Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Blot Barat
 blotting Barat

• Western blot adalah teknik analitik yang digunakan untuk

mendeteksi protein spesifik dalam sampel homogenat atau
ekstrak jaringan tertentu.
• Immunoblotting: karena antibodi digunakan untuk mendeteksi
antigennya secara spesifik
• Western blot untuk Protein Dikembangkan oleh George Stark
menggunakan antibodi untuk menemukan Protein
 blotting Barat
• Western blotting didasarkan pada pembangunan kompleks antibodi-
protein melalui pengikatan spesifik antibodi terhadap protein yang
diimobilisasi pada membran.

• Kemudian mendeteksi antibodi yang terikat melalui beberapa metode

deteksi
 Alur kerja Western blotting
• Sampelpersiapan
• elektroforesis gel
• Transfer
• Pemblokiran & pemeriksaan Antibodi
• Deteksi
• Analisis
 Persiapan sampel
• Protein dari semua sumber dapat digunakan untuk western blotting seperti
dari sel tunggal, seluruh jaringan, matriks ekstraseluler, cairan biologis.
• Protein dapat diekstraksi dari sampel dalam tiga langkah berbeda:
• Lisis sel:Metode fisik (ultra sonikasi, homogenisasi, dll.)
Metode kimia (penggunaan deterjen)
Metode biologis (pencernaan enzimatik)
• Isolasi protein dari komponen seluler lainnya:
Sentrifugasi, DNase, dan buffer lisis lainnya digunakan untuk menghilangkan
organel sel, asam nukleat, polisakarida, dll.
• Pemurnian protein:
Elektroforesis Gel
• SDS-HALAMAN, elektroforesis gel natrium dodesil sulfat
poliakrilamida
 Elektroforesis Gel
• PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) terutama digunakan untuk
pemisahan partikel protein.
• SDS ditambahkan ke gel dan running buffer untuk mendenaturasi
molekul protein yang akan memastikan bahwa protein Anda dipisahkan
hanya berdasarkan ukuran dan bukan pada struktur tiga dimensi.
• Penanda berat molekul digunakan untuk menentukan ukuran protein
yang dijalankan dalam gel. Penanda terdiri dari berbagai protein
dengan ukuran yang diketahui.
• Karena protein tidak langsung terlihat dalam gel, gel harus diwarnai.
Protein biasanya diwarnai dengan pewarna seperti Blue, Silver stain,
atau Deep Purple.
LDK(sodium dodecyl sulfate)
adalah detergen (sabun) yang
dapat melarutkan molekul
hidrofobik tetapi juga bermuatan
negatif (sulfatMAKAN) melekat
padanya.
Elektroforesis SDS-PAGE Proses Pemuatan Sampel
 Pemindahan Protein
• Protein dipindahkan dari gel ke membran pendukung padat seperti
nitroselulosa atau polivinilidena difluorida (PVDF).
• Protein yang ditransfer dari gel diimobilisasi yang memungkinkan
untuk mendeteksi protein pada membran menggunakan antibodi
spesifik.
• Electro-blotting terutama digunakan yang menggunakan medan listrik
untuk menarik protein dari gel ke membran PVDF atau nitroselulosa.
• Protein bergerak dari dalam gel ke membran sambil mempertahankan
organisasi yang mereka miliki di dalam gel
 Pemblokiran & Probing Antibodi
• Western blotting melibatkan imobilisasi biomolekul pada membran
dan memblokir ruang yang belum ditempati oleh protein.

• Karena pengikatan antibodi non-spesifik ke membran mengurangi

spesifisitas dan sensitivitas pengujian.

• Dua kelas utama bahan penghambat (protein dan deterjen non-ionik)

biasanya digunakan untuk western blotting.
 Pemeriksaan Antibodi
• Protokol western blotting biasanya menggunakan antibodi primer
yang tidak berlabel yang diarahkan pada protein target dan antibodi
sekunder yang diberi label yang diarahkan pada wilayah konstan dari
antibodi primer.

• Antibodi sekunder berfungsi tidak hanya sebagai pembawa label

tetapi juga merupakan mekanisme untuk memperkuat sinyal yang
dipancarkan karena antibodi sekunder paling sering bersifat poliklonal
dan dapat mengikat antibodi primer pada epitop yang berbeda secara
bersamaan.
 Pemeriksaan Antibodi
• Alkaline phosphatase (AP) dan horseradish peroxidase (HRP) adalah
dua enzim yang paling umum digunakan untuk deteksi protein
menggunakan substrat kromogenik.
• Probe antibodi lain yang digunakan untuk deteksi protein adalah:
• Fluorofor
• Antibodi sekunder terbiotinilasi
• Radioisotop.
 Deteksi
• Sistem deteksi yang berbeda digunakan dalam western blotting
berdasarkan deteksi fluoresensi, kromogenik, atau radio-isotop.

• Metode deteksi enzimatik membutuhkan penambahan substrat yang

memancarkan cahaya saat bereaksi dengan enzim yang terkonjugasi ke
antibodi sekunder.

• Deteksi berbasis fluoresensi membutuhkan eksitasi fluorofor

menggunakan sumber cahaya dengan panjang gelombang tertentu
yang menyebabkan emisi cahaya.
Chemiluminescence Deteksi berbasis fluoresensi
 Analisis
• Deteksi sinyal, baik menggunakan film
sinar-X, pemindai, atau pencitra
berbasis kamera charge-coupled device
(CCD), menghasilkan gambar yang
mengandung pita protein yang terlihat.
• keberadaan dan jumlah protein yang
diinginkan diperkirakan dengan analisis
visual, dan ukurannya dapat ditentukan
dengan membandingkan penanda berat
molekul yang diketahui
Protein Penanda

Hasil Analisa Western Blot Visualisasi Hasil

dengan UV-Transiluminator
 Aplikasi Western Blotting
• Diagnosis HIV dengan ELISA melibatkan teknik western blotting.
• Teknik western blotting juga digunakan untuk mendeteksi beberapa
bentuk Penyakit Lyme.
• Teknik western blotting digunakan dalam tes definitif untuk BSE.
• Tes konfirmasi untuk Hepatitis-B melibatkan teknik western blotting.
• Tes western blotting digunakan dalam analisis Biomarker seperti
hormon, faktor pertumbuhan dan sitokin.
• Teknik ini juga digunakan dalam studi ekspresi gen.
 Keterbatasan Western Blotting
• Proses yang sangat halus dan memakan waktu. Ketidakseimbangan
satu menit di setiap tingkat prosedur dapat merusak hasil seluruh
proses.
• Menyebabkan kesalahan dalam band atau tidak ada band karena
transfer tidak mencukupi.
• Teknik terlatih diperlukan untuk teknik ini.
• Ketersediaan antibodi primer sangat penting.
• Itu hanya tes Semi-Kuantitatif. Hanya perkiraan dan tidak tepat
• pengukuran berat molekul protein dimungkinkan.