LAPORAN PRAKTIKUM

IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF

BLOK VII JEJAS DAN RESPONS IMUN

TITO KARA LESMANA PUTRA M.

201610101146
B4

LABORATORIUM BIOLOGI KEDOKTERAN

BAGIAN BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS JEMBER 2021

 IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF

I. TUJUAN
1. Mengidentifikasi klasifikasi bakteri Gram positif dan Gram negatif dengan metode
pewarnaan Gram.
2. Menganalisis dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif.

II. PRINSIP
Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan /
pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan. Pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar dan
tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba
lainnya transparan atau semi transparan. Dengan pewarnaan, dapat dilihat struktur sel mikroba
lebih seksama. Fungsi pewarnaan adalah a) memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya
sehingga memberi kontras dan tampak lebih jelas, b) dapat untuk menunjukkan bagian-bagian
struktur sel, c) membedakan mikroba satu dengan yang lain.
Pewarnaan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pewarnaan. Hasil
pewarnaan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan
sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi
terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : a). mencegah mengkerutnya globula-globula protein
sel, b). merubah afnitas cat, c). mencegah terjadinya otolisis sel, d). dapat membunuh mikroba
secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya, e).
melekatkan bakteri di atas object glass dan f). membuat sel-sel lebih kuat/keras. Cara fiksasi yang
paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan membuat lapisan
suspensi/pulasan bakteri di atas object glass, kemudian dikeringanginkan dan dilakukan beberapa
kali di atas nyala lampu spiritus.
Pewarnaan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan termasuk
pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat Gram positif dan Gram
negatif. Dari segi pewarnaan, perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat
diamati dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh cat lawan
(safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya, yang mempunyai
afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak
mengikat cat utama secara kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai
oleh cat lawan. Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan Gram negatif tidak mutlak tegas dan
spesifik, tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam
pengecatan Gram.
Pewarnaan Gram sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini
didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan Gram dibagi
menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel
yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri Gram negatif mempunyai dinding sel tipis
yang berada di antara dua lapis membran sel.
Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu atau
kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal violet pada metode pewarnaan Gram. Pada uji
pewarnaan Gram tersebut, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu atau kristal violet, yang membuat bakteri Gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri berdasarkan
perbedaan struktur dinding selnya.

III. ALAT:
1. Object glass (glass microscope slide)
2. Kawat ose
3. Bunsen
4. Mikroskop cahaya
5. Masker dan sarung tangan, spidol, kertas label, kain lap / tissue / toilet paper, korek api.

IV. BAHAN
1. Kultur bakteri pada media padat.
2. Air steril
3. Crystal violet (Gram A)
4. Larutan iodine (Gram B)
5. Alkohol 96% (Gram C)51
6. Safranin (Gram D)
7. Minyak immersi
8. Kertas lensa
9. Ethyl alcohol 75%

V. PROSEDUR ( Video https://youtu.be/AX1GkN1HhfU )

1. Ambil slide dan bersihkan slide dengan ethyl alcohol 75% untuk menghindari kontaminasi
pada pewarnaan.
2. Tulis nama sampel (spesimen)
3. Teteskan air steril
4. Sterilkan loop kawat ose dengan cara membakar pada nyala api Bunsen sampai panas merah
membara
5. Ambil koloni bakteri mengunakan loop kawat ose
6. Pulaskan spesimen selapis tipis pada glass slide yang bersih, lalu biarkan kering
7. Fiksasi panas pulasan spesimen dengan cara melewatkan diatas nyala api bunsen 2 atau 3 kali

8. Cristal violet berwarna biru merupakan pewarna primer

9. Teteskan cristal violet dan tunggu selama 30 detik
10. Cuci slide dengan air steril sampai pewarna hilang
11. Teteskan gram iodine dan tunggu selama 1 menit
12. Cuci slide dgn air steril
13. Teteskan larutan decolorizer (etanol 95% ) sehingga mengalir di atas area pewarnaan sampai
tidak ada lagi warna yang keluar. Waktunya secepatnya sekitar 5-10 detik
14. Cuci slide dengan air steril
15. Teteskan counterstain safranin pada pulasan selama 1 menit
16. Cuci slide dengan air steril
17. Keringkan slide
18. Amati slide di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak
immersi.
52
VI. HASIL PENGAMATAN (Video https://youtu.be/AX1GkN1HhfU )

