2.

3 Pengecatan

Kebanyakan penyelidikan atau pemeriksaan tentang bentuk dan susunan sel mikroorganisma
yang tidak mengandung kromatofora (sel atau kelompok sel yang mengandung pigmen dan dapat
memantulkan cahaya), dilakukan dengan pembuatan preparat yang sudah diberi warna.
Pengertian sederhana dari pengecatan atau staining adalah pewarnaan mikroba mikroba dengan
sesuatu cat (dye) yang mengutamakan struktur tertentu saja, misalnya, bagian-bagian sel. Yang
dimaksud dengan cat (dye), adalah senyawa-senyawa organik tertentu yang salah satu ionnya
bersifat kromofor. Berdasarkan atas adanya kromofor ini, cat dapat dibedakan menjadi cat yang
bersifar asam, basa dan netral. Cat yang bersifat asam kromofornya bersifat anion, misalnya
eosin, sedang cat yang basis kromofornya adalah kation, misalnya methylene blue. Pada
umumnya cat yang asam mudah bereaks dengan komponen-komponen sel yang bersifat basa
sedangkan cat yang bersifat basa umumnya mudah bereaksi dengan komponen-komponen
bakteri yang bersifat asam. Cat yang netral (neutral dye) merupakan garam-garam kompleks dari
cat yang bersifat asam dan basa, misalnya eosinat. Proses pewarnaan melibatkan reaksi-reaksi
pertukaran ion-ion antara cat dengan bahan aktif yang terdapat di permukaan atau di dalam sel
yang diwarnai. Sebagaimana telah kita ketahui bahwa mikroorganisma uniseluler sepert bakteri
yang diamati di bawah mikroskop, kelihatan transparan dan tidak berwarna sehingga bentuk-
bentuk seperti koma, batang maupun spira sukar diamati dengan jelas. Agar dapat diamati
dengan jelas dan memudahkan kita mempelajarinya, maka mikroorganisma tersebut diwarna
terlebih dahulu.

a.Pengecatan sederhana

Pengecatan sederhana berarti bahwa hanya satu macam cat (pewarna, dye) yang digunakan dan
satu langkah urutan kerja saja dilakukan untuk mewarnai sel-sel mikroorganisma yang akan di
amati. Pengecatan ini berbeda dengan pengecatan khusus yang menggunakan lebih dari satu
macam cat dengan urutan langkah langkah kerja secara bertahap. Pengecatan sederhana ini
bermaksud untuk mewarnai sesuatu jenis mikroorganisma, misalnya bakteri, sehingga bentuk
dan susunan selnya jelas kelihatan pada pemeriksaan di bawah mikroskop. Catnya dibubuhkan di
atas kaca obyek yang sudah difiksasi (membuat sel-sel bakteri tersebut melekat pada gelas objek)
terlebih dahulu. Kemudian dicuci, dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop. Kadang-
kadang ditambahkan mordant (Gram's iodine) agar warna cat lebih intensif. Cat-cat sederhana
yang sering digunakan di laboratorium adalah methylene blue, carbolfuchsin, gentian violet dan
safranin. Untuk memudahkan pemahaman keterangan di atas perhatikan gambar prosedur kerja
berikut ini.

b. Pengecatan Diferensial

Prosedur pewarnaan dalam pengecatan ini memungkinkan pengamatan yang jelas perbedaan
antara sel-sel bakteri atau bagian-bagian sel bakteri. Oleh karena inilah teknik pewarnaan ini
disebut pengecatan diferensial. Selain untuk melihat bentuk bakteri, pengecatan ini juga
bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat bakteri terhadap cat dan untuk mengetahui bagian-bagian
sel bakteri yang tidak dapat diamati dengan pengecatan sederhana. Kalau kita mau mengamati
adanya lemak, kita menggunakan cat khusus yang dapat mewarnai zat lemak, misalnya "sudan
black." Pengecatan diferensial dapat dibedakan menjadi: Pengecatan Gram, Pengecatan Ziehl
Neelsen, Pengecatan Flagella, Pengecatan Endospora, Pengecatan Negatif

1. Pengecatan Gram

Salah satu teknik pengecatan yang paling penting dan banyak di gunakan di dalam bidang
mikrobiologi adalah pengecatan Gram. Cara pengecatan ini dikembangkan oleh seorang ahli
bakteriologi bernama Hans Christian Gram pada tahun 1884. Dalam proses pengecatan ini
bakteri yang sudah difiksasi diperlakukan berturut-turut dengan : crystal violet, larutan lodium,
alkohol, safranin atau counterstain (cat lawan) lain yang sesuai.

