Materi 1 Pewarnaan

Apa tujuan pewarnaan?

• Untuk membuat / meningkatkan kontras
• Untuk meningkatkan visibilitas
• Untuk membedakan
• Untuk mengamati struktur / fitur tertentu

Teknik pewarnaan
• Pewarnaan sederhana
• Pewarnaan diferensial
• Pewarnaan struktural atau khusus

Pewarnaan sederhana
• Memanfaatkan sel bakteri bermuatan negatif
• Menggunakan pewarna chargede positif atau negatif
• Pewarna bermuatan positif akan menodai bakteri
• Pewarna bermuatan negatif akan menodai latar belakang

Pewarna bermuatan positif

• Metilen biru
• kristal violet
• karbolfuchsin

Pewarna bermuatan negative

• Picric acid
• Eosin
• Nigrosin

Pewarnaan diferensial
• Memanfaatkan komposisi dinding sel bakteri
• Menggunakan 2 langkah pewarnaan

Pewarnaan Gram yang dimodifikasi

• Modifikasi metode Brown-Brenn untuk bakteri Gram-positif dan Gram-negatif pada bagian
parafin
• Pewarnaan Gram-Twort
Pewarnaan untuk Mycobacteria
• sulit untuk dibuktikan dengan teknik Gram karena mereka memiliki kapsul yang
mengandung asam lemak rantai panjang (asam mikolat)
• Asam fenolat, dan sering kali panas, digunakan untuk mengurangi tegangan permukaan dan
meningkatkan porositas, sehingga memaksa pewarna menembus kapsul ini.
• Organisme ini tahan asam dan alkohol tetapi biasanya mudah diidentifikasi sebagai
kontaminan melalui penampilannya sebagai rumpun, atau floaters, di atas bidang fokus
mikroskopis dari bagian tersebut

Pewarnaan untuk Mycobacteria

• Pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN) untuk Mycobacterium bacilli (Kinyoun, 1915)
• Metode fluoresen untuk Mycobacterium bacilli (Kuper & Mei 1960)
• Metode Fite yang dimodifikasi untuk Mycobacterium leprae dan Nocardia

Pewarnaan struktural atau khusus

• Pewarnaan Endospore
• Pewarnaan Flagela
• Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan endospora
• Endospora adalah struktur yang diproduksi di dalam sel bakteri tertentu yang
memungkinkannya bertahan hidup dalam kondisi yang keras.
• Pewarnaan endospora menggunakan dua pewarnaan untuk membedakan endospora dari sisa
sel.
• Metode Schaeffer-Fulton (teknik pewarnaan endospora yang paling umum digunakan)
menggunakan panas untuk mendorong noda primer (malasit hijau) ke dalam endospora.
• Sel tersebut kemudian diwarnai dengan warna pink dengan safranin

Pewarnaan flagela
• Flagela (tunggal: flagel) adalah struktur seluler mirip ekor yang digunakan untuk bergerak
oleh beberapa bakteri, archaea, dan eukaryote
• Pewarnaan flagela mengental. flagela dengan terlebih dahulu mengoleskan mordan
(umumnya asam tanat, tetapi kadang-kadang kalium tawas), yang melapisi flagela; kemudian
spesimen diwarnai dengan pararosaniline (paling umum) atau fuchsin dasar

Pewarnaan kapsul
• Kapsul atau polisakarida tidak menyerap sebagian besar pewarna dasar
• Cara terbaik adalah menodainya secara negative

Teknik untuk bakteri penting lainnya

• Metode kresil violet asetat untuk spesies Helicobacter
• Metode Gimenez untuk Helicobacter pylori (Gimenez, 1964; McMullen et al., 1987)
• Toluidine biru dalam buffer Sorenson untuk Helicobacter
• Metode Warthin-Starry untuk spirochetes (Warthin & Starry , 1920)
• Metode Modifed Steiner untuk bakteri flamentous dan nonflamentous (Steiner & Steiner,
1944; modifed Swisher, 1987)
Pewarnaan Jamur

Pewarnaan Lactophenol Cotton Blue (LPCB)