1. Morfologi sel bakteri (pilih sel bakteri dan beri tanda panah)

a.Bentuk : Bacillus

b.Susunan : Monobacillus

c.Warna : Ungu

d.Keadaan istimewa (jika ada): -

e.Diagnosis sementara : Bakteri gram positif

2. Morfologi sel bakteri (pilih sel bakteri dan beri tanda panah)

a.Bentuk : Coccobacillus

b.Susunan : Berderet membentuk rantai (streptobacillus)

c.Warna : Ungu

d.Keadaan istimewa (jika ada): -

e.Diagnosis sementara : Bakteri gram positif

3. Morfologi sel bakteri (pilih sel bakteri dan beri tanda panah)

a.Bentuk : Coccus

b.Susunan : Monococcus

c.Warna : Magenta/merah muda

d.Keadaan istimewa (jika ada): -

e.Diagnosis sementara : Bakteri gram negatif

4. Morfologi sel bakteri (pilih sel bakteri dan beri tanda panah)

a.Bentuk : Bacillus

b.Susunan : Palisade

c.Warna : Magenta/merah muda

d.Keadaan istimewa (jika ada): -

e.Diagnosis sementara : Bakteri gram negatif

VII. PEMBAHASAN

7.1 Prinsip pewarnaan bakteri gram positif dan gram negatif

Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan untuk membedakan jenis

bakteri berdasarkan sifat kimiawi dan fisik dinding sel yang berupa peptidoglikan.
Perbedaan struktur peptidoglikan pada dinding sel bakteri akan memberikan
perbedaan warna. Perbedaan ini akan mengklasifikasikan bakteri menjadi 2 kelompok
utama, yaitu kelompok bakteri Gram positif (+) dan Gram negatif (-).
Zat warna utama yang digunakan pada pewarnaan Gram ada 2 jenis yaitu
Crystal Violet dan Safranin. Crystal Violet akan memberi warna ungu dan safranin
 akan memberi warna merah. Ketika diaplikasikan bakteri Gram positif akan berwarna
ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah.
Metode pewarnaan ini ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang ahli
mikrobiologi Denmark yang bernama Hans Christian Gram untuk membedakan
bakteri Pneumococcus dan Klebsiella pneumoniae. Sehingga nama Gram diabadikan
menjadi nama teknik pewarnaan ini.

Prinsip pewarnaan
1. Teknik Aseptis
Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan
mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme
yang diinginkan.
2. Pewarnaan Diferensial
Memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.
Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan
bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam.
3. Ikatan Ion
Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.
4. Absorbsi
Proses pemisahan bahan dari suatu campuran gas dengan cara pengikatan
bahan tersebut pada permukaan absorben cair yang diikuti dengan pelarutan.
Kelarutan gas yang akan diserap dapat disebabkan hanya oleh gaya-gaya fisik
(pada absorpsi fisik) atau selain gaya tersebut juga oleh ikatan kimia (pada
absorpsi kimia).

A. BAKTERI GRAM POSITIF BERWARNA UNGU

• Bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga kuat
mengikat pewarna primer berupa Kristal Violet, setelah diikuti penambahan larutan
mordant berupa lugols Iodine.
• Kristal Violet dan Lugols Iodine akan membentuk ikatan komplek dengan peptidoglikan.

• Ketika sudah terbentuk ikatan komplek antara Kristal Violet dan Lugols Iodine, pewarna
akan sulit diluruhkan dengan larutan dokolirizer seperti alkohol asam. Peptidoglikan akan
tetap mengikat warna kristal violet dan meninggalkan warna biru tua atau ungu.

• Ketika ditambah warna pembanding seperti Safranin, peptidoglikan masih

mempertahankan warna primer.

B. BAKTERI GRAM NEGATIV BERWARNA MERAH

• Bakteri Gram negatif tidak mengandung ikatan lapisan peptidoglikan yang tebal pada
dinding sel nya.
• Saat diaplikasikannya pewarna Kristal Violet dan Lugols Iodine tidak dapat membentuk
ikatan kuat dengan peptidoglikan.

• Alkohol asam akan mendehidrasi dinding sel dan membentuk sebuah pori-pori atau
lubang pada membran sel, sehingga akan menghilangkan pewarna primer.

• Pewarna pembanding berupa Safranin mewarnai ulang peptidoglikan yang tidak mengikat
lagi pewarna Kristal Violet, sehingga bakteri akan tampak berwarna merah.

