REVEALING IDENTITIES OF BACTERIA

Metode identifikasi bakteri

1. Morfologi mikroskopik- Pewarnaan Gram, bentuk, susunan,
pergerakan
2. Morfologi makroskopik tampilan koloni, pergerakan
3. Karakteristik biokimia/fisiologi aerobik, anaerobik,
kemampuan fotosintesis, pertumbuhan pada media selektif
4. Analisis kimia adanya peptida dan lipid di membran sel
5. Phage Typing identifikasi phage yang dapat menginfeksi
bakteri
6. Analisis serologis antibodi yang dihasilkan untuk melawan
bakteri tertentu
7. Patogenitas penyakit apa saja yang disebabkan infeksi
bakteri
8. Genetic & molecular analysis
G + C base composition
DNA analysis using genetic probes
Nucleic acid sequencing & rRNA analysis

2
Metode klinis yang sering digunakan untuk
identifikasi dan diagnosa :
1. Gram Stain (cell wall)
2. Acid Fast Stain (cell wall)
3. Biochemical Tests (cell macromolecules)
4. Serology & Latex Agglutination (surface Ag)
5. Western Blot (cell proteins)
6. ELISA (cell proteins, CHOs)
7. Plasmid Fingerprinting (plasmid DNA)
8. Nucleic Acid Hybridization (DNA, RNA)
9. Polymerase Chain Reaction (PCR) (DNA)
10. Electrophoresis (PAGE)
Table 4.6a
Table 4.6b
Fiksasi untuk keperluan pengecatan
Pewarnaan Gram
Berdasarkan
komposisi penyusun
dinding sel dan
ketebalan
peptidoglikan
Gram positive cell
wall
Gram negative cell
wall
Pewarnaan Gram
 Karakteristik Pertumbuhan
Identifikasi dengan menumbuhkan kultur
murni bakteri di media padat dan cair
Karakteristik yang diamati : reaksi enzimatik,
morfologi koloni, faktor fisika, kimia, dan
biologi yang mempengaruhi pertumbuhan
koloni
 Karakteristik Morfologi
Isolasi koloni dan pewarnaan Gram
 Acid fast Stain
Also called Ziehl_Neelsen stain
Used for :
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium leprae
Nocardia species
Actinomyces species
Cryptosporidium species
 CELL WALL OF ACID-FAST BACTERIA

Mycobacterium tuberculosis, Corynbacteria diptheriae,

and Norcardia asteroides tersusun atas lipid pada
dinding selnya ( mycolic acid, lipoarabinomanan,
arabinogalactan)
These bacteria respond poorly to the Gram stain. They
resist the action of acid alcohol due to their complex
lipids (acid-fastness )
The complex glycolipid allows M. tuberculosis to
survive the degradative effects of the phagolysosomes
in unactivated macrophages
They also render the bacterium difficult to study by
molecular biology techniques
 Acid Fast Stain
Red dye basic
carbolfuchsin is the
principal stain
Background is
counterstained with
methylene blue
Stain based on the
mycolic (glycolipid) acid
content of the cell wall
Mycobacterium species is
stained red, while
background is stained
blue
 Pewarnaan Lain
Capsule stain with
India ink
Endospore stain
with Schaeffer-
Fulton stain
Flagella stain with
carbolfuchsin dye
Giemsa stain for
protozoan
pathogens
 Serology
Tes serologi untuk mengetahui antigen yang
ada di suatu bakteri
Menggunakan serangkaian antibodi tertentu
Menghasilkan serotipe
 Phage typing
Phage typing to testing which bacteriophage
(bacterial viruses) will attack the bacteria. This
produces a phage type
 Antibiogram
Untuk mengetahui resistensi bakteri terhadap antibiotik,
dengan antibiotic sensitive test
Dengan cara menempatkan cakram antibiotik di agar yang
telah diinokulasi bakteri
Bakteri tidak akan tumbuh di sekitar cakram antibiotik
Diameter zona inhibisi yang terbentuk di sekitar cakram
antibiotik menunjukkan tingkat sensivitas bakteri terhadap
antibiotik tertentu
Antibiogram merupakan histogram yang menunjukkan range
dan sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tertentu
Dapat digunakan untuk identifikasi bakteri
Antibiogram
Microtiter plate for bacterial ID and
antibiotic sensitivities
Entero tube carry 12 biochemical tests
for ID of gram negatives
 Southern Blot Technique
Metode untuk mengekstrak DNA secara kimia dan
kemudian memotong DNA menjadi fragmen dengan
enzim spesifik (endonuceases).
Fragmen yang dihasilkan dapat dipisahkan dengan
electrophoresis
DNA fragmen kemudian dipindahkan pada kertas
asetat untuk proses blotting
This is called a Southern Blot technique.
Northern Blot
 Specific Single Tests
Ikatan antigen dengan antibodi monoklonal pada bakteri
dapat dideteksi dengan penambahan enzim yang memicu
perubahan warna (colorimetric assay)
Disebut juga Enzyme Linked Immuno Assays
or ELISA tests.
To save the time needed for incubation it is possible to look
for pieces of DNA by multiplying a minute amount of bacterial
DNA using a PCR (polymer Chain Reaction) technique.

A specific piece of DNA can be detected by an ELISA test

attached to a gene probe.
ELISA Procedure
ELISA Readings
ELISA application
 Western Blot
meliputi:
gel electrophoresis
electroblotting dengan kertas nitrocellulose
Inkubasi dengan antigen-specific or
patients antisera
Inkubasi dengan enzyme-conjugated secondary
antibody dan substrat enzim untuk perubahan
wanadan identifikasi antigen
Digunakan untuk diagnosis HIV dan infeksi
mikroba lainnya
Prinsip kerja Western Blot
Western Blot / HIV Diagnosis
Immunofluorescence
 Immunofluorescence
Berdasarkan ikatan antigen antibodi
Semakin banyak ikatan antibodi, sinyal
fluorosens semakin meningkat
Cloning & Nucleic Acid Hybridization
for Bacterial ID

Teknik molekuler untuk

mengukur tingkat
kesamaan genetik
berdasarkan sekuens
Banyak digunakan dalam
menentukan phylogeny
and taxonomy.
Latex Agglutination E. coli O157
Gel Electrophoresis: Clinical Applications

Identifying source of
an infection
Home-Work Exercise
List organisms that may be associated with the following
conditions :
1. Bacteremia
2. Endocarditis
3. Meningitis
4. Pharyngitis
5. Pneumonia
6. Conjunctivitis
7. Sepsis
8. Gastroenteritis
9. Urinary Tract infections
10. Cellulitis
GROUP ASSIGNMENT
Topic presentation :
1.Uji Biokimia
2.PCR
3.ELISA
4.Uji agglutinasi