WESTERN BLOT

Definisi Western Blot

Western blot atau disebut sebagai imunoblotting merupakan teknik yang digunakan
dalam penelitian molekular dan biokimia untuk memisahkan dan mengidentifikasi protein
spesifik yang dilakukan pada membran nitroselulosa atau PVDF. Dalam proses teknik
western blot melibatkan transfer pola protein dari gel ke membran mikropori.

Metode blotting sendiri pertama kali dikembangkan oleh Edwin Mellor Southern yang
meminjamkan namanya untuk tes deteksi DNA "Southern blot". Kemudian metode
pendeteksi RNA diberi nama “Northern blot dan istilah “Western blot” dipilih dan diterima
untuk deteksi suatu protein.

Teknik Analisis

Teknik analisis dalam western blot menggunakan tiga tahapan yaitu pemisahan
berdasarkan ukuran, transfer ke media yang padat, dan menandai protein target menggunakan
antibodi primer dan sekunder yang tepat. Campuran protein dipisahkan berdasarkan berat
molekul melalui elektroforesis gel. Hasil tersebut kemudian ditransfer ke membran yang akan
menghasilkan pita untuk setiap protein. Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi label
khusus untuk protein yang diinginkan.

Prinsip Analisis (Ilustrasi Teknik Pemisahan)

Meskipun rincian ilustrasi teknik pemisahan Western blot dapat bervariasi dari
aplikasi ke aplikasi, dengan adaptasi untuk memenuhi karakteristik protein tertentu dan
tingkat informasi yang diperlukan, namun semua teknik dalam western blot mengikuti
beberapa langkah dasar umum.

Prinsip analisis western blotting yaitu pemindahan protein dari matriks gel ke
membran transfer dan proses deteksinya secara imunologi. Identifikasi protein menggunakan
teknik analisis ini, berdasarkan dua karakteristik yang berbeda yaitu berdasarkan ukuran
molekul dan pengikatan spesifik oleh antibodi. Awalnya dilakukan elektroforesis gel untuk
memisahkan protein berdasarkan bobot molekulnya. Selanjutnya, protein yang dihasilkan
tersebut kemudian ditransfer dari matriks gel hasil elektroforesis ke dalam suatu membran
transfer yang akan diuji menggunakan antibodi yang spesifik terhadap protein tersebut.
Adapun teknik elektroforesis yang merupakan tahapan pertama, menggunakan SDS-PAGE.
Sementara membran transfer yang digunakan dapat berupa membran nitro-cellulose (NC),
membran nilon, atau membran polyvinylidene difluoride (PVDF).

Tahapan kedua. Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai, digunakan untuk
elektrotransfer. Gel dan membran transfer disusun dalam alat transblotting (seperti
sandwich), lalu diisi dengan buffer transfer. Blotting dilakukan selama 1 jam pada arus
konstan tertentu menggunakan power supply. Jika prestained marker telah terlihat pada
membran berarti sampel protein telah terpindahkan ke membran. Selanjutnya membran
direndam dengan larutan blocking buffer selama 1 jam pada suhu kamar, diletakkan di atas
shaker. Selanjutnya membran diinkubasi dalam antibodi primer (HRP-konjugat atau AP-
konjugat) tepat di bagian atas membran yang diduga terdapat protein tersebut selama over
night pada temperatur 4oC, diletakkan di atas shaker. Setelah itu membran dicuci selama 5
menit menggunakan buffer PBST/TBST sambil digoyang atau diletakkan di atas shaker.
Kemudian membran direndam dalam antibodi sekunder (HRP-konjugat atau AP-konjugat)
tepat di bagian atas membran yang diduga terdapat protein, selama 1 jam pada suhu kamar
dan diletakkan di atas shaker. Membran kemudian dicuci kembali menggunakan buffer
PBST/TBST selama 5 menit sambil digoyang atau diletakkan diatas shaker.

Tahapan ketiga. Deteksi visual dapat dilakukan dengan cara pewarnaan. Membran
direndam dalam larutan substrat BCIP/NBT, wadah ditutup dan diselubungi dengan
aluminium foil. Diinkubasi pada suhu kamar, diletakkan di atas shaker selama 15 menit atau
hingga terlihat garis/pita ungu. Kemudian membran direndam dalam larutan stopper dan
dilakukan dokumentasi dengan foto dibawah lampu neon.

