Western Blotting

KELOMPOK 9:
1. M Anton R 1713353038
2. Tri Sudaryanto 17133530
3. Fira Atasya1713353032
4. Dyar Firza Faiza 1713353014
5. Ifa Kurniawati 1713353025
6. Fenny K 17133530
7. Ananda Putri 17133530
8. Katerina Sekar A 17133530
9. Silvia Oktavini 17133530
10. Astri Yulita M 17133530
11. Whyngky Oktira 17133530
Apa itu blotting?
Blotting adalah teknik untuk mentransfer
DNA, RNA dan protein ke carier sehingga
mereka dapat dipisahkan, dan biasanya
menggunakan elektroforesis gel. Southern
blot digunakan untuk mentransfer DNA,
the Northern blot untuk RNA dan
western blot untuk PROTEIN.
Prinsip Western Blotting
Western blotting adalah teknik
Immunoblotting yang mengandalkan
spesifisitas pengikatan antara molekul minat
dan probe untuk memungkinkan deteksi
molekul minat dalam campuran banyak
molekul serupa lainnya.
Dalam Western blotting, molekul yang
diminati adalah protein dan probe biasanya
merupakan antibodi yang ditingkatkan
terhadap protein tertentu tersebut. Teknik SDS
PAGE adalah prasyarat untuk Western blotting.
Jenis Teknik Blotting

Blotting technique

Southern Blot Northern Blot Western blot

Digunakan untuk Digunakan untuk digunakan untuk
mendeteksi DNA mendeteksi RNA deteksi protein
Western blot
(Immunoblotting)
Teknik untuk mendeteksi protein spesifik
yang dipisahkan oleh elektroforesis dengan
menggunakan antibodi berlabel.
Prosedur Kerja
1. Persiapan jaringan (Tissue Preparation)
2. Gel ektroforesis
3. Transfer
4. Memblokir (Blocking)
5. Deteksi
6. Analisis
1. Tissue Preparation
Sampel dapat diambil dari seluruh
jaringan atau dari kultur sel.
Dalam kebanyakan kasus,
jaringan padat dipecah secara
mekanis menggunakan blender.
Perlu dicatat bahwa bakteri, virus
atau sampel lingkungan dapat
menjadi sumber protein dan
dengan demikian western blotting
tidak terbatas pada studi seluler
saja. Berbagai macam deterjen,
garam, dan buffer dapat
digunakan untuk mendorong lisis
sel dan melarutkan protein.
Persiapan jaringan sering
dilakukan pada suhu dingin untuk
menghindari denaturasi protein
2.Gel Elektrosis
Protein sampel dipisahkan menggunakan
elektroforesis gel. Pemisahan protein dapat
dilakukan dengan berat molekul titik
isoelektrik, muatan listrik, atau kombinasi
faktor-faktor ini.
3. Transferring
Untuk membuat protein dapat diakses untuk deteksi
antibodi, mereka dipindahkan dari dalam gel ke
membran yang terbuat dari nitroselulosa atau
polivinilidena difluorida (PVDF).

Membran ditempatkan di atas gel, dan setumpuk

kertas filter ditempatkan di atasnya. Seluruh
tumpukan ditempatkan dalam larutan buffer yang
bergerak naik ke kertas dengan aksi kapiler,
membawa protein bersamanya. Metode lain untuk
mentransfer protein disebut electro blotting dan
menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari
gel ke dalam PVDF atau membran nitroselulosa.
4. Memblokir (Blocking)
Membran memiliki kemampuan untuk mengikat
protein dalam hal ini target dan antibodi adalah
protein sehingga ada beberapa ikatan yang tidak
diinginkan. Pemblokiran pengikatan non-spesifik
dicapai dengan menempatkan membran dalam
larutan protein encer - biasanya Bovine serum
albumin (BSA) dengan persentase deterjen kecil
seperti Tween 20. Protein dalam larutan encer
melekat pada membran di semua tempat di mana
protein target belum melekat. Jadi, ketika antibodi
ditambahkan, tidak ada ruang pada membran
untuk dilampirkan selain di situs pengikatan
protein target spesifik
 5. Deteksi
Ada dua langkah untuk mendeteksi protein
Antibodi primer :
 Setelah pemblokiran, larutan encer antibodi
primer (umumnya antara 0,5 dan 5 mikrogram /
mL) diinkubasi dengan membran di bawah agitasi
lembut.
 Solusi terdiri dari larutan salin buffer dengan
persentase kecil deterjen, dan kadang-kadang
dengan susu bubuk.
 Solusi antibodi dan membran dapat disegel dan
diinkubasi bersama selama 30 menit hingga
semalam
5. Deteksi
Antibodi sekunder
Setelah membilas membran untuk
menghilangkan antibodi primer yang tidak
terikat, membran dihadapkan pada
antibodi lain, diarahkan pada bagian
spesifik spesies dari antibodi primer.
Beberapa antibodi sekunder akan mengikat
satu antibodi primer dan meningkatkan
sinyal.
6. Analisis
Deteksi kalorimetri
Metode pendeteksian kolorimetri tergantung
pada inkubasi western blot dengan substrat
yang bereaksi dengan enzim reporter
(seperti peroxidase)
Deteksi chemiluminescent
Metode deteksi chemiluminescent
bergantung pada inkubasi western blot
dengan substrat yang akan bercahaya saat
terpapar oleh reporter pada antibodi
sekunder.
6. Analisis
Deteksi radioaktif
Label radioaktif tidak memerlukan substrat
enzim, melainkan memungkinkan
penempatan film sinar-X medis secara
langsung terhadap western blot yang
berkembang ketika terkena label dan
menciptakan daerah gelap yang sesuai
dengan pita protein yang diminati
Penerapan
Tes konfirmasi HIV menggunakan western blot
untuk mendeteksi antibodi anti-HIV dalam sampel
serum manusia. Protein dari sel yang diketahui
terinfeksi HIV dipisahkan dan dihilangkan pada
membran seperti di atas. Kemudian, serum yang
akan diuji diterapkan pada langkah inkubasi
antibodi primer; antibodi bebas dihanyutkan, dan
antibodi anti-manusia sekunder yang dihubungkan
dengan sinyal enzim ditambahkan. Pita bernoda
kemudian menunjukkan protein yang mengandung
serum antibodi pasien. Western blot juga dapat
digunakan sebagai tes konfirmasi untuk infeksi
Hepatitis B.
Kekurangan
 Jika protein terdegradasi dengan cepat,
Western blotting tidak akan mendeteksinya
dengan baik.
 Tes ini memakan waktu lebih lama dari
tes lain yang ada.
 Dan mungkin juga lebih mahal
TERIMAKASIH