Dinding sel spora jamur terbuat dari bahan yang merupakan komponen larutan Lactophenol
Cotton Blue untuk identifikasi. Sisa jamur akan memberi jamur tampilan berwarna biru pada
spora dan struktur jamur, seperti hifa.
• Fenol: Digunakan sebagai disinfektan dengan membunuh organisme hidup
• Asam laktat: Untuk melindungi struktur jamur
• Cotton blue: Untuk menyaring atau memberi warna pada chi tin pada dinding sel jamur dan
atau struktur jamur lainnya

Metode pewarnaan jamur lainnya

• Grocott methenamine (hexamine) - perak untuk jamur dan spesies Pneumocystis (Gomori,
1946; Grocott, 1955; Swisher & Chandler, 1982)
• Metode PAS McManus untuk glikogen dan dinding sel jamur

Immunostaining adalah setiap penggunaan metode berbasis antibodi untuk mendeteksi

protein spesifik dalam sampel.

Teknik Aseptik
Aseptik = tanpa mikroorganisme
Menghilangkan mikroorganisme yang ada
Mencegah kontaminasi pada kultur murni
Mencegah penyebaran mikroorganisme
Segala sesuatu dalam kondisi steril sebelum memulai kerja

INOKULASI : Metode pemindahan biakan mikroorganisme

INOKULUM : Bahan yang diinokulasikan pada medium
ISOLASI: Memisahkan / mengambil mikroorganisme dari alam dan menumbuhkan nya pada
medium

Syarat mutlak sebelum melakukan identifikasi mikroorganisme

• Mikroba dalam keadaan murni/tunggal
• Mikroba dalam keadaan hidup/ viable
• Media pertumbuhan tersedia dan sesuai
• Metode untuk menumbuhkan diketahui
• Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba difahami
• Ada kontrol biakan

Identifikasi Mikroorganisme
• Karakteristik morfologi dan biokimia
• Karakteristik berbasis DNA
Karakteristik morfologi
• Morfologi koloni
• Morfologi sel
identifikasi jamur
1. Jika hifa diamati, tentukan struktur hifa.
Apakah mereka:
1. Septate atau aseptate
2. Percabangan (jika ya, pada sudut apa) atau tidak bercabang?
3. Berpigmen atau tidak berpigmen
4. Lebar rata atau tidak rata
5. Terdiri dari arthroconidia atau pseudohyphae
6. Tentukan struktur dan penurunan tubuh buah
2. Visualisasikan jenis konidasi:
1. Ukuran dan bentuk spora atau konidia
2. Ukuran, bentuk, dan susunan spora
3. Cari keberadaan struktur diagnostik khusus: piknidia,
cleistothecia, sel Hulle
3. Jika hanya sel ragi yang diamati:
1. Perhatikan ukuran, bentuk, dan susunannya.
2. Perhatikan ada atau tidaknya kapsul.
3. Tentukan jenis bastokonidiasi- apakah sel anak tunggal atau multipel?
Sistem Analytical Profile Index (API)
• Strip test kit untuk mengidentifikasi mikroorganisme (bakteri dan ragi)
• Cepat dan relevan secara klinis

RNA ribosom pada prokariotik dan eukariotik

16s rRNA
• digunakan untuk mengidentifikasi bakteri
• Menggunakan pasangan primer yang berbeda
• 16s rRNA juga ditemukan di mitokondria dan kloroplas tetapi dengan ukuran yang berbeda
18s rRNA
• digunakan untuk mengidentifikasi eukariot
• Menggunakan pasangan primer yang berbeda
Pengetikan urutan multilokus (MLST)
• adalah teknik dalam biologi molekuler untuk mengetik beberapa lokus.
• Prosedur ini mengkarakterisasi isolat spesies mikroba menggunakan urutan DNA dari
fragmen internal beberapa gen rumah tangga.
• Untuk membedakan spesies yang berkerabat dekat atau antar strain
NGS
• Urutan Amplicon atau urutan metagenomik
• Tidak perlu memurnikan isolate
analisis mikrobiologi
Standard Sanitasi
TPC
• Coliform
• MPN
Standard Higienis
• Keberadaan mikroba patogen
• Bakteri enterik
• Bakteri pada makanan kaleng
• Listeria

Angka Kemungkinan Terbanyak (MPN)

Penentuan Spesies berdasarkan urutan 16s rDNA

BLAST (APLIKASI) menemukan daerah kemiripan antara sekuens biologis. Program ini
membandingkan urutan nukleotida atau protein dengan database urutan dan menghitung
signifikansi statistic

PHYLUM CRENARCHAEOTA
Sebagian besar crenarchaeote yang telah diisolasi sangat termofilik, dan banyak yang
bergantung pada asidofil dan sulfur. Belerang dapat digunakan baik sebagai akseptor elektron
dalam respirasi anaerobik atau sebagai sumber elektron oleh litotrof. Hampir semuanya
anaerob ketat. Mereka tumbuh di air yang dipanaskan secara geotermal atau tanah yang
mengandung unsur belerang.