Studi Kasus

Secara umum aplikasi yang telah dilakukan dalam teknik western blot sebagai
berikut:

1. Dapat mengidentifikasi sifat protein atau epitop secara efektif

2. Dapat diaplikasikan sebagai alat kuantitatif antigen mikromolekul yang bekerja sama
dengan imunopresipitasi
3. Pemetaan epitop yaitu dapat mengidentifikasi proses pengikatan situ atau epitop,
antibodi pada antigen target
4. Analisis beberapa kandungan protein dalam serum
 5. Analisis domain struktur.
6. Pemurnian Protein Rekombinan
7. Analisis Fraksi IgG Dimurnikan dari Plasma Manusia
8. Western blot diterapkan dalam tes konfirmasi HIV untuk mendeteksi antibodi anti-
HIV dalam sampel serum manusia.
9. Aplikasi diagnosis medis dari western blot dalam tes konfirmasi untuk infeksi
Hepatitis B

Protokol Teknik

1. Transfer
Ada dua jenis metode blotting, semi-dry dan tank blotting. Metode semi-dry
lebih disukai karena waktu penyemprotan lebih pendek. Sedangkan untuk membran,
membran PVDF cenderung digunakan lebih sering karena kekuatan pengikatan
proteinnya melebihi dari membran nitroselulosa.
 Perbandingan Metode Blotting
Tank Blotting Semi dry Blotting
Transfer Buffer Panjang Kecil
Volume
Temperatur Rendah karena pendingin disediakan Sedikit meningkat, tetapi
Treatment oleh transfer buffer selama blotting. masih tidak perlu untuk
menyediakan pendingin
selama blotting.
Waktu Blotting Lebih dari 4 jam 2 jam
Hasil Relatif Seragam Cenderung kurang seragam
Ekspektasi
Transfer
Efisiensi periode blotting tegangan rendah Jangka pendek, periode
Transfer yang panjang menyediakan waktu tegangan tinggi blotting dapat
yang cukup untuk setiap protein, menyebabkan perbedaan
terlepas dari berat molekulnya, untuk dalam efisiensi transfer antara
ditransfer secara efisien ke membran protein berat molekul tinggi
dan rendah
  Perbandingan Membran Blotting
PVDF (Polyvinylidene Difluoride) Nitrocellulose Membrane
Membran
Sifat Hidrofobik Hidrofilik
Kekuatan Kuat Lemah
Membran
Pertahanan Sekitar 250 µg/cm2 Sekitar 100 µg/cm2
Jumlah Protein
Biaya Besar Kecil

Protokol Transfer Semi-dry dengan Membran PVDF

1. Preparasi Membran PVDF

a. Tuangkan sekitar 50 ml metanol 100% ke dalam nampan bersih (nampan sekali
pakai atau sejenisnya), yang disebut baki 1. Selanjutnya, mulai dari tepi baki,
perlahan-lahan geser membran ke dalam metanol sampai benar-benar terendam.
Kemudian, gerakkan perlahan baki selama 1 menit.
b. Buang metanol sepenuhnya dari baki 1. Selanjutnya, tuangkan 50 ml larutan
Semi-dry Blotting ke dalam baki 1, kemudian rendam baki dengan pengocok
selama 10-20 menit.
2. Preparasi Gel Akrilamida
a. Tuang 50 ml larutan Semi-dry Blotting ke dalam nampan lain yang bersih disebut
sebagai baki 2. Masukkan gel poliakrilamida ke dalam baki 2, lalu rendam dengan
selama 10-20 menit untuk memastikan gel benar-benar jenuh.
3. Persiapan Plate Elektroda
a. Potong 12 lembar kertas saring dengan ukuran sedikit lebih besar dari membran
pvdf
b. Tuangkan 50 ml larutan blotting semi-kering untuk blotting barat ke nampan
bersih baru (baki 3)
c. Rendam kertas filter selama satu detik, satu per satu, di dalam baki 3 kemudian
gunakan dinding baki (jika perlu) untuk menghilangkan cairan, tempatkan kertas
saring berturut-turut pada pelat elektroda positif, mulai dari tepi. enam lembar
kertas saring harus benar-benar tumpang tindih
 d. Tumpang tindih dengan membran PVDF, mulai dari tepi
e. Tempatkan gel poliakrilamid yang disetimbangkan menurut langkah 2, persiapan
gel poliakrilamida, ke membran PVDF. Tandai tepi gel pada membran dengan
bolpoin untuk melihat sisi protein dan area yang dipindahkan dengan mudah.
kemudian, susun sisa enam pai kertas saring dengan mengulanginya di atas
dari langkah c.
f. Atur pelat elektroda negatif pada kertas saring
g. setelah langkah c-f, lepaskan daya dari peralatan blotting, dan kemudian lepaskan
kertas saring satu per satu, dari sisi pelat elektroda negatif. Selanjutnya, rendam
membran PVDF.
4. Pencucian Membran PVDF
a. Setelah menempatkan membran PVDF ke dalam nampan sekali pakai, tambahkan
larutan buffer dan kocok baki selama 5 menit. Kemudian, ganti dengan larutan
baru dan ulangi seluruh proses.
2. Confirming Transfer
Membran Nitrocellulose dan PVDF ditransfer dari gel poliakrilamida diwarnai
dengan menggunakan pewarna yang menunjukkan lokasi dan efisiensi transfer
seluruh protein pada membran. Commasie Brilliant Blue (CBB) direkomendasikan
sebagai pewarna untuk mendeteksi ketidakseragaman pada transfer.

