Western Blot

Posted on February 12, 2014 by belajarbiokimia

Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran
nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut terpisahkan melalui
elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode autoradiografi,
pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan 125I, pelabelan dengan antibodi
terikat protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya (Attwood et al., 2006).
Berdasarkan pengertian tersebut, WB dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama,
elektroforesis. Tahap kedua, elektrotransfer. Tahap ketiga, deteksi (Gambar 1) (Kindt et al.,
2007).

Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara elektroforesis.
Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan
listrik tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang mengandung protein biasanya
dicampur dengan SDS. SDS merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif. Muatan
negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.
Interaksi ionik, jembatan disulfida, ikatan hidrogen yang menyebabkan suatu protein mengalami
folding untuk menjaga kestabilannya menjadi terganggu akibat adanya SDS. Suatu protein
multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya. Akibatnya, protein-protein yang ada
dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul suatu

protein, maka rantai polipeptida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai
polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus
listrik. Protein yang telah bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub
positif. Laju pergerakan protein dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung
pada daya hambat antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan
memiliki daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat dibandingkan
dengan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri arus listrik selama
beberapa waktu, masing-masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein
yang lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein
yang lebih besar. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan
protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul (Gambar 2) (Koolman dan Roehm,
2005).

Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer.
Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer protein.
Oleh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer. Elektrotransfer dapat
dilakukan dengan dua metode, yaitu (Bollag et al., 1996):
1. Blotting semikering
Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer.
Kertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti
ini dapat dilakukan selama 10-30 menit dengan arus lstrik tertentu.

2. Blotting basah
Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer,
tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer. Susunan lapisanlapisan pada blotting basah diperlihatkan pada Gambar 3 (Wenk dan Fernandis, 2007).
Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga 1 malam. Metode blotting
basah lebih umum digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.

Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon. Pada
sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena relatif tidak mahal dan
bloking mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan terutama pada beberapa keadaan
khusus. Pertama, kapasitas pengikatan dengan protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari
kapasitas pengikatan nitroselulosa dan protein. Kedua, protein terikat sangat lemah pada
nitroselulosa. Ketiga, adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik (Bollag et al.,
1996).
Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap yang sangat penting
dalam WB. Oleh karena itu, ada beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam proses transfer
protein tersebut.
1. Arus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu tinggi dapat
menghasilkan panas selama transfer yang dapat menimbulkan masalah.
2. Kekuatan ion yang rendah buffer transfer yang rendah dapat digunakan pada tegangan listrik
yang tinggi tanpa perlu dikhawatirkan menghasilkan panas yang tinggi.
3. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah 200 mA selama 2 jam.
4. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel dengan konsentrasi
poliakrilamid yang rendah.

Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran transfer. Deteksi
protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik.
Variasi metode-metode tersebut terutama terletak pada penggunaan antibodi primer dan
sekunder, serta penggunaan molekul penanda. Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan
antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu: metode langsung dan metode tidak langsung.
Metode langsung menggunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker.
Metode tidak langsung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Antibodi primer
berfunsi mengikat protein target, sedangkan antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi
primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul penanda yang digunakan juga
bervariasi. Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah enzim alkalin fosfatase
(AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), immunogold, dan 125I. Masing-masing molekul
penanda tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan. Molekul penanda immunogold memiliki
sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan 125I memiliki sensitivitas
relatif rendah yaitu 10-20 pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg (Bollag et al., 1996).
Daftar Pustaka
Attwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling dan F. Vella (Ed), 2006,
Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition, Oxford University
Press.
Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein, 1996, Protein Method, Wiley-Liss, Inc
Kindt, T.J., R.A.Goldsby, B.A. Osborne, J. Kuby, 2007, Kuby Immunology, W.H. Freeman, New
York.
Koolman, J. dan K. Roehm, 2005, Color Atlas of Biochemistry, Second edition, revised and
enlarged, Thieme.
Wenk, M.R. dan A.Z. Fernandis, 2007, Manuals in Biomedical Research : A Manual For
Biochemistry Protocols, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.
Written by: Rizmahardian Ashari Kurniawan