PEWARNAAN

GRAM
BAKTERIOLOGI

OLEH : TRINADILLA
PENGERTIAN PEWARNAAN GRAM
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang
paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam
proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: zat
pewarna kristal violet, sodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna
tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan
metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri
Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal
violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.
Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah
dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan
zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan
warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
TUJUAN PEWARNAAN

Tujuan dari pewarnaan Gram adalah : Memeriksa

spesimen yang diperoleh dari cairan tubuh atau
biopsi jaringan, dengan hasil yang didapatkan lebih
cepat dibandingkan kultur bakteri. Mengetahui
kualitas spesimen sehingga dapat menentukan
kelayakan spesimen untuk dikultur.
  PRINSIP
PEWARNAAN
SEDERHANA  PEWARNAAN
  KOMPOSISI
PEWARNAAN SEDERHANA
SEDERHANA
  PROSEDUR
PEWARNAAN
SEDERHANA
  INTERPRETASI
PEWARNAAN
SEDERHANA
PRINSIP PEWARNAAN SEDERHANA
  Sesuai dengan penamaannya, pewarnaan sederhana hanya menggunakan
pewarna tunggal / satu jenis warna untuk mewarnai dinding sel bakteri.
  Tujuan dari melakukan pewarnaan sederhana adalah untuk
menggambarkan secara jelas morfologi sel bakteri, meliputi bentuk,
ukuran dan susuran sel.
  Sel bakteri memiliki berbagai macam bentuk sel seperti bulat (coccus),
batang (bacil), oval dan filamen. Memiliki ukuran kecil hingga besar dan
memiliki struktur fili dan flagella.
  Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan sederhana memiliki sifat
basa / alkalin.
  Menurut ilmu kimia, sifat basa memiliki muatan positif (+) sehingga
akan mudah bereaksi / berikatan dengan dinding sel bakteri yang
bermuatan negatif (-).
  Jenis zat warna yang digunakan dalam melakukan pewarnaan sederhana
adalah Methylene Blue, Crystal Violet dan Carbol Fuchsin.
Methylene Blue Methylene Blue 3 g,
Potasium Hidroksida
10% 1 ml, Etanol 95% KOMPOSISI
300 ml
PEWARNAAN
SEDERHANA
Kristal Violet Kristal Violet 2 g, Etil
Alkohol 95% 20 ml,
Amonium Oksalat 0,8  
Pewarna sederhana hanya
menggunakan 1 jenis pewarna
g, Akuades Steril 100
ml  yang dapat dipilih dari ke-3 jenis
pewarna disamping.

Carbol Fuchsin Fuchsin dasar 0,3 g,

etanol 95% 10 ml,
Fenol 5 ml, Akuades
steril 95 ml 
Prosedur Pewarnaan Sederhana

1. Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai. 2. Secara aseptis ambil 1
ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan kaca preparat yang telah
ditetesi akuades steril. 
3. Ratakan hingga tidak ada ulasan yang menumpuk.
 4. Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen
sebanyak 3 kali. Fiksasi berfungsi untuk mematikan bakteri namun tetap
mempertahankan bentuk dan komponen sel. 
5. Teteskan pewarna sederhana diseluruh permukaan ulasan dengan memilih
salah satu pewarna sesuai dengan kebutuhan. Tunggu pewarna agar meresap
pada dinding sel bakteri. Methylene Blue (60 detik), Crystal Violet (30 detik)
dan Carbol Fuchsin (20 detik). 
6. Bilas pewarna dengan akuades steril dan tunggu hingga cukup kering atau
dapat diserap dengan tissue. 
7. Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan sampel
siap diamati dibawah mikroskop.
Interpretasi Pewarnaan Sederhana
Jenis Warna Sel
Pewarna Bakteri

Methylene Biru
Blue

Kristal Violet Ungu

Carbol Merah
Fuchsin
Gram Positif
Gram-positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna kristal
violet sewaktu proses pewarnaan
Gram sehingga akan berwarna biru
atau ungu di bawah
mikroskop.Bakteri gram positif
seperti Staphylococcus aureus
(bakteri patogen yang umum pada
manusia) hanya mempunyai
membran plasma tunggal yang
dikelilingi dinding sel tebal berupa
peptidoglikan.[2] Sekitar 90 persen
dari dinding sel tersebut tersusun
atas peptidoglikan sedangkan
sisanya berupa molekul lain
bernama asam teikhoat.
 Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang
tidak mempertahankan zat warna kristal

Gram Negatif violet sewaktu proses pewarnaan Gram

sehingga akan berwarna merah bila diamati
dengan mikroskop. bakteri gram negatif
(seperti E. coli) memiliki sistem membran
ganda di mana membran pasmanya
diselimuti oleh membran luar permeabel.
Bakteri ini mempunyai dinding sel yang
lebih kompleks, berlapis tiga yaitu lapisan
luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah
berupa lipopolisakarida dan lapisan dalam
berupa peptidoglikan. Banyak spesies
bakteri gram-negatif yang bersifat patogen,
yang berarti mereka berbahaya bagi
organisme inang.[4]Sifat patogen ini
umumnya berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel gram-negatif,
terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal
juga dengan LPS atau endotoksin).
 KARAKTERISTIK GRAM POSITIF DAN NEGATIF
Karakteristik GRAM positif
Homogen dan tebal (20-80 nm) serta
sebagian besar tersusun dari
peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam
Dinding sel teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.
Gram negatif
Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran
dam dan luar, serta adanya membran luar
(7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid,
protein, dan lipopolisakarida