• Ikatan yang terbentuk antara pewarna dengan peptidoglikan secara mudah diluruhkan
atau terbilas oleh larutan dekolorizer

7.2 Perbedaan sel bakteri gram positif dangrram negatif.

A. Gram-negatif
Kelompok ini merupakan prokariot yang memiliki suatu profil dinding sel
(tipe Gram-negatif) kompleks yang terdiri dari satu membran luar dan satu
membran dalam, lapisan peptidoglikan yang tipis (yang mengandung asam
muramat yang terdapat pada semua peptidoglikan tapi sejumlah organisme tidak
memiliki bagian ini pada dinding selnya). Bakteri gram negatif merupakan bakteri
yang dinding selnya tidak dapat menyerap warna violet melainkan warna yang
merah. Lapisan peptidoglikan tersebut berada di periplasmik antara membran
plasma dengan membran luar.
Ciri-ciri khusus yang dimiliki adalah memiliki membran sitoplasma,
kurang rentang pada senyawa penisilin, dinding sel tipis dengan multilayer, tidak
resisten terhadap gangguan fisik, memiliki lemak yang berada di dinding sel.
Bentuk sel berupa bola, oval, batang lurus atau melengkung, memutar,atau
filamen; beberapa bentuk tersebut dapat berselubung atau berkapsul.

B. Gram-positif
Kelompok ini merupakan prokariot dengan profil dinding sel tipe gram
positif umumnya bereaksi terhadap pewarnaan gram, tetapi tidak selalu positif.
Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menyerap warna violet pada
dinding selnya dengan lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri gram positif
memiliki ciri khusus, yaitu memiliki membran sitoplasma lipid, lapisan
peptidoglikan yang tebal, beberapa bakteri memiliki flagela, memiliki kapsul
polisakarida, tidak peka dengan streptomysin, memiliki kemampuan membentuk
toksin yang biasa disebut dengan eksotoksin endotoksin, terdapat nutrisi yang
dibutuhkan lebih rum.
Bakteri ini terdapat yang bersifat positif maupun negatif. Sel berbentuk
bola, batang, atau filamen; batang dan filamen mungkin tidak bercabang, tetapi
beberapa memperlihatkan adanya percabangan. Reproduksi seluler umumnya
dengan pembelahan binner; beberapa menghasilkan spora sebagai bentuk istirahat
(endospora atau spora pada hifa). Kelompok ini umumnya tidak berfotosintesis,
melakukan kemosisntesis, heterotrof dan termasuk aerobik, anaerobik, fakultatif
anaerobik, dan spesies mikroaerofilik. Anggota divisi ini termasuk bakteri
asporogenous sederhana dan bakteri sporogenous, juga actinomycetes dan yang
berhubungan.
VIII. KESIMPULAN

Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan untuk membedakan jenis

bakteri berdasarkan sifat kimiawi dan fisik dinding sel yang berupa peptidoglikan.
Perbedaan struktur peptidoglikan pada dinding sel bakteri akan memberikan
perbedaan warna. Perbedaan ini akan mengklasifikasikan bakteri menjadi 2 kelompok
utama, yaitu kelompok bakteri Gram positif (+) dan Gram negatif (-).
Gram negative yakni Kelompok yang merupakan prokariot yang memiliki
suatu profil dinding sel (tipe Gram-negatif) kompleks yang terdiri dari satu membran
luar dan satu membran dalam, lapisan peptidoglikan yang tipis (yang mengandung
asam muramat yang terdapat pada semua peptidoglikan tapi sejumlah organisme tidak
memiliki bagian ini pada dinding selnya).
Gram Positif yakni Kelompok yang merupakan prokariot dengan profil dinding
sel tipe gram positif umumnya bereaksi terhadap pewarnaan gram, tetapi tidak selalu
positif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat menyerap warna violet pada
dinding selnya dengan lapisan peptidoglikan yang tebal.
 DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, M., Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Dialihbahasakan oleh Bagian

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Jakarta: Salemba Medika.

Hadioetomo R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. Penerbit Gramedia, Jakarta.

Barben J, Hafen G, Schmid J, Swiss (2005). Paediatric Respiratory Research Group.

Pseudomonas aeruginosa in Public Swimming Pools and Bathroom Water of Patients
with Cystic Fibrosis. J Cyst Fibros 2005; 4: 227–231.

Bilham Sachwiver, Leny Sang Surya, Dewi Elianora. 2018. Identifikasi Bakteri Pada 3
Permukaan Dental Unit (Bowl Rinse, Dental Chair, Instrument Table) di RSGM
Universitas Baiturrahman 2018. Jurnal B-Dent, Vol 5, No.1: 65 – 71.

Dwidjoseputro, D.2005.Dasar - Dasar Mikrobiologi.Malang: Penerbit Djambatan.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor : IPB

Howard, K. 1993. Virulence factors of Mutans Streptococci: Role of Molecular genetics."

Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 4(2):159-176.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 2009. Dasar Dasar Mikrobiologi. Penterjemah: R.S. Hadioetomo,
T. Imas dan S.S Tjitrosomo. Edisi 2. UI Press, Jakarta.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Penerbit Erlangga, Yogyakarta.