. WESTERN .

. BLOT .
. A N A LY S .
APA ITU BLOTTING?
Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer
DNA, RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran
sehingga DNA, RNA, atau protein tersebut dapat dipisahkan. Teknik
ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.
TEKNIK BLOTTING
WESTERN BLOT . . .
. .
. . . .
. .
 PENGERTIAN
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western blot
untuk mengikuti teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western blot adalah
proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.Teknik ini
menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli.

Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran
nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan
melalui elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode
autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan
antibodi terikat protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya.
 PRINSIP
Prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi protein spesifik pada
sampel jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi
berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi.
Tahap-tahap teknik Western Blot :
1. Tahap pertama Elektroforesis
2. Tahap kedua Elektrotransfer
3. Tahap ketiga Deteksi
 1. ELEKTROFORESIS
Pada tahap pertama ini, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel
secara elektroforesis. Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan
ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu. Dalam elektroforesis,
biasanya sampel yang mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS. SDS
merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif. Muatan negatif SDS
tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.
Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan hidrogen yang menyebabkan suatu
protein mengalami folding untuk menjaga kestabilannya menjadi terganggu akibat
adanya SDS.
 2. ELEKTROTRANSFER
Tahap kedua dalam Western Blot yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel
transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein
(proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer). Menurut Bollag et al., (1996) Elektrotransfer
dapat dilakukan dengan dua metode yaitu :
a. Blotting Semi Kering
Blotting semi kering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer. Kertas saring
tersebut diletakkan diantara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan
selama 10-30 menit dengan listrik tertentu.
b. Blotting Basah
Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua
gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer (Wenk dan Fernandis, 2007). Transfer
dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga 1 malam. Metode blotting basah lebih umum
digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.
 3. DETEKSI
Tahap ketiga ini merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke
membran transfer. Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen
dan antibodi yang bersifat spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama terletak
pada penggunaan antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan molekul
penanda.
ada 2 metode deteksi, yaitu:
1. Metode langsung (Direct)
menggunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker.
2. Metode tidak langsung (Indirect)
menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Antibodi primer berfunsi
mengikat protein target, sedangkan antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi
primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul penanda yang digunakan
juga bervariasi
 Aplikasi Teknik Western Blot
Teknik western blot telah banyak dikembangkan dalam berbagai
penelitian, salah satunya pada penelitian mengenai spesifitas dan
sensitifitas antibodi anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisia. Protein
eRF3 (eukaryotic release factor-3) merupakan salah satu protein
yang berperan pada proses terminasi translasi. Protein ini bersama-
sama dengan eRF1 (eukaryotic release factor-1) saling berinteraksi
membentuk kompleks release factor dalam memediasi pelepasan
rantai polipeptida dari ribosom.
Manfaat Western Blot
1. Untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein
berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan
antibodi yang spesifik
2. Dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein
KELEBIHAN
Sensitivitas
• mendukung western blot adalah sensitivitasnya. Karena kemampuannya untuk mendeteksi sesedikit 0,1
nanogram protein dalam sampel, teknik ini secara teoritis dapat berfungsi sebagai alat diagnostik dini yang
efektif, bahkan merasakan respons imunogenik sekecil apapun dari virus atau bakteri pada sampel pasien.
Sebuah blot barat tidak langsung lebih jauh dibangun berdasarkan kepekaan ini dari kemampuan antibodi
sekunder untuk memperkuat intensitas sinyal yang terdeteksi oleh sistem pencitraan. Sensitivitas yang lebih
besar berarti lebih sedikit antibodi yang dibutuhkan untuk pengujian, yang mengurangi biaya laboratorium
secara signifikan.

Spesifisitas
• Teknik blot barat bereplikasi kekhususannya menjadi dua faktor besar. Pertama, elektroforesis gel memilah
sampel menjadi protein dengan ukuran, muatan, dan konformasi yang berbeda. Proses ini sendiri
merupakan langkah besar menuju deteksi, karena band yang terbentuk di gel sudah memberi petunjuk
tentang ukuran protein atau polipeptida yang diminati. Spesifisitas interaksi antibodi-antigen berfungsi
sebagai faktor besar kedua. Karena antibodi spesifik menunjukkan afinitas untuk protein tertentu, proses
tersebut dapat secara selektif mendeteksi protein target bahkan dalam campuran 300.000 protein berbeda.