Bakteria yang diwarnai dengan pengecatan ini dibedakan dalam 2 kelompok yaitu: Golongan
bakteria Gram positif, yaitu golongan bakteri yang tetap berwarna violet tua kalaupun sudah
dicuci dengan alkohol dan golongan bakteri yang tidak tetap violet berubah warnanya menjadi
merah dinamakan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif yang kehilangan warna violet tua
karena tercuci oleh alkohol akan ke lihatan kabur. Inilah yang menjadi sebab mengapa digunakan
cat safranin yang menyebabkan preparat menjadi merah muda (pink). Cat seperti safranin ini
yang digunakan untuk memberi warna kontras disebut counterstain (cat lawan). Bakteri golongan
Gram positif tetap berwarna violet tua (purple), karena tidak dipengaruhi oleh safranin.

Mengapa dalam pengecatan Gram ini beberapa bakteri ada yang berwarna violet dan ada yang
berwarna merah? Untuk menjawab pertanyaan ini, kiranya perlu dijelaskan tentang susunan
struktur dan komposisi dinding sel bakteria. Bakteria yang termasuk golongan Gram positif
mempunyai struktur dan komposisi dinding sel yang berbeda dengan bakteri golongan Gram
negatif. Dinding sel bakteria golongan Gram negatif umumnya lebih tipis dari dinding sel bakteri
golongan Gram positif. Yang pertama mengandung persentasi lipid (lemak) yang lebih banyak
dari pada yang dimiliki dinding sel bakteri golongan Gram positif. Selama perlakuan dengan
alkohol, ternyata lemak ini tertarik ke luar sehingga memperbanyak porositas atau menaikkan
permeabilitas dinding sel. Akibatnya crystal violet-iodine (CV-I) tertarik ke luar se hingga
bakterinya kehilangan warna. Pada bakteri golongan Gram positif yang dinding selnya lebih
sedikit mengandung lemak, akan mengalami dehidrasi karena perlakuan dengan alkohol,
sehingga ukuran pori-pori dan permeabilitas dinding sel menjadi berkurang dan CV-I tidak
tercuci. Inilah yang menjadi sebab bakteri golongan Gram positif tetap berwarna ungu tua
(purple-violet). Keterangan lain yang agak sama dengan di atas, juga didasarkan atas perbedaan
antara permeabilitas dinding sel antara kedua golongan bakteri tersebut. Dalam bakteri golongan
Gram positif, CV-I "terperangkap" pada dinding sel dan perlakuan dengan etanol dianggap dapat
menyebabkan pengecilan diameter pori-pori dinding sel yang mengandung peptidoglycan.
Dinding sel bakteri golongan Gram negatif mengandung jumlah peptidoglycan yang lebih sedikit
dan pori porinya cukup besar kalaupun sudah diperlakukan (dicuci) dengan etanol dan CV-I
tercuci. Lebih lanjut apabila sel-sel bakteri Gram positif di perlakukan dengan lysozyme, maka
bentuk yang tertinggal adalah protoplas akan tercat oleh CV-I, akan tetapi mudah tercuci oleh
alkohol. Pengecatan Gram ini merupakan teknik pengecatan yang paling penting dalam bidang
mikrobiologi kedokteran.

Pengecatan Gram sangat mantap digunakan untuk mewarnai bakteri-bakteri yang sedang
mengalami pertumbuhan, Dalam beberapa hal reaksi pengecatan Gram dengan bakteri dapat
memberi informasi yang berharga dalam bidang pengobatan penyakit tertentu. Contoh: Bakteri
Gram positif cenderung terbunuh oleh penisilin dan obat-obat "sulfonamide", sedangkan bakteri
Gram negatif tahan terhadap obat-obat ini, namun lebih peka terhadap streptomisin, chloram
phenicol dan tetracyclin. Jadi identifikasi suatu bakteri dengan pengecatan Gram dapat
membantu dalam menentukan obat-obat yang paling efektif terhadap suatu penyakit. Pengecatan
Gram ini penting untuk pemeriksaan bakteri-bakteri patogen, bakteri tanah dan bakteri yang
penyebab penyakit tumbuhan Bakteri-bakteri yang patogen terhadap tumbuhan termasuk bakteri
Gram negatif, sedangkan bakteri patogen pada manusia tergolong dalam bakteri Gram positif
dan bakteri Gram negatif. Selain ini masih ada hasil hasil lain yang telah diketahui bahwa
kuman-kuman patogen pada manusia dan hewan yang bersifat Gram +, biasanya mudah dibasmi
dengan penisilin. Lingkungan ataupun faktor-faktor luar dapat mem pengaruhi hasil-hasil
pengecatan Gram, misalnya, pengaruh pH. Jika pH diubah, maka bakteri Gram + akan dapat
berubah menjadi Gram - atau sebaliknya. Cara pengecatan yang salah juga dapat menghasilkan
bakteri Gram + menjadi Gram negatif.

