Teori dasar

Pewarnaan gram adalah jenis pewarnaan yang penting dan paling umum digunakan untuk
membedakan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pertama kali
diperkenalkan oleh Christian Gram pada tahun 1884. (Lay,1994)
Dalam melakukan pewarnaaan gram terdapat beberapa macam pewarna yaitu sebagai berikut
:

1. Kristal violet Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan
sel mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna ungu.komposisi dari kristal violet adalah Kristal
violet 2 gram,Alkohol 95% 20 ml,Aquadest 80 ml,Amonium oksalat 0,8 gram.
Hal ini sesuai dengan pernyataan Entjaang (2003), bahwa kristal violet merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroba.
2. Iodin merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikro-organisme target. Pemberian iodin pada
pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
Cara pembuatan larutan ini yaitu, Pertama iodium dihaluskan dengan kalium iodide,
kemudian dicampurkan dengan aquades hingga rata. Lalu dimasukkan kedalam
botol. Hal ini sesuai pernyataan Purwoko (2010), yang menyatakan bahwa larutan
iod merupakan pewarna mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian iodin pada pewarnaan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh mikroba
3. Pewarnaan gram dengan penambahan safranin menyebabkan sel bakteri berwarna
merah. Fungsi safranin yaitu sebagai pembeda (kontras) terhadap warna kristal
violet-iodium. Komposisi dari safranin adalah Safranin 0,25 gram, Alkohol 95% 10
ml, Aquades 90 ml. Hal ini sesuai dengan pernyataan Entjaang (2003), bahwa
safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder untuk memberi warna
merah jambu pada sel bakteri gram negatif dan memberikan warna pada
mikroorganisme non target.
4. Alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Alkohol memberikan dampak pada saat pewarnaan gram,
jika saat bakteri dibilas dengan alkohol , alkohol akan melarutkan lapisan lipid pada
dinding sel. Bakteri gram negatif yang dinding selnya tersusun dari lapisan lipid yang
tebal maka akan larut dalam alkohol. Hal ini sesuai dengan pernyataan Purwoko
(2010), yang menyatakan bahwa alkohol merupakan solven organik yang berfungsi
untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme).
5. Larutan aquades berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel mikroba. Aquades merupakan air hasil destilasi atau penyulingan. Aquades
dapat dikatakan sebagai air murni atau H2O Hal ini sesuai dengan pernyataan
Purwoko (2010), yang menyatakan bahwa alkohol merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme

Prinsip Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram bekerja sebagai akibat dari efek pencucian alkohol yang berbeda pada
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan
mengalami dehidrasi ketika diberi larutan alkohol sehingga kristal warna violet akan terjebak
di dalam dinding sel. Sementara itu, bakteri gram negatif memiliki membran luar yang
tersusun atas lipid atau lemak yang disebut dengan lipopolisakarida
Lapisan lipid akan larut jika diberi alkohol sehingga kristal warna violet pada dinding selnya
juga akan ikut larut dan luntur. Kemudian setelah diberi zat warna merah muda (safarin),
bakteri gram negatif yang kehilangan zat warna violet akan berubah menjadi bewarna merah
muda. Sedangkan pada bakteri gram positif yang masih memiliki zat warna violet tidak akan
berpengaruh terhadap safarin sehingga akan tetap bewarna ungu.

Klasifikasi Bakteri berdasarkan Karakteristik Dinding Sel

Dinding sel bakteri adalah salah satu materi unik yang membedakan bakteri dengan
organisme lain yang ada di bumi. Dari dinding selnya ini kita bisa mengklasifikasikan 2 jenis
bakteri, yaitu bakteri gram positif , bakteri gram negatif dan bakteri tak berdinding sel.
Sistem klasifikasi bakteri ini pertama kali dilakukan oleh Hans Christian Gram.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif adalah kelompok bakteri yang dinding selnya memiliki lapisan
peptidoglikan tebal dan mampu menyerap warna violet dari lingkungan. Contoh bakteri
gram negatif antara lain:

1. Azotobakteria adalah bakteri tanah yang dapat memfiksasi nitrogen dari udara dalam
kondisi aerobik.
2. Bakteri ungu adalah bakteri yang bersifat fotoautotrof dan tidak menghasilkan
oksigen.
3. Cyanobacteria adalah bakteri fotosintetik yang biasanya hidup di ekosistem danau,
kolam renang, dan ekosistem perairan tenang. Beberapa spesies bakteri ini diketahui
memfiksasi nitrogen dari udara.
4. Enterobakteria adalah bakteri pengurai yang hidup pada organisme mati seperti
tumbuhan atau tubuh hewan yang membusuk.
5. Klamidia adalah golongan bakteri yang dinding selnya tidak mengandung
peptidoglikan. Bakteri ini umumnya bertindak sebagai parasit atau hidup dengan
mengambil energi dari inangnya. Contoh bakteri gram negatid ini adalah Chlamydia
trachomati, penyebab penyakit kebutaan pada manusia dan hewan.
6. Mixobakteria adalah bakteri yang mengeluarkan lendir untuk bergerak dengan cara
meluncur. Bakteri ini umumnya tidak memiliki flagel.
7. Pseudomonas adalah bakteri bersifat heterotrof yang dapat menghasilkan pigmen non
fotosintetik. Pseudomonas termasuk bakteri yang merugikan karena dapat
menyebabkan beberapa penyakit pada tumbuhan, hewan, dan manusia.
8. Rhizobium adalah bakteri yang hidup bersimbiosis dengan bintil akar tumbuhan
kacang-kacangan (legum). Bakteri ini mampu memfiksasi nitrogen di udara dan
sering dimanfaatkan dalam usaha bioteknologi bidang pertanian.
9. Riketsia adalah bakteri kecil berbentuk batang (coccus) yang bersifat sebagai patogen
pada manusia dan hewan.
10. Spiroseta adalah bakteri dengan dinding sel fleksibel, berbentuk spiral, dan bergerak
dengan filamen aksial (struktur yang mirip flagela). Contoh bakteri bakteri gram
negatif ini adalahTreponema pallidum.
11. Vibrio adalah bakteri yang hidup di ekosistem air laut sebagai bioluminesensi. Contoh
bakteri ini adalah Vibrio cholerae.
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
 lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
 Peka terhadap streptomisin