LIPID MEMBRANE DAN PEPTIDOGLYCAN DARI BAKTERI DAN ARCHAEA

PHYLUM EURYARCHAEOTA
Metanogen
• Metanogen adalah anaerob ketat yang memperoleh energi dengan mengubah CO2, H2,
format, metanol, asetat, dan senyawa lain menjadi metana atau metana dan CO2. Mereka
autotrofik saat tumbuh di H2 dan CO2.
Halobakteri
• Ini benar-benar tergantung pada konsentrasi tinggi NaCl. Prokariota ini membutuhkan
setidaknya 1,5 M NaCl (sekitar 8%, wt / vol), dan biasanya memiliki pertumbuhan optimum
sekitar 3 sampai 4 M NaCl (17 sampai 23%). Mereka akan tumbuh pada konsentrasi garam
mendekati kejenuhan (sekitar 36%).
Termoplasma adalah termoasidofil yang tidak memiliki dinding sel.
Sangat Termofilik S0 - Metabolizer
• benar-benar anaerobik dan dapat mereduksi belerang menjadi sulfida. Mereka motil oleh
flagela dan memiliki suhu pertumbuhan optimal sekitar 88 hingga 100 ° C.
Area Pengurang Sulfat
• Dapat mengekstraksi elektron dari berbagai donor elektron (misalnya, H2, laktat, glukosa)
dan mereduksi sulfat, sulfit, atau tiosulfat menjadi sulfida. Unsur belerang tidak digunakan
sebagai akseptor

Keanekaragaman Bakteri
The Deinococci dan Non-Proteobacteria Gram-Negatives

Proteobacteria

Positif G + C Gram rendah

Positif G + C Gram tinggi

KLASIFIKASI VIRUS
Berdasarkan ciri fenotipik:
• Morfologi
• jenis asam nukleat
• cara replikasi
• organisme inang
• jenis penyakit yang ditimbulkannya

Sistem klasifikasi:
• Sistem Komite Internasional Taksonomi Virus (ICTV)
• Sistem klasifikasi Baltimore
• Sistem nomenklatur binomial Carl Linnaeus

• Grup I: Phaginae (menyerang bakteri)

• Kelompok II: Phytophaginae (menyerang tumbuhan)
• Grup III: Zoophaginae (menyerang hewan)

International committee on taxonomy of viruses (ictv)

nama spesies harus berisi sesedikit mungkin kata sementara tetap berbeda
tidak boleh hanya berisi kata virus dan nama inang.
Nama spesies sering kali berbentuk virus [Penyakit],

KLASIFIKASI BALTIMORE
menempatkan virus ke dalam salah satu dari tujuh kelompok tergantung pada kombinasi
asam nukleatnya (DNA atau RNA), terdampar (untai tunggal atau untai ganda), indra, dan
metode replikasi.
Pengelompokan:
I: virus dsDNA (mis.Adenovirus, Herpesvirus, Poxviruses)
II: virus ssDNA (+ untai atau "sense") DNA (mis. Parvoviruses)
III: virus dsRNA (misalnya Reovirus)
IV: (+) ssRNA virus (+ strand or sense) RNA (misalnya Coronaviruses, Picornaviruses,
Togaviruses)
V: (-) virus ssRNA (- untai atau antisense) RNA (misalnya Orthomyxoviruses,
Rhabdoviruses)
VI: virus ssRNA-RT (+ untai atau rasa) RNA dengan perantara DNA dalam siklus hidup
(misalnya Retrovirus)
VII: DNA virus dsDNA-RT dengan perantara RNA dalam siklus hidup (misalnya
Hepadnaviruses)