Protokol Pewarnaan Membran dengan CBB Stain One

1. Pewarnaan
a. Tuangkan pewarna CBB Stain One ke dalam baki bersih kemudian rendam
membran selama 15 menit
b. Cuci membran dengan air selama 5 menit. Ulangi
o SDS-Page 12% gel
o Sampel Penanda Protein, Serum Manusia, Pre stained penanda protein
o Membran Membran PVDF
2. Penghilangan Warna Protein untuk Analisis Western Blot
a. Tuang 20 ml larutan A, larutan B dan 30 ml air deionisasi ke dalam baki.
Volume larutan cukup untuk 10 cm x 10 cm bagian dari membran.
b. Rendam membran yang telah diwarnai pada campuran larutan selama 5 menit.
 3. Western Blotting
Deteksi reaksi dari antibodi primer dan sekunder dan protein target
menggunakan kit deteksi untuk destained membrane.
3. Blocking
Setelah transfer protein ke membran, membran harus diblokir dengan reagen
pemblokiran untuk mencegah reaksi antibodi non spesifik. Terdapat beberapa macam
reagen pemblokiran termasuk BSA, susu skim, kasein, gelatin dan senyawa dengan
berat molekul tinggi. Penentuan agen blocking yang tepat digunakan tergantung pada
protein target, dan faktor terkait lainnya.

Perbandingan Reagen Blocking

Name Deskripsi Waktu

(menit)
Blocking One Reagen ini didasarkan pada senyawa dengan 30
berat molekul tinggi yang disintesis sehingga
bisa memberikan efisiensi pemblokiran yang
cepat dan kuat
Blocking One-P deteksi protein terfosforilasi. Produk ini terkait 30
dengan Blocking One, tetapi bebas dari gugus
fosfat dan fosfat endogen.
BSA Deteksi tirosin terfosforilasi, digunakan 1-5% 60
pelarut BSA
Susu Skim Agen blocking yang biasa digunakan 60

Protokol untuk Blocking One

1. Tuang larutan Blocking One ke dalam baki dan rendam dengan membran
2. Kocok baki selama 30 menit pada temperatur ruang

Protokol untuk Blocking One-P

1. Tuang Blocking One-P ke dalam baki dan rendam dengan membran

2. Kocok baki selama 20 menit pada temperatur ruang
4. Deteksi
a. Deteksi Chemiluminescence pada Western Blot
Protokol Chemi-Lumi One Super
1. Reaksi Antibodi
Reaksi Antibodi Primer
o Encerkan antibodi primer dengan buffer yang tepat kemudian agitasi
membran yang ditransfer pada suhu kamar selama 1 jam menggunakan
shaker.
o Rendam membran pada baki yang berisi buffer dan agitasi baki selama 5
menit menggunakan shaker. Ulangi
Reaksi Antibodi Sekunder
o Encerkan antibodi primer dengan buffer yang tepat kemudian agitasi
membran yang ditransfer pada suhu kamar selama 1 jam menggunakan
shaker.
o Rendam membran pada baki yang berisi buffer dan agitasi baki selama 5
menit menggunakan shaker. Ulangi
2. Prosedur
 Preparasi larutan, larutan A dan larutan B (termasuk kit Chemi-lumi
One Super) pada perbandingan 1:1
 Buang buffer larutan antibodi sekunder dengan menyentuh tepi
membran
 Membran diletakkan pada plastik wrap dengan hati-hati dengan
protein transfer menghadap ke atas, kemudian aplikasikan larutan ke
dalam membran. Biarkan pada suhu ruang selama 1 menit.
Tambahkan 0,1 ml dari larutan untuk tiap cm2 dari membran.
 Pegang membran dengan pinset kemudian keluarkan larutan yang
berlebih dengan menyentuh tepi membran
 Tempatkan membran pada plastik wrap baru dengan protein transfer
menghadap ke bawah
 Tempatkan membran yang telah di wrap pada film kaset dengan
protein transfer menghadap ke atas.
 Tempatkan film X-ray pada bagian atas dari membran yang telah di
wrap, tutup film kaset kemudian diamkan selama 1 menit atau lebih
jika diperlukan.
 Lepas film X-Ray dari film kaset dan rendam sampai gambar terlihat
 Rendam X-ray film pada larutan stop (0,3% larutan asam asetat)
 Rendam X-ray film pada larutan campuran
 Cuci X-ray film dengan air untuk menghilangkan fixer kemudian
keringkan
Glosarium