Pengecatan Gram dapat dilakukan sebagai berikut:

Bahan dan alat:

- kultur bakteri - Gram stain reagents

- Hucker's crystal violet - Gram's iodine
- Safranin - Etil alkohol 95%
- kaca obyek - rak pengecatan
- ose (loop) - air keran
- kertas penghisap - suspensi bakteri
Prosedur:

1. Ose bemata disentuhkan pada nyala api lampu spiritus atau lampu Bunsen sampai pijar
sebanyak 3 atau 4 x. Diambil suspensi bakteri sebanyak 1 ose dan digoreskan pada kaca obyek
seluas kira-kira 1 cm².

2. Tunggu sampai kering dan difiksasi.

3. Kaca obyek diletakkan di atas staining rack dan ditetesi dengan cat crystal violet, dibiarkan
selama 1 menit.

4. Cuci crystal violet dengan air mengalir dan setelah agak kering.

5. Tetesi dengan iodium (Lugol's iodine solution).

6. Setelah 1 menit, dicuci (iodiumnya) dengan air mengalir dan gunakan kertas isap untuk
mengambil air yang berlebihan tetapi harus dijaga jangan sampai kering betul.
7. Diberi sedikit demi sedikit etanol 95% untuk menghilangkan warna sehingga kaca obyek
kelihatan tidak berwarna. Setelah kira-kira 15 detik...

8. Cuci kaca obyek dengan air keran kemudian dikeringkan.

9. Dicat dengan safranin (sebagai counterstain).

10. Preparat segera dicuci dengan air keran dan dikeringkan.

11. Periksa dengan menggunakan mikroskop dengan menggunakan minyak imersi. Kalau sel-sel
bakteri berwarna merah, maka bakteri tersebut adalah Gram negatif sedang bakteri yang ber
warna "blue purple" termasuk golongan bakteri Gram positif.

Contoh-contoh bakteri yang termasuk golongan bakteri Graf positif dan Gram negatif adalah
sebagai berikut :

- Bakteri Gram positif :

Species-species dari genus Bacillus : Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus,
Bacillus polymyxa.
Semua anggota genus Clostridium
Semua Streptococci terutama yang terdapat di dalam darah, serum atau media yang
mengandung bahan-bahan tersebut.
Semua micrococci dan staphylococci
Pneumococcus
Corynebacterium diphteriae
Yeast
- Bakteri Gram Negatif :
Enterobacteriaceae termasuk Salmonella typhi, centeriae, Escherechia colii, dan lain-lain.
Vibro colerae
Semua genus Neisseria
Brucella abortus
Semua genus Haemophilus dan Bordetella Semua genus Pasteurella dan Yersinia
Genus Bakteriodes.
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Bakteri merupakan salah satu jenis mikroorganisme yang tidak bisa dilihat oleh mata
telanjang. Bakteri memiliki bentuk bermacam-macam yaitu, bulat, batang dan spiral.
Sebagaimana telah kita ketahui bahwa mikroorganisma uniseluler sepert bakteri yang
diamati di bawah mikroskop, kelihatan transparan dan tidak berwarna sehingga bentuk-
bentuk seperti koma, batang maupun spira sukar diamati dengan jelas. Agar dapat diamati
dengan jelas dan memudahkan kita mempelajarinya, maka mikroorganisma tersebut
diwarna terlebih dahulu. Pengertian sederhana dari pengecatan atau staining adalah
pewarnaan mikroba mikroba dengan sesuatu cat (dye) yang mengutamakan struktur
tertentu saja, misalnya, bagian-bagian sel.
3.2 Saran
Tentunya makalah ini masih memiliki banyak kekurangan baik dari segi penulisan
ataupun isi. Kami berharap dikedepan hari semakin banyak orang yang bisa mempelajari
dan memperbaiki makalah kami.