PRAKTIKUM 11

A. Judul Praktikum : Western Blot

B. Tujuan Praktikum :

a) Agar mahasiswa mengetahui pengetahuan atau teori secara umum dari Teknik
Western Blot.

b) Agar mahasiswa mengetahui secara rinci mengenai prinsip kerja dari Teknik
Western Blot.

c) Agar mahasiswa mengetahui secara rinci langkah kerja Western Blot.

d) Agar mahasiswa mengetahui aplikasi dan manfaat dari penggunaan teknik

Western Blot.

C. Dasar Teori :

Dalam dunia kesehatan sering ditemukan berbagai penyakit yang dapat

mengancam kesehatan makhluk hidup. Contoh dari penyakit itu adalah HIV/AIDS.
Mad-cow disease (sapi gila), penyakit Lyme yang disebabkan oleh kutu, Hepatitis,
FIV yang terjadi pada kucing, dan masih banyak penyakit lainnya. Penyakit tersebut
memiliki gejala-gejala yang mirip dengan penyakit lainnya, sehingga besar
kemungkinan untuk terjadi kesalahan diagnose penyakit yang dapat membahayakan
bagi penderita. Oleh karena itu, diperlukan suatu teknik yang dapat mendeteksi
keberadaan substrat penyebab suatu penyakit di dalam tubuh secara spesifik. Substrat
tersebut ditemukan dalam bentuk protein yang spesifik berupa antigen.

Antigen merupakan protein asing yang berbahaya dan dapat menyerang tubuh
sehingga akan memicu munculnya antiboiy spesifik pada tubuh. Antibodi yang
terdapat pada tubuh merupakan bagian sistem dari kekebalan tubuh yang dapat
mencegah tubuh dari serangan penyakit yang disebabkan oleh antigen yang masuk ke
dalam tubuh.

Untuk dapat mendeteksi keberadaan suatu antigen pada tubuh, diperlukan

suatu teknik diagnosa sistematis yaitu Western Blotting. Teknik ini merupakan bagian
dari diagnosa kesehatan dalam disiplin ilmu Biologi Molekuler, Biokimia dan juga
 Immunogenetik. Teknik ini pertama kali dibuat oleh W.Neal dan dinamai Western
Blot. Western Blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada jaringan
yang homogeny ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut
berkaitan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk
memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-
nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa
atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi
yang spesifik kepada protein target.

D. Alat :

 Western Blot

E. Hasil :

Gambar Western Blot

F. Pembahasan :

a) Pengertian Western Blot

Menurut Fatchiyah, dkk (2011), western blot adalah istilah yang dipakai untuk
proses transfer dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk : (1)
mengetahui keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam suatu campuran,
 (2) membandingkan reaksi silang antar protein, (3) mempelajari modifikasi
protein selama sintesis. Dengan car aini, protein dalam hitungan nanogram dapat
terdeteksi. Nur & Adijuwana (1989) mengemukakan bahwa western blot adalah
proses pemindahan hasil protein dari gel hasil elektroforesis ke membran dan
digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Immunoblot
menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli. Hasil
elektroforesis antigen lalu ditransfer ke membran nitroselulosa dengan bantuan
arus listrik. Antigen pada membran selanjutnya akan dikenali oleh antibodi dari
sampel. Pita-pita yang terpisah dapat dideteksi dengan terdapatnya warna pada
membran.

Menurut Attwood et al., (2006) menyatakan bahwa Western Blot (WB)

merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein pada membran
nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein tersebut
terpisahkan melalui elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat dideteksi
melalui metode autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen,
pelabelan dengan 125
I, pelabelan dengan antibodi terikat protein, lektin atau gen
pengikat spesifik lainnya. Western Blot digunakan secara luas untuk menentukan
ukuran antigen dan antibodi yang diketahui, serta untuk diidentifikasi. Teknik ini
memiliki beberapa keuntungan seperti :

1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi karena

protein dipekatkan dalam volume kecil.

2. Waktu yang dibutuhkan efisien.

3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis.

b) Prinsip Kerja Western Blot

 Berdasarkan gambar tersebut, prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi
protein spesifik pada sampel jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi
berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini
menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan Panjang
polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka
kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada
protein target.

Membran tersebut (PVDF) dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel

sehingga protein yang terblot pada membrane dapat dideteksi dengan cara visual
maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan
prinsip imunologi menggunakan antibody primer dan antibody sekunder.
Setelah pemberian antibody sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan
pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi,
reaksi antara antibody primer dengan antibody sekunder akan memberikan hasil
fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di
kamar gelap.

Immunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang rapuh
untuk dapat melalui proses inkubasi yang lama dan pencucian yang berulang kali.
Untuk mengatasi hal ini, maka protein terlebih dahulu ditransfer dari gel ke
membrane nitroselulosa (NC) atau membrane poliviniliden difluoride (PVDF).

Membrane digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang diuji karena :

1. Mudah manipulasinya

2. Mengurangi lama inkubasi dan pencucian

3. Hasil protein yang ditransfer (hasil blot) dapat dipakai lagi untuk
immunodeteksi protein yang lain (sesduah diinkubasi dengan
detergen untuk menghilangkan probing reagent)

4. Blot dapat disimpan sampai 1 bulan

5. Blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi

 Proses mendeteksi protein target dapat dilakukan secara direct dan indirect.
Pendeteksian secara direct (langsung) tidak membutuhkan antibodi sekunder
karena antibody primer sudah langsung dilabeli oleh enzim maupun pewarna
fluorescent. Sedangkan pendeteksian secara indirect (tidak langsung) yaitu
antibody primer ditambahkan lebih dahulu supaya berikatan dengan protein
antigen dalam sampel, lalu diikuti penambahan antibody sekuner sehingga
antibody sekunder dapat langsung berikatan dengan antibody primer. Label yang
digunakan adalah konjugat enzim (substrat) chemiluminescent horseradish
(HRP). Perbandingan prosedur pendeteksian protein antara direct dan indirect
dapat dilihat pada gambar diatas. Pendeteksian protein target secara indirect lebih
banyak digunakan karena memiliki kelebihan antara lain antibody sekunder dapat
memperkuat sinyal pendeketsi, pelabelan tidak mempengaruhi imunoreaktivitas
antibody primer, dan satu antibody sekunder dapat digunakan untuk beberapa
antibody primer.

c) Tahapan Western Blot

a. Tahap Pertama

Pada tahap pertama, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara
elektroforesis. Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran
molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya
sampel yang mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS. SDS
merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negative. Muatan negatif SDS
tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.
Interaksi ionic, jembatan disulfida, ikatan hydrogen yang menyebabkan suatu
protein mengalami folding untuk menjaga kestabilannya menjadi terganggu akibat
adanya SDS. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer
penyusunnya. Akibatnya, protein-protein yang ada dalam sampel membentuk
suatu rantau polipetida lurus. Semakin besar berat molekul suatu protein, maka
rantai polipetida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai
polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membrane poliakrilamid yang
dialiri arus listrik. Protein yang telah bermuatan negative akan bergerak
dari kutub negative menuju kutub positif. Laju pergerakan protein dalam
membrane poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung pada daya hamba
tantara protein dan membrane. Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki
daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat
dibandingkan dengan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah
dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing-masing protein akan terpisah
berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau memiliki berat
molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibandingkan protein yang lebih besar.
Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan
protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul.

b. Tahap Kedua

Tahap kedua dalam WB yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid

menuju gel transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik
sebagai faktor pendorong transfer protein. Oleh karena itu, proses pemindahan
tersebut disebut juga elektrotransfer. Elektrotransfer dapat dilakukan dengan
dua metode, yaitu :
1. Blotting semikering

Blotting semikering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan

buffer transfer. Kertas saring tersebut diletakkan di antara gel poliakrilamid
dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan selama 10-30 menit
dengan arus listrik.

2. Blotting basah

Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid

dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam
buffer transfer. Susunan lapisan-lapisan pada blotting basah diperlihatkan
pada gambar dibawah ini. Transfer dengan blotting basah dapat dilakukan 45
menit hingga 1 malam. Metode blotting basah lebih umum digunakan karena
fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.

Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan
nilon. Pada sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan
karena relative tidak mahal dan bloking mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga
digunakan terutama pada beberapa keadaan khusus. Pertama, kapasitas
pengikatan dengan protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas
pengikatan nitroselulosa dan protein. Kedua, protein terikat sangat lemah pada
nitroselulosa. Ketiga, adanya kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik.

Transfer protein gel dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan
tahap yang sangat penting dalam WB. Oleh karena itu, ada beberapa faktor
yang harus diperhatikan dalam proses transfer protein tersebut.

1. Arus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu
tinggi dapat menghasilkan panas selama transfer yang dapat menimbulkan
masalah.
 2. Kekuatan ion yang rendah buffer transfer yang rendah dapat digunakan
pada tegangan listrik yang tinggi tanpa perlu dikhawatirkan menghasilkan
panas yang tinggi.

3. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah 200 mA selama 2 jam.

4. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel

dengan konsentrasi poliakrilamid yang rendah.

c. Tahap Ketiga

Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membrane

transfer. Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan
antibody yang bersifat spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama
terletak pada penggunaan antibody primer dan sekunder, serta penggunaan
molekul penanda. Berdasarkan penggunaan antibody primer dan antibody
sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu : metode langsung dan metode tidak
langsung. Metode langsung menggunakan antibody primer yang telah
terkonjugasi dengan molekul marker. Metode tidak langsung menggunakan
antibody primer dan antibody sekunder. Antibody primer berfungsi mengikat
protein target, sedangkan antibody sekunder berfungsi mengikat antibody
primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul penanda yang
digunakan juga bervariasi. Molekul penenda yang umum digunakan
diantaranta adalah enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase
(HRP). Immunogold, dan I. Masing-masing molekul penanda tersebut
125

memiliki kelebihan dan kekurangan. Molekul penanda immunogold memiliki

sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan 125
I
memiliki sensitivitas relative rendah yaitu 10-20 pg, 10-50 pg, dan 20-100 pg.

d) Aplikasi dan Manfaat Western Blot

a. Aplikasi Teknik Western Blot

Teknik western blot telah banyak dikembangkan dalam berbagai

penelitian, salah satunya pada penelitian mengenai spesifitas dan sensitifitas
 antibody anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisiae. Protein eRF3 (eukaryotic
release factor-3) merupakan salah satu protein yang berperan pada proses
terminasi translasi. Protein ini Bersama-sama dengan eRF1 (eukaryotic release
factor-1) saling berinteraksi membentuk kompleks release factor dalam
memediasi pelepasan rantai polipetida dari ribosom.

Untuk memahami mekanisme terminasi translasi dalam system

eukariot dilakukan evaluasi struktur fungsi eRF1 yang dilanjutkna dengan
studi in vitro eRF1 muatan dan eRf1 wild type dengan eRF3. Namun demikian
hasil deteksi dari studi interaksi in vitro sulit terdeteksi secara kuantitatif.
Untuk dapat mengkuantisasi pita-pita eRF3 hasil studi interaksi in vitro
diperlukan antibody anti eRF3.

b. Manfaat Western Blot

- Untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan

kemampuannya untuk berikatan dengan antiobodi yang spesifik.

- Dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein

Berdasarkan penguraian aplikasi teknik western blot, salah satu

manfaat yang telah diperoleh dari analisis western blot ini yaitu konstruksi
antibody anti eRF3 telah dilakukan meskipun antiboi belum
terkarakterisasi dengan baik. Sehingga dilakukanlah analisis western blot
dengan cara mengukur tingkat spesifitas dan sensitivitas antibody anti
eRF3 terhadap protein eRF3. Spesifitas antibody ditentukan berdasarkan
kemampuan antibody ini dalam mengenali epitope protein eRF3 dari
berbagai protein yang terdapat pada crude extract ragi, sedangkan
sensitifitasnya ditentukan melalui variasi jumlah antigen (eRF3) yang
berinteraksi dengan antibody tersebut.

c. Keuntungan Teknik Blot

 - Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan
lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel
atau matriks

- Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan

- Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll

dapat lebih singkat

- Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan

sebelum dianalisis

- Dapat dibuat banyak replica pola tersebut untuk memungkinkan banyak

metode analisis yang dipakai

G. Kesimpulan

Berdasarkan pembahasan yang sudah diuraikan, maka dapat ditarik beberapa

kesimpulan antara lain :

1. Western Blot adalah proses pemindahan hasil protein gel dari gel hasil
elektroforesis ke membrane dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel
jaringan. Immunoblot menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein
asli.

2. Prinsip kerja western blot adalah yaitu mendeteksi protein spesifik pada sampel
jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan
protein tersebut berikatan dengan antibody.

3. Langkah kerja dalam analisis western blot dapat dilakukan dalam beberapa
tahapan yaitu (1) tahap elektroforesis, (2) tahap elektrotransfer, (3) tahap deteksi.

4. Salah satu aplikasi dari teknik western blot yang dapat dilakukan adalah mengenai
spesifitas dan sensitivitas antibody anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisiae.

5. Adapun manfaat dari western blot secara umum yaitu (1) untuk mengidentifikasi
dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan
antibody yang spesifik, (2) dapat memberikan informasi tentang ukuran dari
protein.
H. Daftar Pustaka

Atwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, j.L. Stirling dan F. Vella (Ed).
2006. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Reviside Edition.
Oxford. University Press.

Hermanto, S. 2007. Spesifitas dan Sensitifitas Antibodi Anti eRF3 Ragi

Saccharomyces cerevisiae. Jurnal Valensi, 1(1), 30-36.

Santoso. 2008. Protein dan Enzim. Yogyakarta: Yayasan Farmasi Indonesia.

Davidson. 2000. Western Blot Procedure.

http://www.bio.davidson.edu/course/genomics/method/westernblot.html. Diakses
pada tanggal 15 Mei 2023.