Nama : Gabriel C.

J Tarigan

Nim : 213308010027

Dosen : Edy Fachrial

TUGAS

1. Jelaskan prosedur Gram staining ?

Gram Staining adalah salah satu teknik pewarnaan yang penting untuk identifikasi
bakteri. Teknik pewarnaan ini termasuk differential stain atau pewarnaan
bertingkat yang menggunakan lebih dari satu jenis pewarna. Mula-mula apusan sel
bakteri yang telah difiksasi dengan panas diberi pewarna kristal violet, kemudian
ditambahkan iodin yang berfungsi sebagai mordant (zat kimia yang berfungsi
mempertahankan zat pewarna). Tahap selanjutnya adalah dekolorisasi
menggunakan alkohol 95% dan pewarnaan kembali atau counterstaining dengan
safranin.

Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri Gram-

positif dan bakteri Gram-negatif. Di bawah mikroskop bakteri Gram-positif akan
tampak berwarna ungu-violet sedangkan Gram-negatif akan terlihat berwarna pink.
Contoh dari bakteri Gram-positif adalah Bacillus, Clostridium, Lactobacillus,
Staphylococcus, dan Streptococcus. Sementara itu Escherichia coli, Salmonella,
Shigella, Pseudomonas, dan Moraxella merupakan contoh dari bakteri Gram-
negatif. Dari gambar di samping dapat dilihat bakteri berbentuk batang merupakan
Gram-negatif sedangkan bakteri berbentuk coccus merupakan Gram-positif.

Teknik pewarnaan Gram didasarkan atas perbedaan struktur dinding sel kedua
jenis bakteri tersebut. Dinding sel bakteri Gram-positif hanya terdiri dari satu
lapisan tebal yang tersusun dari satu jenis molekul saja. Sementara itu Gram-
negatif memiliki dua lapis dinding sel, yaitu lapisan peptidoglikan yang relatif
lebih tipis dan membran luar. Dinding sel Gram-positif 90 % nya merupakan
peptidoglikan sedangkan hanya 10-20 % dinding sel bakteri Gram-negatif yang
tersusun atas peptidoglikan, sisanya merupakan polisakarida, lipid, dan protein
yang menyusun membran luar. Oleh karena itu membran luar disebut juga sebagai
lapisan lipopolisakarida (LPS).

Prosedur

Prosedur pewarnaan Gram terdiri dari persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan
pemeriksaan di bawah mikroskop.

Persiapan Apusan

Cara mempersiapkan apusan yang akan diwarnai adalah :

1. Sterilkan inoculating loop pada api bunsen hingga memerah, kemudian

tunggu dingin selama sekitar 30 detik. Jika loop masih panas saat spesimen
diambil, sel bakteri bisa rusak
2. Dengan menggunakan kaca objek (slide) bersih, letakkan spesimen di tengah
kaca objek. Jika spesimen diambil dari agar plate, beri 1 tetes air untuk
membuat suspensi terlebih dulu
3. Dengan menggunakan inoculating loop, apuskan spesimen di atas kaca
objek sampai didapatkan lapisan yang tipis, kemudian keringkan di udara
4. Panaskan kaca objek dengan melewatkannya di atas api bunsen sebanyak 2-
3 kali agar terfiksasi
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :
1. Tuangkan cairan pewarna kristal violet pada preparat secara merata, tunggu
selama 1 menit
 2. Miringkan preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir

3. Tuangkan cairan mordant pada preparat, tunggu selama 1 menit

4. Miringkan kembali preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir

5. Lakukan dekolorisasi dengan cara meneteskan cairan dekolorisasi sedikit

demi sedikit pada preparat hingga tidak ada zat warna yang mengalir keluar
dari preparat

6. Bilas preparat dengan air mengalir

7. Tuangkan counterstain (safranin) pada preparat, tunggu selama 30 detik

sampai 1 menit
8. Bilas preparat dengan air mengalir, kemudian keringkan preparat

9. Lakukan pengamatan preparat menggunakan mikroskop dengan perbesaran

100 kali, 400 kali, hingga 1000 kali

Pada akhir prosedur pewarnaan gram, dilakukan interpretasi dari preparat. Bakteri
Gram positif akan berwarna biru atau ungu, contohnya Staphylococcus
sp dan Streptococcus sp. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah
muda, contohnya E.coli dan Salmonella typhi. Fungi
seperti Candida dan Cryptococcus dapat juga diperoleh pada pemeriksaan Gram.

Beberapa jenis bakteri memiliki sifat Gram variabel, di mana dapat terlihat
campuran sel berwarna ungu dan merah muda. Genus
bakteri Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium,
dan Propionibacterium memiliki dinding sel yang rentan mengalami kerusakan
saat pembelahan sel, sehingga dapat memiliki tampilan Gram negatif.
Bakteri Bacillus, Butyrivibrio, dan Clostridium memiliki penurunan ketebalan
peptidoglikan dalam perkembangannya, sehingga beberapa sel akan terlihat Gram
negatif. Gardnella memiliki dinding sel Gram positif yang berbeda, sehingga
menyebabkan hasil pewarnaan menjadi Gram negatif atau Gram variabel.

2. Jelaskan hubungan antara membran sel atau dinding sel bakteri terhadap
hasil Gram staining

Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan metode pewarnaan gram menjadi 2

kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Pewarnaan
ini membedakan bakteri berdasarkan karakteristik fisik dan kimia dinding sel-nya.
Pewarnaan Gram meliputi 3 proses utama, yaitu pengecatan dengan kristal violet,
dekolorisasi (penghapusan warna) dengan etil alkohol atau aseton, kemudian
counterstaining atau pemberian pewarna kontras menggunaan air fukhsin. Pada
awal pengecatan, semua bakteri akan berwarna ungu, proses dekolorisasi dan
pemberian warna kontraslah yang membedakan antara kedua jenis bakteri ini.
Bakteri gram positif akan menunjukkan warna ungu karena memiliki lapisan
peptidoglikan tebal yang menahan kristal violet selama pengecatan gram.
Sedangkan pada bakteri gram negatif akan berwarna merah akibat tipisnya dinding
peptidoglikan sehingga kristal violet terbuang selama proses dekolorisasi dan
pemberian air fukhsin akan mengecat bakteri gram negatif menjadi merah. Bakteri
gram positif seperti Staphylococcus Aureus hanya mempunyai membran plasma
tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90 persen
dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa
molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif seperti E.
Coli memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh
membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa
peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.
Bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal tetapi tidak
memiliki membran luar. Sedangkan pada bakteri gram negatif, lapisan
perpustakaan peptidoglikan tipis dan memilki membran luar yang tersusun atas
Lipopolisakarida (LPS) dan protein.