ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

MUSYIRNA RAHMAH NST, M,Si

STIFAR RIAU
ISOLASI MIKROBA

• merupakan rangkaian proses pemisahan mikroorganisme agar

didapatkan kultur murni (isolat).
• Pemisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya di media
buatan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni
• Tujuan Pemisahan mikroorganisme diperlukan
– untuk mengetahui jenis, mempelajari kultural, morfologi,
fisiologi, karakteristik mikroorganisme tersebut.
Identifikasi mikroba

• merupakan upaya untuk mengetahui nama suatu mikroba

dalam suatu kelompok tertentu berdasarkan karakteristik
persamaan dan perbedaan yang dimiliki oleh masing-masing
makhluk hidup
• Proses identifikasi dilakukan dengan cara pengamatan
terhadap organisme tersebut baik secara :
– Morfologi
– Fisiologi.
Pengamatan secara morfologi

• Meliputi :
• bentuk koloni,
• struktur koloni,
• bentuk sel,
• ukuran sel,
• bentuk flagel pewarnaan endospore dari bakteri.
• Pengamatan morfologi dapat dilakukan secara
– makroskopis
– mikroskopis.
Pengamatan morfologi bakteri secara makroskopis

• Mengamati :
– bentuk koloni yaitu berbentuk bulat, tak berbentuk,
seperti akar, dan filamen.
– Tepi koloni bakteri yang terdiri dari bentuk tepi koloni
utuh, halus, berombak dangkal, dan berombak dalam.
– Elevasi koloni bakteri terdiri dari elevasi rata, cembung
rendah dan cembung tinggi dengan permukaan koloni
halus atau kasar
Pengamatan morfologi bakteri secara mikroskopis

• mengamati pewarnaan sederhana untuk melihat bentuk sel

bakteri, ukuran bakteri, pewarnaan endospora, dan
pewarnaan Gram
Pengamatan secara fisiologi

– yaitu meliputi uji biokimia.

– Identifikasi bakteri juga dapat dilakukan dengan cara
indentifikasi secara genetik, yaitu dengan metode PCR
(polymerase chain reaction)
• yaitu dengan mengekstrak DNA bakteri kemudian di perbanyak
dan dielekroforesis.Hasil elektroforesis akan menunjukan
karakteristik dari DNA yang dimiliki
• Pengamatan fisiologi bakteri dilakukan dengan cara uji biokimia.
• Uji biokimia yang biasa dilakukan yaitu
– Pengujian fermentasi karbohidrat (untuk mengamati kemampuan
bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat),
– Pengujian Metyl red (untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghasilkan asam),
– Pengujian Vogest Paskauer (untuk mengetahui kemampuan bakteri
dalam menghasilkan acetumetyl carbinol dan fermentasi glukosa),
– Pengujian indol (untuk mengathui kemampuan bakteri dalam
menghasilkan indol),
Uji biokimia

– Pengujian oksidase (untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

memproduksi enzim oksidase),
– Pengujian H2S (untuk mengatahui kemampuan bakteri dalam
memproduksi H2S),
– Pengujian amylase (untuk mengetahui kemampuan bakteri
menghidrolisis amilum),
– Pengujian katalase (untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghasilkan enzim katalase
– Pengujian protease (untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghidrolisis protein)
SUMBER MIKROBA

• Sumber alami :
• tanah, air, udara, tanaman/hewan, limbah, dll

• Lembaga koleksi kultur

TAHAPAN IDENTIFIKASI MIKROBA

• ISOLASI Untuk memperoleh kultur murni

• SELEKSI Untuk memperoleh galur dengan kinerja terbaik
• IDENTIFIKASI  menggunakan metode yang sesuai Untuk
mengetahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut
ISOLASI

• Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari

campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah
• Sebelum mengisolasi, harus diketahui : -
– mikroba apa yang akan diisolasi
– habitat  menentukan sampel apa yang akan diambil dari
alam , lokasi
– media apa yang akan digunakan
METODE PENGAMBILAN SAMPEL