b.BakteriGramPositif
Bakteri gram positif adalah kelompok bakteri yang dinding selnya memiliki lapisan
peptidoglikan tipis dan mampu menyerap warna merah dari lingkungan. Contoh bakteri
gram positif antara lain:

1. Aktinobakteria adalah bakteri dengan sifat agak mirip fungi dan pada petidoglikan
dinding selnya tidak diselimuti selaput ini. Contoh bakteri ini adalah genus
Streptomyces penghasil antibiotik streptomisin.
2. Bakteri asam laktat adalah bakteri yang menghasilkan asam laktat melalui proses
fermentasi gula. Secara alami, bakteri ini hidup di mulut manusia.
3. Klostridium adalah bakteri penyebab tetanus (Clotridium tetani) dan penyakit
botulinum (Clostridum botulinum).
4. Mikobakteria adalah bakteri dengan dinding sel mengandung lilin. Contoh bakteri
gram positif ini misalnya Mycobacterium tuberculosis penyakit Tubercolosis (TBC).
5. Stafilokokus adalah bakteri patogen penyebab turunnya kekebalan tubuh manusia.
Biasanya mereka hidup di kulit dan hidung.
6. Streptokukos adalah bakteri yang hidup di mulut dan saluran pencernaan hewan dan
manusia.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
 Tidak peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
 c. Bakteri Tidak Berdinding Sel
Tidak banyak bakteri yang masuk ke dalam golongan ini. Kendati begitu, salah satu
contohnya bisa kita lihat pada Mikoplasma. Bakteri ini adalah bakteri parasit yang
biasanya hidup di tanah atau saluran manusia tapi tidak menyebabkan timbulnya
penyakit

perbedaan Bakteri gram positif Bakteri gram negatif

Dinding sel:Lapisan Lebih tebal (20- Lebih tipis11-22 %
peptidoglikanKadar 80nm)1-4 %
lipid
Resistensi terhadap Tidak larut Larut
alkali(1 % KOH)
Kepekaan terhadap Lebih peka Kurang peka
Iodium
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bentuk sel Bulat, batang atau Bulat, ova, batang lurus
filamen atau melingkar seperti
tanda koma, heliks atau
filament, beberapa
mempunyai selubung
atau kapsul
Reproduksi Pembelahan biner Pembelahan biner,
kadang-kadang
pertunasan
Metabolisme Kemoorganoheterotrof Fototrof,
kemolitoautotrof, atau
kemoorganoheterotrof
Resistensi terhadap Lebih tahan Lebih peka
tellurit
Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan
asam
Kepekaan terhadap Lebih peka Kurang peka
penisilin
Kepekaan terhadap Tidak peka Peka
streptomisin
Motilitas Kebanyakan nonmotil, Motil atau nonmotil.
bila motil tipe Bentuk flagella dapat
flagelanya adalah bervariasi
petritikus
(petritrichous)
Anggota tubuh Biasanya tidak Dapat memiliki pili,
memiliki apandase fimbriae, tangkai
Endospora Beberapa grup dapat Tidak dapat membentuk
membentuk endospora endospore
Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat
basa
Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana
Ketahanan terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk
basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada
coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus
pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung
(Dwidjoseputro,1998 )

Macam-Macam Pewarnaan

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1. Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum
digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan
pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat
morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan
adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam

Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan
gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
 yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang
tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies
tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki
sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga
menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa,
seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

 Zat warna utama (violet kristal)

 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
 Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif
tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel
organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel.
Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang
tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. (Pelzar et al (2005)

Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi
tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus
misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna
dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun
seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).

Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri

penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-
Neelsen.

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel,

pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan
teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling
banyak digunakan.

Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu
dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus
dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .

Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna
pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. (Lay,1994)
 Daftar pustaka

Lay, Bibiana.. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta

Hadioetomo, R. S. 1991. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Erlangga. Jakarta
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
Pelczar, M. J. dan Chan, E. C. S. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi 1.Jakarta : Penerbit
Universitas IndonesiaDwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan .Malang
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.