan lembaran di bandingkan molekul yang masih berada
di dalam gel atau matriks
• Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan
• Waktu untuk melakukan staining DNA, destaining, inkubasi,
mencuci, dll menjadi lebih singkat
• Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-
bulan sebelum di analisis
• Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan
banyak metode analisis yang di pakai
• Matriks : matriks yang biasa di pakai dapat berupa nitroselulosa
(NC). Namun NC juga memiliki kekurangan yaitu, beberapa
komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama
pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi
kekurangannya adalah kertas diazobenzyloxymethyl (DBM) atau
diazophenylthioeter (DPT)
2. Western Blot
• Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal
Burnette dan dinamai western blot sebagai
olok-olokan terhadap teknik southern blot
yang pertama kali ditemukan.
• Western Blot (WB) merupakan suatu teknik
untuk menandai suatu protein pada membran
nitroselulosa, nilon, atau membran transfer
lain setelah protein tersebut terpisahkan
melalui elektroforesis. Protein tersebut
kemudian dapat dideteksi melalui metode
autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-
senyawa fluoresen, pelabelan dengan antibodi
terikat protein, lektin atau gen pengikat
spesifik lainnya (Attwood et al., 2006).
• Berdasarkan pengertian tersebut, WB
dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap
pertama, elektroforesis. Tahap kedua,
elektrotransfer. Tahap ketiga, deteksi
(Gambar 1) (Kindt et al., 2007).
• Pada tahap pertama, protein yang
diinginkan dipisahkan dari sampel secara
elektroforesis. Elektroforesis merupakan
pemisahan protein berdasarkan ukuran
molekul dalam suatu tegangan listrik
tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya
sampel yang mengandung protein biasanya
dicampur dengan SDS. SDS merupakan
suatu detergen yang memiliki muatan
negatif. Muatan negatif SDS tersebut
mengganggu kestabilan protein, sehingga
protein mengalami denaturasi.
• Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan
hidrogen yang menyebabkan suatu protein
mengalami folding untuk menjaga
kestabilannya menjadi terganggu akibat
adanya SDS. Suatu protein multimer juga akan
terurai menjadi monomer penyusunnya.
Akibatnya, protein-protein yang ada dalam
sampel membentuk suatu rantai polipeptida
lurus. Semakin besar berat molekul suatu
protein, maka rantai polipeptida tersebut
semakin panjang.
• Sampel dengan protein rantai polipeptida
lurus tersebut dimasukkan dalam suatu
membran poliakrilamid yang dialiri arus
listrik. Protein yang telah bermuatan negatif
akan bergerak dari kutub negatif menuju
kutub positif. Laju pergerakan protein dalam
membran poliakrilamid tersebut berbeda-
beda tergantung pada daya hambat antara
protein dan membran.
• Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya
hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi
lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein
yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik
selama beberapa waktu, masing-masing protein akan
terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang
lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan
bergerak lebih jauh dibanding protein yang lebih besar.
Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-
pita yang merupakan protein-protein yang telah
terpisah berdasarkan berat molekul (Koolman dan
Roehm, 2005).
• Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan
protein dari gel poliakrilamid menuju gel
transfer. Tahap pemindahan tersebut
menggunakan arus listrik sebagai faktor
pendorong transfer protein. Oleh karena itu,
proses pemindahan tersebut disebut juga
elektrotransfer. Elektrotransfer dapat dilakukan
dengan dua metode (Bollag et al., 1996)
• 1. Blotting semikering
Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah
dibasahi dengan buffer transfer. Kertas saring tersebut
diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer.
Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit
dengan arus lstrik tertentu.

• 2. Blotting basah
Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara
gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut
diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan
lapisan-lapisan pada blotting basah (Wenk dan Fernandis,
2007). Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45
menit hingga 1 malam. Metode blotting basah lebih umum
digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih
baik.
• Tahap ketiga merupakan deteksi protein
yang telah dipindahkan ke membran
transfer. Deteksi protein tersebut
memanfaatkan interaksi antara antigen
dan antibodi yang bersifat spesifik. Variasi
metode-metode tersebut terutama terletak
pada penggunaan antibodi primer dan
sekunder, serta penggunaan molekul
penanda.
• Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan
antibodi sekunder, ada dua metode deteksi,
yaitu: metode langsung dan metode tidak
langsung. Metode langsung menggunakan
antibodi primer yang telah terkonjugasi
dengan molekul marker. Metode tidak
langsung menggunakan antibodi primer dan
antibodi sekunder. Antibodi primer berfunsi
mengikat protein target, sedangkan antibodi
sekunder berfungsi mengikat antibodi primer
dan terkonjugasi dengan molekul penanda.
• Molekul penanda yang digunakan juga
bervariasi. Molekul penanda yang umum
digunakan diantaranya adalah enzim alkalin
fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase
(HRP), immunogold, dan 125I. Masing-masing
molekul penanda tersebut memiliki kelebihan
dan kekurangan. Molekul penanda
immunogold memiliki sensitifitas paling tinggi,
yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan 125I
memiliki sensitivitas relatif rendah yaitu 10-20
pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg (Bollag et al.,
1996).
 Langkah-langkah dalam Western Blot :

1. Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T

atau fibroblas ataupun sel darah tepi. Sampel harus dijaga
tetap dingin.
2. Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan
yang stabil.
3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai
pelacak
4. Melisiskan Sel
• Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan
protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis
sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA.
Bila yang diinginkan adalah sebuah protein
yang terfosforilasi, maka perlu ditambahkan
inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada
protein tersebut tidak dibuang. Cara melisis :
sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk.
Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan
kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu
kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar
tetap dingin.
 5. Gel Elektroforesis
• Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl
sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan
protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik.
Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah
dengan mendenaturasi polipeptida setelah terlebih dahulu
polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya.
Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu
jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki
muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga
bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-jaring
akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat
melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan
pergerakan ini akan terlihat pada pita-pita yang tergambar
pada tiap jalur.
6. Transfer Gel

• Agar protein tersebut dapat diakses oleh

antibodi, maka protein tersebut harus
dipindahkan dari gel ke sebuah kertas
membran, biasanya nitroselulosa atau
PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel,
dan tumpukan kertas penyerap diletakkan
di atasnya. Larutan buffer kemudian akan
merambat ke atas melalui reaksi kapiler
dengan membawa protein-proteinnya.
 7. Deteksi
• Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah
dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang
disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya
berlangsung dalam dua tahap, yaitu :
• a. Antibodi Primer
• Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi
yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika
terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian
diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit
selama 30 menit.
• Antibodi Sekunder
• Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas
mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi
dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder
adalah antobodi yang spesifik untuk suatu spesies
pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya
akan berikatan pada antibodi primer yang berasal
dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan
dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase
atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini
kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan
oleh antibodi primer.
• Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan
dengan satu langkah saja, yaitu dengan
menggunakan antibodi yang dapat
mengenali protein yang diinginkan
sekaligus memiliki label yang mudah
dideteksi
 8. Analisis
a. Colorimetric detection
• Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi
dengan reporter enzyme sehingga dapat mewarnai
membran nitorselulosa
b. Chemiluminescent
• Metode ini digunakan bila substrat merupakan
molekul yang bila bereaksi dengan antibodi
sekunder atu dengan reporter enzyme akan
teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan
densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang
terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih
disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik
inilah yang paling banyak digunakan sekarang.
c. Radioactive detection
• Metode ini menggunakan X-ray yang bila
mengenai label akan menciptakan region gelap.
Namun metode ini sangat maha dan beresiko
tinggi terhadap kesehatan.

d. Fluorescent detection
• Pelacak yang mmepunyai label yang dapat
mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi
oleh fotosensor seperti kamera CCD yang
menangkap image digital dari western blot. Hasil
kemudian dapat dianalisi secara kuantitaif
maupun kualitatif
 3. Northern Blot

• Northern blot digunakan untuk mempelajari pola

ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai
perbandingan relatif antara set sampel yang
berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah
kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel,
dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA
dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian
ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa
dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan.
• Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara
tergantung pada label yang digunakan, namun hasil
yang paling dalam penyataan band yang mewakili
ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas
band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target
dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini
umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan
berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan
mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam
sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat
yang paling dasar untuk menentukan pada waktu
apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang
dinyatakan dalam jaringan hidup.
• Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan
Southern Blot, namun menggunakan kertas DBM
dan biasanya mendeteksi RNA. Beberapa hal yang
membedakan dengan Southern blotting adalah: (1)
RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding
DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam
bufer yang mengandung zat kimia yang bersifat
melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah
berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi
denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya
berukuran tertentu sehingga tidak memelukan digesti
enzim untuk memperoleh pola pita. Kedua prosedur
sangat mirip karena setelah elektroforesis RNA juga
ditransfer ke membran melalui difusi kapilaritas.
Protokol Northern Blotting meliputi:
• isolasi RNA
• 'Gel' agar-agar electrophoresis RNA untuk
separasi
• Memindahkan ke selaput (nilon pada
umumnya bermuatan positif sebagai RNA
adalah bermuatan negatif)
• Cross-Linking RNA ke selaput (yang pada
umumnya dengan UV-CROSSLINKING
atau alat kimia)
• Hybridisasi dan Pendeteksian
4. Eastern Blot
• Eastern Blot merupakan teknik yang
ditemukan oleh Reinhard dan Malamud
(1982), adalah proses transfer
bidirectional dengan menggunakan aliran
pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan
titik isoelektrik. Teknik blotting eastern
digunakan untuk mendeteksi modifikasi
pasca-translasi protein. Protein
mengeringkan ke nitroselulosa membran
PVDF atau yang diperiksa untuk
modifikasi menggunakan substrat tertentu.
 KESIMPULAN
1. Blot adalah suatu teknik memindahkan
bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau
DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks
membran agar bagian protein tersebut
mengalami imobilisasi.
2. Macam-macam metode Blooting
• a. Souherm bloot atau Selatan Blot adalah
metode untuk menyelidiki keberadaan
sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA.
Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC
dengan menggunakan prosedur aliran pelarut.
• b. Western Blot (WB) merupakan suatu
teknik untuk menandai suatu protein pada
membran nitroselulosa, nilon, atau
membran transfer lain setelah protein
tersebut terpisahkan melalui
elektroforesis. Protein tersebut kemudian
dapat dideteksi melalui metode
autoradiografi, pelabelan dengan
senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan
dengan 125I, pelabelan dengan antibodi
terikat protein, lektin atau gen pengikat
• c. Northerm Bloot merupakan tekniknya sama
dengan Southern Blot, namun menggunakan
kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Blot
utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi
dari jenis tertentu molekul RNA sebagai
perbandingan relatif antara set sampel yang
berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah
kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel,
dan sebuah noda.
• d. Eastern Blot adalah proses transfer
bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut
protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik.
THE END