• Sampel berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu, dll) :

– Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril
– Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril
• Sampel berupa cairan atau semi cair (air, lumpur, dll) :
– Diambil menggunakan pipet steril
– Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung polipropilen
steril
• Sampel segera dibawa ke laboratorium (bila jarak jauh, gunakan es batu
pada wadah penyimpanan) Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan
pada suhu dingin (kulkas)
TEKNIK ISOLASI KULTUR MURNI

• 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-

plate)
• 2. Penuangan (Pour-plate)
• 3. Kultur yang Diperkaya (Enrichment Culture)
• 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
• 5. Isolasi Sel Tunggal
 teknik isolasi sel tunggal  silahkan baca buku
literatur lain.
Teknik Pewarnaan Gram
Prinsip Pewarnaan Gram

• teknik pewarnaan Gram mampu membedakan bakteri

menjadi 2 kelompok utama, yaitu Gram positif dan Gram
negatif.
• Kedua kelompok bakteri dibedakan berdasarkan perbedaan
struktur membran dinding sel.
Bakteri Gram Positif Berwarna Ungu

• Bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal

sehingga kuat mengikat pewarna primer (Kristal Violet), setelah diikuti
penambahan larutan mordant berupa lugol Iodine.
• Kristal Violet dan Lugols Iodine akan membentuk ikatan komplek dengan
peptidoglikan.
• Ketika sudah terbentuk ikatan komplek antara Kristal Violet dan Lugols Iodine,
pewarna akan sulit diluruhkan dengan larutan dokolirizer seperti alkohol
asam. Peptidoglikan akan tetap mengikat warna kristal violet ( warna biru tua
atau ungu)
• Ketika ditambah warna pembanding seperti Safranin, peptidoglikan masih
mempertahankan warna primer.
Bakteri Gram Negatif Berwarna Merah

• Bakteri Gram negatif tidak mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal
pada dinding sel nya.
• Saat diaplikasikannya pewarna Kristal Violet dan Lugols Iodine tidak dapat
membentuk ikatan kuat dengan peptidoglikan.
• Ikatan yang terbentuk antara pewarna dengan peptidoglikan secara mudah
diluruhkan atau terbilas oleh larutan dekolorizer
• Alkohol asam akan mendehidrasi dinding sel dan membentuk sebuah pori-pori
atau lubang pada membran sel, sehingga akan menghilangkan pewarna primer.
• Pewarna pembanding berupa Safranin mewarnai ulang peptidoglikan yang tidak
mengikat lagi pewarna Kristal Violet, sehingga bakteri akan tampak berwarna
merah.
Komposisi Pewarna Gram

Pewarna Primer Kristal Violet 2 g, Etil Alkohol 95% 20 ml,

(Kristal violet) Amonium Oksalat 0,8 g, Akuades Steril 100 ml 

Larutan Mordant Potasium Iodid 2 g, Kristal Iodin 1 g, Akuades Steril

(Lugols iodine) 100 ml

Larutan Dekolorizer
Etanol 50 ml, Aseton 20 ml
(Etil Alkohol)

Pewarna Sekunder Safranin 4 g, Etanol 95% 200 ml, Akuades steril

(Safranin) 800 ml
Prosedur Pewarnaan Gram

• Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai.

• Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan
kaca preparat.
• Ratakan degan menggunakan akuades steril menggunakan jarum ose.
• Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen
sebanyak 3 kali. Fiksasi digunakan untuk mematikan bakteri namun tetap
mempertahankan bentuk dan komponen sel.
• Teteskan peawarna primer (Kristal Violet) secara merata pada ulasan
bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
• Bilas pewarna primer menggunakan akuades steril dan tunggu
hingga cukup kering.
• Teteskan larutan mordant (Lugols Iodine) pada permukaan
ulasan bakteri, dan tunggu selama 60 detik.
• Bilas larutan mordant menggunakan akuades steril dan
tunggu hingga cukup kering.
• Teteskan larutan dekolorizer (Alkohol Asam) secara merata pada ulasan
bakteri hingga permukaan ulasan tampak jernih.
• Bilas larutan dekolorizer menggunakan akuades steril dan tunggu
hingga cukup kering.
• Teteskan pewarna sekunder (Safranin) secara merata pada ulasan
bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
• Bilas pewarna sekunder menggunakan akuades steril dan tunggu hingga
cukup kering.
• Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan
sampel siap diamati dibawah mikroskop.
 Interpretasi Hasil Pewarnaan Gram

Jenis Bakteri Warna Gram

Gram Positif Ungu atau biru tua
Gram Negatif Merah atau merah jambu
 Kesalahan dalam Prosedur Pewarnaan Gram
• Pemanasan berlebihan saat fiksasi
• Preparat terlalu tebal
• Larutan kristal violet konsentrasi rendah
• Pencucian berlebihan dengan air (sebaiknya tidak lebih dari 5 detik)
• Iodin yang kurang. Semakin rendah konsentrasi iodin yang digunakan,
semakin mudah dekolorisasi terjadi
• Dekolorisasi yang terlalu lama dengan etanol
• Counterstaining terlalu banyak dan terlalu lama
Pewarnaan Sederhana

• hanya menggunakan pewarna tunggal / satu jenis warna untuk

mewarnai dinding sel bakteri.
• Tujuan dari melakukan pewarnaan sederhana adalah untuk
menggambarkan secara jelas morfologi sel bakteri, meliputi bentuk,
ukuran dan susunan sel.
• Sel bakteri memiliki berbagai macam bentuk sel seperti bulat
(coccus), batang (bacil), oval dan filamen. Memiliki ukuran kecil
hingga besar dan memiliki struktur fili dan flagella.
• Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan sederhana memiliki
sifat basa / alkalin.
• Menurut ilmu kimia, sifat basa memiliki muatan positif (+) sehingga
akan mudah bereaksi / berikatan dengan dinding sel bakteri yang
bermuatan negatif (-). 
• Jenis zat warna yang digunakan dalam melakukan pewarnaan
sederhana adalah Methylene Blue, Crystal Violet dan Carbol
Fuchsin. 
Komposisi Pewarna Sederhana

• Pewarna sederhana hanya menggunakan 1 jenis pewarna

yang dapat dipilih dari ke-3 jenis pewarna dibawah ini:

Methylene Blue Methylene Blue 3 g, Potasium Hidroksida 10% 1 ml, Etanol

95% 300 ml
Kristal Violet Kristal Violet 2 g, Etil Alkohol 95% 20 ml, Amonium Oksalat
0,8 g, Akuades Steril 100 ml
Carbol FuchsinFuchsin dasar 0,3 g, etanol 95% 10 ml, Fenol 5 ml, Akuades
steril 95 ml
Prosedur Pewarnaan Gram

• Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai.

• Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada
permukaan kaca preparat yang telah ditetesi akuades steril.
• Ratakan hingga tidak ada ulasan yang menumpuk.
• Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api
bunsen sebanyak 3 kali.
• Fiksasi berfungsi untuk mematikan bakteri namun tetap
mempertahankan bentuk dan komponen sel.
• Teteskan pewarna sederhana diseluruh permukaan ulasan dengan
memilih salah satu pewarna sesuai dengan kebutuhan.
• Tunggu pewarna agar meresap pada dinding sel bakteri. Methylene
Blue (60 detik), Crystal Violet (30 detik) dan Carbol Fuchsin (20
detik). 
• Bilas pewarna dengan akuades steril dan tunggu hingga cukup
kering atau dapat diserap dengan tissue.
• Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan
sampel siap diamati dibawah mikroskop.
Interpretasi Hasil Pewarna Sederhana
• Baca lebih lanjut tentang Fiksasi dan Pembuatan
apusan