Bulat, batang atau filamen Bulat, oval, batang lurus atau melingkar
seprti tand koma, heliks atau filamen;
beberapa mempunyai selubung atau kapsul
Bentuk sel

Pembelahan biner Pembelahan biner, kadang-kadang

Reproduksi
pertunasan
kemoorganoheterotrof Fototrof, kemolitoautotrof, atau
Metabolisme kemoorganoheterotrof

Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat
flagelanya adalah petritrikus bervariasi-polar,lopotrikus (lophtrichous),
Motilitas (petritrichous) petritrikus (petritrichous).

Anggota tubuh (apendase) Biasanya tidak memiliki apendase Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Beberapa grup dapat membentuk endspora Tidak dapat membentuk endospora
Endospora
Pewarnaan
Differensial adalah
teknik pewarnaan yang
dilakukan untuk
mengetahui perbedaan
antara sel-sel dari tiap-
tiap mikroba.
PEWARNAAN
Pewarnaan differensial
menggunakan dua DIFFERENSIAL
pewarna atau lebih.
2. JAMUR PEWARNAAN BTA
1. MIKROBAKTERI
Pewarnaan Ziehl-Neelsen juga
dapat membantu dalam Bakteri anggota genus Mycobacterium
membedakan dan adalah bakteri yang tumbuh lambat,
mengidentifikasi jamur. Hasil berbentuk batang kecil yang sedikit
pewarnaan ZIehl-Neelsen melengkung atau lurus, dan dianggap
bervariasi karena banyak dinding sebagai Gram-positif. Beberapa jenis
sel jamur tidak tahan asam.Contoh mikobakteria membentuk benang atau
dari jamur tahan asam yang filamen. Beberapa mikobakteria adalah
biasanya diwarnai dengan makhluk saprofit yang hidup bebas,
pewarnaan Ziehl-Neelsen adalah tetapi banyak yang merupakan patogen
Histoplasma (HP). yang menyebabkan penyakit pada
hewan dan manusia. Mycobacterium
bovis menyebabkan TBC pada sapi.
Karena TBC dapat menular ke
manusia, susu dipasteurisasi untuk
membunuh semua bakteri yang ada
3. SEJARAH
Pada tahun 1882 Robert Koch menemukan penyebab penyakit
mematikan tuberkulosis. Segera setelah penemuan Koch, Paul Ehrlich
mengembangkan pewarnaan untuk Mycobacterium tuberculosis, yang
disebut pewarnaan tawas hematoksilin. Franz Ziehl kemudian
mengubah teknik pewarnaan Ehrlich dengan menambahkan larutan
asam dalam alkohol sebagai mordan. Friedrich Neelsen
mempertahankan penggunaan mordan, tetapi mengubah pewarna
utama menjadi karbol fuchsin. Modifikasi Ziehl dan Neelsen secara
bersama-sama telah mengembangkan metode pewarnaan Ziehl-
Neelsen. Pewarnaan bakteri tahan asam lainnya dikembangkan oleh
Joseph Kinyoun dengan menggunakan teknik pewarnaan Ziehl-
Neelsen tetapi tanpa prosedur pemanasan. Pewarnaan baru dari
Kinyoun ini dinamai pewarnaan Kinyoun atau disebut juga "Ziehl-
Neelsen dingin".
4. MEKANISME PEWARNAAN
Awalnya, pemberian karbol fuchsin akan mewarnai semua sel bakteri, baik
BTA (tahan asam) maupun BTTA (tidak tahan asam). Pemanasan bertujuan
untuk membuka lapisan lilin dan asam mikolat yang ada pada dinding sel
BTA. Ketika dicelupkan ke asam-alkohol, hanya BTA yang
mempertahankan zat warna. Sementara BTTA melepas pewarna dan jadi
tak berwarna. Untuk mewarnai bakteri BTTA, diberikan pewarna
tambahan seperti malasit hijau atau metilena biru, sehingga bakteri BTA
akan berwarna merah, sementara BTTA tampak biru atau hijau ketika
diamati dengan mikroskop.
PEWARNAAN FLAGELLA
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

PEWARNAAN GRANULA
Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang terdiri atas
volutin,granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan
pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di
dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan
mikroskopik. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila
diwarnai dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang
digunakan. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru
metilen,granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua. Pada spesies kuman tertentu,
granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Disamping
material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi sel-kepingan-kepingan
kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran khusus ini yang
rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena
akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat
disebut juga kolektif volutin. 

Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 

1. Metode Albert’s 
2. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose).
THANK
YOU