1. Antibodi Glikoprotein dengan struktur tertentu yang

2. Antibodi Primer
3. Antibodi Sekunder
4. Antigen
5. AP-Konjugat
6. Blocking Buffer
7. Blotting
8. Bovine Serum Albumin (BSA)
9. Buffer PBST
disekresikan oleh sel B sebagai respon dari
antigen tertentu dan reaktif terhadap antigen
Antibodi pertama, khusus untuk protein target,
digunakan sebagai penyelidikan pada membran
yang hilang. Antibodi primer biasanya tidak
diberi label.
Antibodi berlabel yang diarahkan ke daerah
konstan dari antibodi primer. Meningkatkan
sensitivitas pengujian dengan pengikatan ganda
dari antibodi berlabel ke antibodi primer.
Struktur yang menginduksi pembentukan
antibodi spesifik pada hewan uji
Enzim Alkaline Phosphatase (AP) sebagai pe-
label, yang diletakkan pada antibodi primer
(untuk direct) atau antibodi sekunder (untuk
indirect)
Buffer yang terbuat dari campuran susu skim
dengan PBST atau buffer yang terbuat dari
campuran BSA dengan PBST, fungsinya adalah
memblokir protein nonspesifik
Proses pemindahan protein dari gel ke membran
yang dibantu medan listrik. Dikenal sebagai
immunoblotting.
Protein yang memiliki banyak aplikasi, termasuk
penggunaannya sebagai agen penghambat dan
sebagai standar dalam uji konsentrasi protein
total
Tris Buffer Saline Tween 20 (TBST) yang terbuat
dari campuran Tris Buffer Saline (TBS) dengan
Tween 20,
10. Buffer TBST Tris Buffer Saline Tween 20 (TBST) yang terbuat
dari campuran Tris Buffer Saline (TBS) dengan
Tween 20,
11. Chemiluminescence Emisi cahaya oleh molekul sebagai hasil dari
reaksi kimia
12. Commasie Brilliant Blue (CBB) Pewarna yang digunakan untuk mengukur kadar
protein dengan spektrofotometer
13. Elektrotransfer Teknik pemindahan protein dari gel hasil
elektroforesis ke membran transfer menggunakan
arus listrik sebagai media pendorong
pemindahannya

14. Elektroforesis Proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik
15. Elektroforesis Gel Teknik pemisahan campuran protein yang
memiliki perbedaan berat molekul, muatan
elektron, dan bentuk molekul per unit massa
akibat pergerakan migrasi molekul protein dalam
media berpori dengan bantuan aliran listrik
16. Epitop Wilayah molekul spesifik dari suatu antigen yang
dikenal oleh suatu antibodi.
17. Gel Akrilamida Senyawa organik yang digunakan sebagai fase
diam dalam elektroforesis gel (SDS-Page)
18. HRP-Konjugat Enzim Horseradish Peroksidase (HRP) sebagai
pe-label, yang diletakkan pada antibodi primer
(untuk direct) atau antibodi sekunder (untuk
indirect)
19. Imunologi Ilmu yang mempelajari tentang sistem kekebalan
tubuh yang berkaitan dengan antibodi yang dapat
melawan antigen (zat asing) terutama pada
mamalia

20. Imunopresipitasi Penghapusan protein mekanis atau protein

kompleks dari sampel dengan inkubasi antibodi

21. Larutan Stopper
22. Membran Nitro-cellulose
23. Membran Nilon
24. Membran Polyvinylidene
difluoride (PVDF)
25. Prestained marker
26. Substrat BCIP
27. Substrat NBT
28. SDS-Page
29. Transblotting
yang digabungkan ke matriks padat, seperti
Sepharose.
Larutan yang terbuat dari EDTA dalam PBS,
berfungsi untuk mendenaturasi protein
Membran transfer sebagai tempat analisis protein,
mudah penggunaannya dengan kapasitas
pengikatan yang tinggi tetapi mudah sobek atau
rapuh
Membran transfer sebagai tempat analisis protein,
biasanya dipakai untuk transfer protein
hidrofobik tetapi kapasitas pengikatannya rendah
Membran transfer sebagai tempat analisis protein,
memiliki kapasitas pengikatan tinggi dan lebih
kuat meskipun preparasi transfernya sulit
Trayek noda protein yang muncul pada membran
transfer dari gel hasil elektroforesis
Substrat yang dapat berpendar, yang terbuat dari
Bromochloroindoyl phosphate (BCIP) yang
dilarutkan dalam aquades
Substrat yang dapat berpendar, yang terbuat dari
Nitro blue tetrazolium (NBT) yang dilarutkan
dalam dimethyl formamide (DMF)
Teknik pemisahan protein hanya berdasarkan
Berat Molekul (BM)
Serangkaian alat yang digunakan untuk
elektrotransfer protein